細(xì)胞工程第十章植物種質(zhì)資源的離體保存課件

1、 主要內(nèi)容： 第一節(jié) 植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存 第二節(jié) 植物種質(zhì)資源的低溫保存 第三節(jié) 植物種質(zhì)資源的超低溫保存 學(xué)習(xí)的目標(biāo)與要求： 了解植物種質(zhì)離體保存的類型與特點(diǎn)，及其基本操作技術(shù)。了解植物人工種子的概念與發(fā)展概況、特點(diǎn)與制備方法。 具備利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源保存的認(rèn)知，具有人工種子制備基礎(chǔ)能力。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的重要作用1、種質(zhì)資源或稱基因庫是選育新品種的最基本的原始材料。2、有人說：“人類的命運(yùn)將取決于人類理解和發(fā)覺植物種3、資源的能力。”3、選育新品種時(shí)利用的材料單位是性狀，如顏色、高矮、早熟性和抗病性等。4、選育新品種需要原始材料已有的栽培品種、半栽培

2、類型和有關(guān)野生植物。只要其具有一些能結(jié)合到栽培品種上的有用性狀，就都可以作為原始材料。植物種質(zhì)資源的離體保存 種質(zhì)(germplasm)是親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。 植物種質(zhì)資源(plant germplasm resources)即為攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物總稱，又稱遺傳資源或品種資源，包括栽培，野生及人工創(chuàng)造的各種植物的品種或品系。 種質(zhì)資源保存(germplasm conservation)是指在天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境條件下，貯存植物種質(zhì)，使其保持生命力與遺傳性的技術(shù)。植物種質(zhì)資源的離體保存 種質(zhì)資源的保存方式有兩種，即原生境保存和非原生境保存。 原生境保存：將植

3、物的遺傳材料保存在它們的自然環(huán)境中。原生境保存的地方多是植物保護(hù)區(qū)，另一種方法為農(nóng)田種植保存。 非原生境保存： 將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。 非原生境保存方式有植物園、種質(zhì)圃、 種子(質(zhì))庫、試管苗庫、超低溫庫等。具體保存方法有四種：種植保存、貯藏保存、離體保存和基因文庫保存。 種質(zhì)資源的離體保存(germplasm conservation in vitro)：是指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理措施使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。 離體保存的意義1、使一些無性繁殖作物種質(zhì)資源低溫長期保存，避免資

4、源的丟失。2、節(jié)省土地和勞力，方法簡單，花費(fèi)少并能在保存中脫毒。3、一旦利用可快速繁殖；也利于種質(zhì)交換。離體保存的方法： 常溫限制生長 低溫保存 超低溫保存一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存 1.常溫限制生長保存的概念 正常條件下由于材料生長很快，需經(jīng)常繼代，增加了工作量及費(fèi)用，不適合種質(zhì)資源保存。 通過提高滲透壓、添加生長延緩劑或抑制劑 、干燥、降低氣壓、改變光照條件等，限制培養(yǎng)物的生長，使轉(zhuǎn)移繼代的間隔時(shí)間延長達(dá)到保存種質(zhì)的方法。2、常溫保存的方法和原理 (1)高滲保存法 利用培養(yǎng)基的高滲透壓，減少離體培養(yǎng)物吸收養(yǎng)分和水分的量，減緩生理代謝過程，從而減緩生長速度，達(dá)到抑制離體培養(yǎng)材料生長的

5、種質(zhì)保存方法。 高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、PEG等, 高滲保存配合低溫效果更明顯,如：610低溫下，培養(yǎng)基中加4%甘露醇，可保存馬鈴薯1 2年，存活率最高可達(dá)90%以上。（2)生長抑制劑保存法 在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達(dá)到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。 生長延緩劑： ABA、青鮮素、CCC、多效唑、B9等 ，使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移栽成活率高。（3)抑制生長的其他保存法 低壓保存法：降低培養(yǎng)材料周圍氣壓，達(dá)到抑制生長的目的，分為低氣壓與低氧壓兩種，保存原理相似。 饑餓法：從培養(yǎng)基中減去12種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相關(guān)營養(yǎng)而處于最小生長量 干燥保存法：減少培養(yǎng)材料

6、的含水量 礦物油覆蓋法：使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長 低光照培養(yǎng)：適當(dāng)減弱光照強(qiáng)度，縮短光照時(shí)間，進(jìn)而減緩試管苗生長二、植物種質(zhì)資源的低溫保存1、低溫保存的概念 用離體培養(yǎng)的方式在非凍結(jié)程度的低溫下(一般為1-9)保存種質(zhì)的方法。 方法簡單，存活率高 2、低溫保存的方法和原理 低溫使植物生長速度就會(huì)受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長了繼代的時(shí)間間隔而達(dá)到保存種質(zhì)的目的三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1、種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況 20世紀(jì)70年，Nag和Street首先證明胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在液氮中保存后能恢復(fù)生長。 植物超低溫種質(zhì)保存(cryopreservation)是指將植物的離體材

7、料包括莖尖（芽）、分生組織、胚胎、花粉、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等，經(jīng)過一定的方法處理后在超低溫（-196液氮）條件下進(jìn)行保存的方法。 極端低溫溫度下，活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動(dòng)幾乎完全停止。因此，細(xì)胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會(huì)引起遺傳性狀的改變，也不會(huì)丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。同時(shí)，由于超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。2、種質(zhì)資源超低溫保存的原理 離體種質(zhì)在液氮中幾乎所有的細(xì)胞代謝活動(dòng)、生長都停止，因而排除了遺傳性狀的變異，同時(shí)保存了細(xì)胞的活力和形態(tài)發(fā)生潛能。 低溫冰凍過程中，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰會(huì)直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此在冰凍過程中，通過

