經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)結(jié)合單精子卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射技術(shù)治療梗阻性無(wú)精子癥

1、經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)結(jié)合單精子卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射技術(shù)治療梗阻性無(wú)精子癥 作者：羅亞寧，張順，李麗，周婷，黃劍磊，王曉紅 【摘要】 目的： 探討經(jīng)皮附睪穿刺取精子術(shù)（PESA）結(jié)合單精子卵細(xì)胞漿內(nèi)顯微注射技術(shù)（ICSI）治療梗阻性無(wú)精子癥的臨床效果. 方法： 根據(jù)精子來(lái)源和精液質(zhì)量參數(shù)分為3組.梗阻性無(wú)精子癥患者44個(gè)周期采用PESA獲得精子，女方進(jìn)行常規(guī)促排卵并獲得成熟卵細(xì)胞后，用ICSI技術(shù)進(jìn)行受精(A組)；同期嚴(yán)重少弱畸精癥患者75個(gè)周期(B組); 少弱精癥患者45個(gè)周期(C組). 比較3組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率. 結(jié)果： 3組比較5項(xiàng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2、結(jié)論： 附睪穿刺取到的精子和體外排出的精子具有相同的受精和獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的能力，采用PESA結(jié)合ICSI技術(shù)是治療梗阻性無(wú)精子癥的安全有效方法. 【關(guān)鍵詞】 經(jīng)皮附睪穿刺吸取精術(shù)；精子注射,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；少精子癥；不育,男(雄)性 0引言 梗阻性無(wú)精子癥占男性不育的5%15%，是男科領(lǐng)域的一個(gè)難題. 以前這類患者缺乏有效的治療手段. 直到近十余年來(lái)ICSI技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，才使梗阻性無(wú)精子癥患者有機(jī)會(huì)生育自己的后代. 對(duì)于嚴(yán)重男性因素的不育患者，通過(guò)ICSI (intracytoplasmic sperm injection)技術(shù)獲得后代的機(jī)會(huì)，要遠(yuǎn)大于除供精人工受精以外的其他治療措施1. 我們采用

3、PESA(percutaneous epididymal sperm aspiration)取精方法結(jié)合ICSI技術(shù)治療梗阻性無(wú)精子癥，取得了很好的療效. 1對(duì)象和方法 1.1對(duì)象200405/200707在我中心接受ICSI技術(shù)助孕治療的164個(gè)周期，根據(jù)精子來(lái)源和精液質(zhì)量參數(shù)分為3組： 男方采用經(jīng)皮附睪穿刺吸取少量精子的無(wú)精子癥患者44個(gè)周期作為A組（PESA組），同期嚴(yán)重少弱畸精癥患者75個(gè)周期作為B組，輕度少弱畸精癥患者45個(gè)周期作為C組. 入選PESA組的患者符合如下條件： 至少2次射出精液經(jīng)離心后未見(jiàn)精子； 雙側(cè)睪丸總體積30 mL； 血清FSH值在正常范圍； 睪丸活檢結(jié)果提示曲細(xì)

4、精管內(nèi)可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞及成熟精子； 染色體核型分析及Y染色體微缺失篩查結(jié)果均正常.3組的女方均為原發(fā)性不孕癥，輔助生殖前相關(guān)檢查未見(jiàn)異常. 1.2方法 1.2.1促超排卵及卵母細(xì)胞收集及處理按文獻(xiàn)2的方法進(jìn)行. 1.2.2精子獲取和精液處理PESA組常規(guī)消毒外生殖器，20 g/L鹽酸利多卡因封閉精索及局部麻醉陰囊皮膚，將附睪固定于陰囊皮下，用1 mL注射器接16 G套管針并吸取0.2 mL精子處理液，經(jīng)皮刺進(jìn)附睪頭部，持續(xù)低負(fù)壓抽吸附睪液，直至取得略渾濁的附睪液為止. 將吸出的液體滴入培養(yǎng)皿并在顯微鏡下觀察. 見(jiàn)活動(dòng)精子后停止取精，將收集到的精子經(jīng)微Isolate梯度法處理或直接洗滌后備用.冷

