藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 新冠核酸注冊(cè)審評(píng)要點(diǎn)

1、2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)北京2020年04月15日臨床前部分 本要點(diǎn)是對(duì)2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。3一、適用范圍 2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑用于對(duì)咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等樣本（資料前后要一致）中的2019新型冠狀病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測(cè)，本審評(píng)要點(diǎn)適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)的產(chǎn)品。二、性能評(píng)估 企業(yè)應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有性

2、能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。二、性能評(píng)估 1.核酸（RNA）提取/純化性能 在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測(cè)試劑的特性，對(duì)配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。二、性能評(píng)估2.最低檢測(cè)限（1）最低檢測(cè)限的確定 將含有2019新型冠狀病毒的真實(shí)臨床樣本/含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用

3、樣本一致的）適當(dāng)基質(zhì)中，用于進(jìn)行最低檢測(cè)限研究，應(yīng)采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度。 每個(gè)濃度梯度最少重復(fù)三次檢測(cè)，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計(jì)檢測(cè)限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個(gè)濃度至少重復(fù)20次檢測(cè)，將具有90%95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測(cè)限。二、性能評(píng)估 在進(jìn)行最低檢測(cè)限的確定時(shí)，應(yīng)至少包括不同來(lái)源的五個(gè)具有代表性的2019新型冠狀病毒樣本，進(jìn)行系列梯度稀釋。 著重驗(yàn)證不同靶點(diǎn)是否存在差異。 拭子、痰液、下呼吸道樣本分別進(jìn)行驗(yàn)證。二、性能評(píng)估（2）最低檢測(cè)限的驗(yàn)證 選擇不同來(lái)源的至少5個(gè)臨床病毒樣本（與最低檢測(cè)限確定不同的病毒樣本）在最低檢測(cè)限濃度水平進(jìn)

4、行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到90%95%陽(yáng)性檢出率。 應(yīng)提供詳細(xì)的病毒液滴度的確定方法及驗(yàn)證結(jié)果。（聲稱最低檢測(cè)限應(yīng)與實(shí)際情況相符） 拭子、痰液、其他下呼吸道樣本分別進(jìn)行驗(yàn)證。二、性能評(píng)估3.不同區(qū)域病毒樣本包容性的驗(yàn)證 至少驗(yàn)證包括具有時(shí)間和區(qū)域特征性的20個(gè)不同來(lái)源的病毒樣本（陽(yáng)性臨床樣本或分離培養(yǎng)物），應(yīng)包括最低檢出限、重復(fù)性等性能的驗(yàn)證，病毒樣本的滴度應(yīng)采用科學(xué)合理的方法進(jìn)行標(biāo)定。 拭子、痰液、其他下呼吸道樣本分別進(jìn)行驗(yàn)證。二、性能評(píng)估4. 分析特異性（1）交叉反應(yīng)驗(yàn)證（應(yīng)采用真實(shí)病原體進(jìn)行驗(yàn)證） 地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒；（

5、SARS 、 MERS 如使用假病毒，請(qǐng)?zhí)峁┰敿?xì)的構(gòu)建過(guò)程、序列信息）二、性能評(píng)估 H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒； 肺炎支原體、肺炎衣原體；二、性能評(píng)估 軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝

6、桿菌； 煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等。 （提供詳細(xì)的來(lái)源、鑒定方法）二、性能評(píng)估 建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來(lái)源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。 人類基因組DNA。二、性能評(píng)估（2）內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾 應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，在病毒臨界陽(yáng)性水平進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。 二、性能評(píng)估 檢測(cè)的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)（如血液、鼻腔

7、分泌物、粘液及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過(guò)敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物等）及在樣本采集和制備期間引入的物質(zhì)。 17物質(zhì)活性成分粘蛋白純化粘蛋白血液（人類）抗病毒藥物-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋 阿比多爾抗生素左氧氟沙星 阿奇霉素 頭孢曲松 美羅培南全身性抗菌藥妥布霉素過(guò)敏性癥狀緩解藥物鹽酸組胺鼻腔噴霧劑或滴鼻劑苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）鼻用皮膚類固醇倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松表1 推薦用于干擾試驗(yàn)的物質(zhì)二、性能評(píng)估二、性能評(píng)估5.精密度 企業(yè)應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)

8、標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來(lái)的所有變異因素，因此精密度評(píng)價(jià)中應(yīng)同時(shí)包含若干臨床樣本，且精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。 不同樣本類型分別進(jìn)行驗(yàn)證。二、性能評(píng)估（1）對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、地點(diǎn)、檢測(cè)輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。（2）設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測(cè)或者為期至少5天的檢測(cè)，具體方案可參考EP文件進(jìn)行。從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。二、性能評(píng)估 （3）用于精密度評(píng)價(jià)的人工模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平