8、避免或盡量減少其細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰而達(dá)到冰凍保存的目的。思考：超低溫冷凍保存為什么沒有把細(xì)胞凍死？ 細(xì)胞冰凍結(jié)冰保護(hù)性脫水理論 溶液的玻璃化理論（1）細(xì)胞冰凍結(jié)冰保護(hù)性脫水理論A、常溫下，細(xì)胞及其溶液處于滲透平衡的狀態(tài)，當(dāng)溫度降到冰點(diǎn)以下時(shí)，首先是細(xì)胞外溶液部分“凍結(jié)”出冰；胞外溶液的濃度升高，破壞了細(xì)胞內(nèi)外溶液的平衡，水分由胞內(nèi)通過細(xì)胞膜向外滲透，細(xì)胞收縮，細(xì)胞內(nèi)濃度提高；當(dāng)溫度不斷降低時(shí)，凍結(jié)和滲透過程不斷進(jìn)行，這種過程稱為保護(hù)性脫水。B、當(dāng)復(fù)溫時(shí)，溫度升高，凍結(jié)的冰不斷融化，水分由胞外向胞內(nèi)滲透，使收縮的細(xì)胞膨脹，可能恢復(fù)原狀。C、精確控制上述過程，能使細(xì)胞在降溫、復(fù)溫、滲透過程中不被損傷而

9、死亡。（2）溶液的玻璃化理論 溶液在降溫時(shí)，如果沒有均一晶核或晶核生長缺乏足夠的時(shí)間，就首先形成過冷溶液。繼續(xù)降溫，均一晶核形成。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶。降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長缺乏足夠的時(shí)間，溶液就進(jìn)入無定型的玻璃化狀態(tài)。它是一種透明的固態(tài)，與液態(tài)相比，分子沒有發(fā)生重排，因此與晶態(tài)不同。被稱為玻璃態(tài)，此時(shí)的溫度叫玻璃化形成溫度。在玻璃化形成過程中，既沒有溶液效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷，也沒有冰晶的形成對(duì)細(xì)胞造成的機(jī)械傷害。提高超低溫冷凍保存的措施 由于植物細(xì)胞含水量比動(dòng)物細(xì)胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料放入液氮中，組織和細(xì)胞由于細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，

10、引起組織和細(xì)胞死亡，因而，超低溫保存的植物材料必須借助于冷凍防護(hù)劑(cryoprotectant)。冷凍防護(hù)劑防護(hù)機(jī)理：A、在水溶液中能強(qiáng)烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏稠度增加。當(dāng)溫度下降時(shí)，溶液冰點(diǎn)下降，即冰的結(jié)晶中心增長速度下降，使水的固化程度減弱。因而對(duì)于降低培養(yǎng)基冰點(diǎn)和植物組織、細(xì)胞冰點(diǎn)起重要作用。B、冷凍防護(hù)劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞的輕微質(zhì)壁分離，相對(duì)提高了組織和細(xì)胞的抗寒力。常用的冷凍防護(hù)劑 滲透型冷凍防護(hù)劑: 多為小分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。包括二甲亞砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸

11、、乙二醇、丙二醇非滲透型冰凍保護(hù)劑: 是聚合分子物質(zhì)，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，從而起到保護(hù)作用。此類冰凍保護(hù)劑對(duì)快速、慢速冷卻均有保護(hù)效果。常見的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl pyrollidone, PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)羥乙基淀粉(Hydroxyethyl starch, HES)3、超低溫保存的基本程序（1）植物材料（培養(yǎng)物）的選?。?）材料的預(yù)處理（3）降溫冷凍及超低溫保存（4）解凍：分快速解凍、慢速解凍（5）再培養(yǎng)（6）超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測（1）植物材料（培養(yǎng)物）的選取

12、物種、基因型、器官、抗寒性、年齡、生理狀態(tài)等。 植物細(xì)胞培養(yǎng)物的生理狀態(tài)是決定凍后細(xì)胞成活率的重要因素。一般指數(shù)生長期和生長延滯后期的細(xì)胞抗凍力強(qiáng)，存活率高。（2）植物材料（培養(yǎng)物）的預(yù)處理 預(yù)處理對(duì)于調(diào)整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預(yù)處理的植物材料，減少了細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，使細(xì)胞能經(jīng)受低溫脅迫，減少或避免冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。 預(yù)處理包括：增加培養(yǎng)基糖濃度、提高滲透壓、減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，添加誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護(hù)劑，如0.3M1.0M蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透調(diào)節(jié)劑，5%10%DMSO等冰凍保護(hù)劑。（3）降溫冷凍及超低溫保存 傳統(tǒng)的降溫冷凍方法(快速冷凍法、慢速冷 凍法、兩步冷凍法、逐級(jí)冷凍法) 玻璃化保存法 包埋脫水法超低溫保存 包埋玻璃化法超低溫保存（4）解凍 超低溫保存效果與化凍速度有密切關(guān)系，不同的材料應(yīng)采取不同的化凍方式。 液泡小、含水量少的細(xì)胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。 液泡大、含水量多的細(xì)胞采用慢速化凍法 生長季節(jié)中的材料，一般在3740水浴中慢速化凍法比室溫下慢速化凍要好，而木本植物