T LC生物自顯影篩選天然產(chǎn)物菊花等中的抗氧化成分

1、.：.；T LC生物自顯影挑選天然產(chǎn)物菊花等中的抗氧化成分1TLCthin layer chromatography薄層色譜，又稱薄層層析、薄板層析、薄板色譜。TLC為其簡(jiǎn)稱薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分別和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固液吸附色譜。薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱 HYPERLINK baike.baidu/view/344930.htm t _blank 薄層層析，屬于固液吸附色譜。是近年來開展起來的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法。它兼?zhèn)淞?HYPERLINK baike.baidu/view/

2、642299.htm t _blank 柱色譜和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品幾到幾微克，甚至0.01微克的分別；另一方面在制造薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，將樣品點(diǎn)成一條線，那么可分別多達(dá)500mg的樣品。因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用 HYPERLINK baike.baidu/view/25162.htm t _blank 氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，在進(jìn)展化學(xué)反響時(shí)， HYPERLINK baike.baidu/view/705349.htm t _blank 薄層色譜法還可用來跟蹤有機(jī)反響及進(jìn)展柱色譜之前的一種“預(yù)試，常利用薄層色譜察看原

3、料斑點(diǎn)的逐漸消逝來判別反響能否完成。 薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板103cm左右上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶枯燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，枯燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。薄層色譜法TLC，系將適宜的 HYPERLINK baike.baidu/view/331233.htm t _blank 固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值Rf與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖的比移值Rf作對(duì)比，用

4、以進(jìn)展藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定的方法。薄層色譜法是快速分別和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反響進(jìn)程薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分別法，它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附才干不同，使在挪動(dòng)相溶劑流過固定相吸附劑的過程中，延續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而到達(dá)各成分的相互分別的目的。 薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層 HYPERLINK baike.baidu/view/344919.htm t _blank 吸附層析(吸附劑)、薄層 HYPERLINK baike.baidu/view/641409.htm t _blank 分配層析(纖維素)、薄層

5、 HYPERLINK baike.baidu/view/63017.htm t _blank 離子交換層析(離子交換劑)、薄層 HYPERLINK baike.baidu/view/65842.htm t _blank 凝膠層析(分子篩凝膠)等。普通實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。 吸附是外表的一個(gè)重要性質(zhì)。任何兩個(gè)相都可以構(gòu)成外表，吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此外表上的密集景象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的外表上，都能夠發(fā)生吸附景象。 物質(zhì)分子之所以能在固體外表停留，這是由于固體外表的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相

6、等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對(duì)稱的，其力場(chǎng)相互抵消。而處于固體外表的分子所受的力是不對(duì)稱的，向內(nèi)的一面遭到固體內(nèi)部分子的作用力大，而外表層所受的作用力小，因此氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體外表時(shí)遭到這種剩余力的影響，就會(huì)被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一外表積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)分開此外表的分子之間可以建立 HYPERLINK baike.baidu/view/1603996.htm t _blank 動(dòng)態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過程。 例如用 HYPERL

7、INK baike.baidu/view/62656.htm t _blank 硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與 HYPERLINK baike.baidu/view/329688.htm t _blank 分配系數(shù)的不同，使混合物得以分別。當(dāng)溶劑沿著吸附劑挪動(dòng)時(shí)，帶著樣品中的各組分一同挪動(dòng)，同時(shí)發(fā)生延續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對(duì)它們的吸附才干的差別，最終將混合物分別成一系列斑點(diǎn)。如作為規(guī)范的化合物在層析薄板上一同展開，那么可以根據(jù)這些知化合物的Rf值后面引見Rf值對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)展鑒定，同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某些方法加以定量。Rf=溶