5、凍保存時(shí)將取到的附睪液和等量的冷凍保護(hù)劑充分混勻，將混合液分裝入凍存管中. 程序冷凍后置于液氮罐保存.解凍時(shí)先置于37水浴，完全解凍后再行精液處理. B組和C組手淫取精，采用上游法或Isolate梯度法處理精液. 1.2.3顯微操作顯微操作在NIKON TE300配Hoffman調(diào)制反差光學(xué)系統(tǒng)、Eppendorff顯微操作系統(tǒng)下放大200倍條件下進(jìn)行. 選擇活動(dòng)力強(qiáng)、形態(tài)正常的精子用注射針按壓精子尾部直至其失去活動(dòng)力，將1條制動(dòng)后的精子吸入注射針. 選擇M期卵母細(xì)胞用固定針固定在第一極體位于12點(diǎn)鐘或6點(diǎn)鐘位置上，將吸入制動(dòng)精子的注射針從卵母細(xì)胞3點(diǎn)鐘方向刺入，回吸少量卵漿，卵膜破裂后，將精

6、子注入卵漿內(nèi). 1.2.4胚胎培養(yǎng)及胚胎移植注射后1620 h在倒置顯微鏡下觀察受精情況. 有雌、雄原核和第一、第二極體者為正常受精的合子，正常受精的合子繼續(xù)置于37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng). 取卵后4872 h，選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良的23個(gè)胚胎移植入子宮腔. 其余符合冷凍條件的胚胎冷凍保存. 1.2.5黃體支持和監(jiān)測(cè)胚胎移植后，用HCG或黃體酮維持黃體功能，于移植后15 d查尿或血HCG，若陽(yáng)性則于停經(jīng)7 wk行B超檢查，見(jiàn)孕囊及原始心管搏動(dòng)診斷為臨床妊娠，繼續(xù)隨訪至妊娠結(jié)束. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，行方差分析和2檢驗(yàn). 2結(jié)果 2.1患者一般情況共治療16

7、4個(gè)周期，取到1835個(gè)卵子，平均每周期取卵數(shù)為11.2個(gè). 在PESA組37個(gè)周期患者采用附睪穿刺吸取的新鮮精子，7個(gè)周期采用經(jīng)凍融的附睪精子；嚴(yán)重少弱畸精癥患者和輕度少弱畸精癥患者均采用手淫取到的新鮮精子. 3組患者在女方年齡、不孕時(shí)間、促超排卵（COH）天數(shù)、Gn用量、注射hCG日E2值、注射hCG日子宮內(nèi)膜厚度、平均M卵數(shù)、平均受精數(shù)、平均胚胎數(shù)、平均優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、平均移植胚胎數(shù)等方面比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05). 在平均取卵數(shù)上PESA組和其他兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05). 表2臨床結(jié)局比較3討論 1992年世界首例ICSI“試管嬰兒”誕生，自此徹底改變了男性不育癥的治療策略

8、，成為治療多種男性不育癥的主要手段，是男性不育治療新的里程碑3. ICSI技術(shù)使精卵細(xì)胞無(wú)需經(jīng)歷復(fù)雜的受精過(guò)程，直接將精子注入卵細(xì)胞內(nèi)，形成受精胚胎. 該技術(shù)對(duì)精子數(shù)量、活力、受精能力的要求極低，是治療包括梗阻性無(wú)精子癥在內(nèi)的男性因素所致配子傳遞障礙的有效手段. 此外，對(duì)于部分非梗阻性無(wú)精子癥患者，可以先通過(guò)MESA或TESE手術(shù)獲得精子；部分重度畸形精子癥的患者，可以在顯微鏡下選擇形態(tài)活力正常的精子，最后通過(guò)ICSI技術(shù)達(dá)到受精的目的. 不同來(lái)源和參數(shù)的精子對(duì)ICSI結(jié)局是否產(chǎn)生影響目前尚無(wú)定論. 多數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道4-5顯示，只要有活的精子，ICSI技術(shù)就可以克服與受精失敗相關(guān)的精子形態(tài)的、活