9、：陰性樣品、臨界陽(yáng)性樣品、（中或強(qiáng)）陽(yáng)性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評(píng)價(jià)中的每一次檢測(cè)均應(yīng)從核酸提取開(kāi)始。二、性能評(píng)估陰性樣本：待測(cè)物濃度低于最低檢測(cè)限或?yàn)榱銤舛龋幮詸z出率應(yīng)為100%（n20）。臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)95%（n20）。中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且CV10%（n20）。二、性能評(píng)估6.提供企業(yè)參考品驗(yàn)證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。7.其他需注意問(wèn)題 對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)【適用機(jī)

10、型】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行性能評(píng)估驗(yàn)證，應(yīng)提供三批產(chǎn)品完整的性能評(píng)估資料。三、注冊(cè)檢驗(yàn) 應(yīng)提供符合產(chǎn)品技術(shù)要求的、在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行的產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告，應(yīng)提供連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)合格報(bào)告。 應(yīng)采用國(guó)家參考品進(jìn)行注冊(cè)檢測(cè)。四、陽(yáng)性判斷值確定資料 陽(yáng)性判斷值確定資料主要指對(duì)申報(bào)產(chǎn)品病毒核酸檢測(cè)的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽(yáng)性判斷值研究資料樣本來(lái)源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來(lái)源的多樣性、代表性。 如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。應(yīng)說(shuō)明所選擇陽(yáng)性判斷值研究方法的合理性，閾值設(shè)置

11、應(yīng)科學(xué)合理。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。 四、陽(yáng)性判斷值確定資料 每個(gè)靶點(diǎn)分別驗(yàn)證陽(yáng)性判斷值，證明不同基因是否存在差異。同時(shí)對(duì)于結(jié)果判定方式（如單陽(yáng)、雙陽(yáng)）進(jìn)行詳細(xì)研究。 陽(yáng)性判斷值應(yīng)采用真實(shí)臨床樣本進(jìn)行研究。（應(yīng)包括一定數(shù)量的弱陽(yáng)性樣本）五、主要原材料研究資料 此產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。 供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。 五、主要原材料研究資料 如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材

12、料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。五、主要原材料研究資料1.引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對(duì)和試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實(shí)驗(yàn)等。五、主要原材料研究資料2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。3

13、.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。五、主要原材料研究資料4.試劑盒內(nèi)質(zhì)控品 試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來(lái)實(shí)現(xiàn)，其應(yīng)參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過(guò)程。以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。 申報(bào)資料應(yīng)對(duì)試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料詳細(xì)說(shuō)明。企業(yè)應(yīng)對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。五、主要原材料研究資料（1）陰性質(zhì)控品應(yīng)不含試劑盒所檢測(cè)的靶序列。 （2）陽(yáng)性質(zhì)控品 陽(yáng)性質(zhì)控品可用12個(gè)病毒株為代表，應(yīng)含有天然的或人工

14、合成的包含試劑盒可檢測(cè)靶序列（如假病毒）。五、主要原材料研究資料 5.內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計(jì)和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)），對(duì)待側(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。五、主要原材料研究資料6.企業(yè)參考品 應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、重復(fù)性參考品。 陽(yáng)性參考品應(yīng)著重考慮不同來(lái)源的病毒樣

15、本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來(lái)源的5個(gè)病毒樣本。五、主要原材料研究資料 陰性參考品則主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。 檢測(cè)限參考品的濃度水平可采用9095%陽(yáng)性檢出水平或略高于最低檢測(cè)限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。檢測(cè)限參考品的濃度確定應(yīng)科學(xué)合理。五、主要原材料研究資料 重復(fù)性參考品建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。 申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部參考品的來(lái)源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的試驗(yàn)驗(yàn)

16、證，并提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用圖表方式表示，并說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。2.反應(yīng)原理介紹。3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料（1）研究樣本采集時(shí)間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。（2）研究對(duì)采樣拭子及樣本保存液的要求：對(duì)采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對(duì)拭子頭和拭子桿的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、濃度、使用量、功能（驗(yàn)證對(duì)核酸影響）等的要求。（在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中注明備案號(hào)等）六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料

17、，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。 建議在保證核酸提取純度的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量。六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料5.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。6.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。七、穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。 1.申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方

18、法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。七、穩(wěn)定性研究資料 2.適用樣本的穩(wěn)定性 考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入裂解液/保存液的樣本，常規(guī)病毒滅活的樣本，保存條件包括冷藏和冷凍兩種條件。如產(chǎn)品適用拭子、痰液和灌洗液等不同的樣本類型，因其中干擾物質(zhì)存在較大差異，可能對(duì)病毒RNA降解的影響不同，建議對(duì)每種樣本類型均進(jìn)行研究。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。七、穩(wěn)定性研究資料 對(duì)于此類試劑，如核酸提取液不能立即進(jìn)行檢測(cè)，則還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。八、產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)【預(yù)期用途】 如：本試劑盒用于體外定性檢測(cè)新型冠狀病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者的咽拭子、痰液樣本中，新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因。 有關(guān)“疑似病例”、“疑似聚集性病例”等人群的定義參照新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案、新型冠狀病毒感染的肺炎病例監(jiān)測(cè)方案等文件執(zhí)行。 該產(chǎn)品僅用于2019年12月以來(lái)，新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染的肺炎疫情期間