8、質(zhì)挪動(dòng)的間隔 /溶液挪動(dòng)的間隔 。表示物質(zhì)挪動(dòng)的相對(duì)間隔 。 比移值各種物質(zhì)的Rf 隨要分別化合物的構(gòu)造，濾紙或薄層板的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對(duì)每一種化合物來說是一個(gè)特定數(shù)值。儀器與資料1載版用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板，對(duì)薄層板的要求是：需求有一定的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)惰性，且厚度均勻、外表平整，因此玻璃板是最常用的。載板可以有不同規(guī)格，但最大不得超越2020，玻璃板在運(yùn)用前必需洗凈、枯燥備用。玻板除另有規(guī)定外，用5cm20cm，10cm20cm或20cm20cm的規(guī)格，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。(2) 固定相吸附劑或載體層層析硅膠薄層層

9、析硅膠最常用的有 HYPERLINK baike.baidu/view/1674103.htm t _blank 硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小，普通要求直徑為1040m。薄層涂布，普通可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系將固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中參與一定量的粘合劑，普通常用1015煅石膏(CaSO4.2H2O在140烘4小時(shí))，混勻后加水適量運(yùn)用，或用 HYPERLINK baike.baidu/view/789521.htm t _blank 羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5

10、0.7)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。3 涂布器應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層(4) 點(diǎn)樣器 定性：內(nèi)徑為0.5mm管口平整的普通毛細(xì)管。 定量：微量注射劑。(5) 展開室 應(yīng)運(yùn)用適宜載板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密的蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于察看。操作薄層板制備除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除外表的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地挪動(dòng)涂布器進(jìn)展涂布厚度為0.20.3mm，取下涂好薄層的玻板，置程度臺(tái)上于室溫下晾干，后在110烘30分鐘，即置有枯燥劑的枯燥箱中備用。運(yùn)用前

11、檢查其均勻度可經(jīng)過透射光和反射光檢視。 手工制板普通分不含粘合劑的軟板和含粘合劑的硬板倆種。 常用吸附劑的根本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分別效果不好，太細(xì)溶液流速太慢。普通說來吸附性強(qiáng)的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁普通在100-150目。氧化鋁分為堿性氧化鋁，適用于碳?xì)浠衔?、生物堿及堿性化合物的分別，普通適用于PH為9-10的環(huán)境。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質(zhì)的分別。酸性氧化鋁適用于PH44.5的酸性有機(jī)酸類的分別。氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個(gè)級(jí)，一級(jí)活性最高，五級(jí)最低。 黏合劑及添加劑：為了使固定相吸附劑結(jié)實(shí)地附著在載板上以添加薄層的機(jī)械強(qiáng)度，有

12、利于操作，需求時(shí)在吸附劑中參與適宜的黏合劑：有時(shí)為了特殊的分別或檢出需求，要在固定相中參與某些添加劑。 薄層板的活化：硅膠板于105-11烘30分鐘，氧化鋁板于150-160烘4小時(shí)，可得活性的薄層板。點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，普通為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑及點(diǎn)間間隔 同紙 HYPERLINK baike.baidu/view/933.htm t _blank 色譜法,點(diǎn)間間隔 可視斑點(diǎn)分散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必需留意勿損傷薄層外表。 點(diǎn)樣直徑不超越5mm，點(diǎn)樣間隔 普通為11.5cm即可。 樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將呈空心環(huán)環(huán)形色譜效應(yīng)。因此配制

13、樣品溶液時(shí)應(yīng)選擇對(duì)組分溶解度相對(duì)較小的溶劑。 點(diǎn)樣方式有點(diǎn)狀點(diǎn)樣和帶狀點(diǎn)樣。展開 HYPERLINK baike.baidu/albums/705349/705349.html l 0$109eb7ec03fcef1d63d09f0f o 查看圖片 t _blank 薄層展開展開劑也稱溶劑系統(tǒng)，流動(dòng)性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動(dòng)相的液體。展開劑的主要義務(wù)是溶解被分別的物質(zhì)，在吸附劑薄層上轉(zhuǎn)移被分別物質(zhì)，使個(gè)組分的Rf值在0.20.8之間并對(duì)被分別物質(zhì)要有適當(dāng)?shù)?HYPERLINK baike.baidu/view/425404.htm t _blank 選擇性。作為展開劑的溶劑應(yīng)滿足以下要