9、動(dòng)力的和其他方面的缺陷，使自然情況下不能穿過(guò)透明帶的、活動(dòng)力差的精子獲得受精、卵裂及妊娠6. 我們的研究結(jié)果顯示： 附睪精子與輕度少弱畸精和嚴(yán)重少弱精子相比，3組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 精子在睪丸中產(chǎn)生，在附睪中貯存并進(jìn)一步成熟，獲得運(yùn)動(dòng)能力、識(shí)別卵子透明帶的能力以及與卵子結(jié)合的能力. 在某些先天性或者獲得性因素作用下，引起精道梗阻，導(dǎo)致男性配子傳遞障礙，即梗阻性無(wú)精子癥. 通過(guò)PESA技術(shù)可以獲得成熟的精子，是解決梗阻性無(wú)精子癥患者精子來(lái)源問(wèn)題的重要方法. 我中心采用18 G套管針穿刺附睪，針尖所在位置手指可觸及，穿刺位置及深度明確可靠，刺破的附睪小管數(shù)

10、量較多，獲取的精子數(shù)量相對(duì)較多，避免了反復(fù)穿刺所造成的過(guò)度損傷，操作時(shí)間短，患者痛苦小，可以獲得足量高質(zhì)量的精子. 另外，由于PESA有一定的創(chuàng)傷性，并且再次穿刺有失敗的可能性，所以我們?cè)谛蠭CSI操作之前，常規(guī)進(jìn)行診斷性附睪穿刺取精子術(shù)，在事先明確患者有精子并予以冷凍保存的情況下，才安排女方進(jìn)入促排卵周期，從而最大程度上降低了再次附睪穿刺失敗的風(fēng)險(xiǎn). ICSI在臨床上的成功應(yīng)用為男性不育的治療提供了一種有效手段. 但同時(shí)我們必須認(rèn)識(shí)到，大約10%13%的無(wú)精子癥是由于染色體或基因的異常引起的7. ICSI技術(shù)在使這些患者實(shí)現(xiàn)當(dāng)父親的愿望的同時(shí)，也增加了將異常的遺傳信息傳遞給子代的風(fēng)險(xiǎn). 因而

11、在行ICSI助孕治療之前對(duì)男性患者進(jìn)行遺傳學(xué)篩查和咨詢是十分必要的. 我們對(duì)PESA組患者在行ICSI之前均進(jìn)行了染色體核型分析以及Y染色體微缺失篩查，結(jié)果無(wú)異常發(fā)現(xiàn). 總之，我們的研究結(jié)果表明，采用PESA結(jié)合ICSI技術(shù)可以有效地幫助梗阻性無(wú)精子癥獲得臨床妊娠. 但就其遠(yuǎn)期影響，特別是對(duì)通過(guò)此方式出生的個(gè)體的遠(yuǎn)期影響，仍需足夠長(zhǎng)的時(shí)間和足夠多的樣本數(shù)予以說(shuō)明.【參考文獻(xiàn)】 1 ESHRE Capri Workshop Group. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in 2006: Evidence and EvolutionJ. Hum Re

12、prod Update, 2007, 13(6):515-526.2 王曉紅，羅亞寧，姚元慶. 卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)的臨床應(yīng)用J. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 33(11): 977.3 Palermo G, Joris H, Devroey P, et al. Pregnancy after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyteJ. Lancet, 1992, 340(8810):17-18.4 李滿，莊廣倫，李蓉，等. 用射出精子、附睪精子、睪丸精子顯徽授精治療男性不育J. 中華外科雜

13、志, 2000, 38(4): 280-282.5 Sukcharoen N, Sithipravej T, Promviengchai S, et al. Comparison of the fertilization rate after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) using ejaculated sperms, epididymal sperms and testicular spermsJ. J Med Assoc Thai, 1998, 81(8):565-571.6 Nagy ZP, Liu J, Joris H, et al. The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the