14、求：適當(dāng)?shù)募兌?、適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、低黏度 、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓一級(jí)盡能夠低的毒性。 展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環(huán)形及向心3種幾何方式。 A 單次展開 用同一種展開劑一個(gè)方向展開一次，這種方式在平面色譜中運(yùn)用最為廣泛。垂直上行展開，垂直下行展開，一向程度展開，對(duì)向程度展開 B 多次展開 單向?qū)Υ苏归_，用一樣的展開劑沿同一方向進(jìn)展一樣間隔 的反復(fù)展開，直至分別稱心，廣泛運(yùn)用于薄層色譜法 C 雙向展開 用于成分較多、性質(zhì)比較接近的難分別組分的分別。 薄層展開展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中參與足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂

15、的蓋，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。 將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.51.0cm切勿將樣點(diǎn)浸入展開劑中，密封室蓋，待展開至規(guī)定間隔 (普通為1015cm)，取出薄層板，晾干，按各種類項(xiàng)下的規(guī)定檢測(cè)。 影響展開的要素 HYPERLINK baike.baidu/albums/705349/705349.html l 0$9c57e3fa40bf7fe4b58f310e o 查看圖片 t _blank 制備離心色譜儀A 相對(duì)濕度的影響 B 溶劑蒸汽的影響a 展開室的飽和 b預(yù)吸附 C 溫度的影響 D 展距的影響 與分別度僅正比與展距的平方根。顯色A 光學(xué)檢

16、出法 a 自然光400800nm b 紫外光254nm或365nm c 熒光 一些化合物吸收了較短波長(zhǎng)的光，在瞬間發(fā)射出對(duì)比射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的熒光斑點(diǎn) HYPERLINK baike.baidu/view/495141.htm t _blank 靈敏度高、專屬性高 B 蒸汽顯色法 HYPERLINK baike.baidu/albums/705349/705349.html l 0$a0ca99d65291121506088b0e o 查看圖片 t _blank 顯色多數(shù)有機(jī)化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點(diǎn)，這種反響有可逆及不可逆兩種情況，前者在分開碘蒸氣

17、后，黃褐色斑點(diǎn)逐漸衰退，并且不會(huì)改動(dòng)化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時(shí)常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫加強(qiáng)了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出劇烈而穩(wěn)定的熒光，對(duì)定性及定量都非常有利，但是制備薄層時(shí)要留意被分別的化合物能否改動(dòng)了原來的性質(zhì)。 C 物理顯色法 用紫外照射分別后的紙或薄層后，使化合物產(chǎn)生光加成，光分解、光氧化復(fù)原及光異構(gòu)等光化學(xué)反響，導(dǎo)致物質(zhì)構(gòu)造發(fā)生某些變化，如構(gòu)成熒光發(fā)射功能團(tuán)。發(fā)生熒光加強(qiáng)或淬滅及熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生挪動(dòng)等景象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。 D 試劑顯色法 廣泛運(yùn)用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑普通都適用于薄層色譜，還有防腐劑的顯色

18、劑不適宜用于紙色譜及含有有機(jī)黏合劑薄層的顯色，又時(shí)噴顯色劑后續(xù)加熱，這也不是用于紙色譜。 顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的方式均勻的噴灑在紙和薄層。 b 浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設(shè)定浸板及抽出速度和規(guī)定在顯色劑中浸漬的時(shí)間。 顯色試劑 a 通用顯色劑 硫酸溶液硫酸：水 1：1，硫酸：乙醇1：1、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、堿性高錳酸鉀溶液復(fù)原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點(diǎn) b 專屬顯色劑 (5)測(cè)定比移值 在一定的色譜條件下，特定化合物的Rf值是一個(gè)常數(shù)，因此有能夠根據(jù)化合物的Rf值鑒定化合物。 (6) 薄層掃描 薄層掃描法

19、指用一定波長(zhǎng)的光照射在經(jīng)薄層層析后的層析板上，對(duì)具有吸收或能產(chǎn)生熒光的層析斑點(diǎn)進(jìn)展掃描，用反射法或透射法測(cè)定吸收的強(qiáng)度，以檢測(cè) HYPERLINK baike.baidu/view/3853276.htm t _blank 層析譜。對(duì)于中成藥復(fù)方制劑，亦可用相應(yīng)的原藥材按需求組協(xié)作陰、陽對(duì)照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。運(yùn)用儀器為薄層掃描儀。 如需用薄層掃描儀對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描檢出，或直接在薄層上對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描定量，那么可用薄層掃描法。 薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的構(gòu)造特點(diǎn)及運(yùn)用闡明，結(jié)合詳細(xì)情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長(zhǎng)或單波長(zhǎng)掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的要素

20、很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點(diǎn)在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對(duì)照品在同一塊薄層上展開后掃描，進(jìn)展比較并計(jì)算定量，以減少誤差。各種供試品，只需得到分別度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才干獲得稱心的結(jié)果。運(yùn)用食品和營(yíng)養(yǎng)食品中的營(yíng)養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、油和脂肪、維生素、食用色素等。與食品和營(yíng)養(yǎng)有害的物質(zhì)那么有殘留農(nóng)藥、致癌的曲黃霉素等。這些成分都可用薄層色譜法定性和定量。蛋白質(zhì)和多肽水解為氨基酸，對(duì)不同來源的動(dòng)物性和植物性蛋白水解后產(chǎn)生不同的氨基酸進(jìn)展定性和定量，有助于處理蛋白質(zhì)的構(gòu)造和食品營(yíng)養(yǎng)問題。二十多種氨基酸用硅膠G薄層板雙向展開，一次即能分開，然后定性和定量，方法快速而簡(jiǎn)便。多糖和

21、寡糖可水解為單糖，可用薄層色譜法進(jìn)展單糖和雙糖的定性和定量。文獻(xiàn)上有每一個(gè)糖的Rf值和相應(yīng)的展開劑。油和脂肪解為脂肪酸，脂肪酸的種類和構(gòu)造中的不飽和鍵數(shù)，與營(yíng)養(yǎng)和衛(wèi)生有關(guān)，關(guān)于油和脂肪的薄層硅膠、硅藻土、纖維素)分析，文獻(xiàn)和綜述很多。脂溶性和 HYPERLINK baike.baidu/view/82071.htm t _blank 水溶性維生素在薄層上可方便地定性和定量，例如 HYPERLINK baike.baidu/view/82074.htm t _blank 脂溶性維生素A，D，E，K及B2，B6，B12，酶酸，泛酸，葉酸，C，促生素在硅膠G薄層上可用苯：甲醇：丙酮：冰醋酸7:2:0.5:0.5分開。用硅膠G薄層和丙酮：氯仿1:1以及激發(fā)波長(zhǎng)365nm和波長(zhǎng)450nm，可用熒光法測(cè)定ng量的曲黃素B1,B2,G1,G2,法靈敏快速。 藥物和藥物代謝薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的運(yùn)用很廣。有些文獻(xiàn)和內(nèi)容偏重于合成藥物、化合物及其代謝產(chǎn)物，有文獻(xiàn)為在中草藥分析中的運(yùn)用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯駢噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物堿、強(qiáng)心甙、黃酮、揮發(fā)油和萜等，都包括幾種或十幾種 HYPERLINK baike.baidu/view/2295205.htm t _blank 化學(xué)構(gòu)造和性質(zhì)非常類似的化合物，可以在上述文獻(xiàn)中找