生物芯片分類以及應用

1、關于生物芯片分類及應用第一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2（一）、 兩 個 概 念生物芯片 主要指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質、核酸以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。基因芯片 技術是通過微陣列技術, 將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。第二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3微陣列芯片（Microarray）微型實驗室芯片(Lab-on-a-chip)液體芯片(

2、Liquichip)（二）、生物芯片分類及應用第三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4Lab-on-a-chip 微型實驗室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟樣品準備/生化反應/結果檢測整合在一張芯片上。第四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5第五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月6第六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月7Liquichip Bead , Capture molecule , Analyte , Reporter molecule是構成liquichip 的4個主要部分。Bead上帶有兩種熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例可以 將

3、bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。Capture molecule : 作用相當于探針，能特異性的與被檢測物結合。Analyte: 樣品中被檢測的成分。Reporter molecule: 帶有熒光的報告分子，能特異性的與被檢測物結合。第七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月8Liquichip反應的一般步驟： 1.先將capture molecule 結合在bead 上， 2.將這種標記了的bead與樣品反應。Capture molecule 可以與相應的 analyte 特異性的結合， 3.此時再加入熒光標記的，特異結合analyte的reporter molecule。

4、 4.檢測：用liquichip workstation 進行檢測。原理是同時對bead和reporter molecule 上的熒光進行檢測。從而確定被結合的analyte的種類和數(shù)量。 第八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月9Liquichip技術特點描述1基于bead的這種固相反應技術，具有 靈敏度高、信號強度高、靈活性好、所需樣品量少的特點。2與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應速度更快，靈活性更好。3由于檢測方法的特點，在大部分的實驗過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應的動態(tài)平衡。4有配套的蛋白表達和純化體系。（his-tag） 第九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2

5、022年6月10Lquichip應 用 領 域：蛋白質定量蛋白質功能研究蛋白表達譜分析。蛋白質與蛋白質、蛋白質與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質核酸相互作用分析分析。 第十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月11微陣列芯片蛋白芯片基因芯片 第十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月12蛋白芯片(Protein Chips)高通量微陣列蛋白分析方法 利用抗體抗原結合原理，采用化學發(fā)光或熒光檢測 標記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。第十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月13蛋白芯片應用免疫學分析 蛋白與蛋白之間相互作用 DNA與蛋白質分子相互作

6、用第十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月14基因芯片基因芯片是通過微陣列技術, 將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。微陣列技術巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎的基因水平的表達監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達調(diào)控有更深入的了解。第十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月15基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacr

7、oarrayMicroarray第十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月16基因芯片 按內(nèi)涵劃分： cDNA芯片 Oligo芯片:25mer(affymetrix), 70mer(Operon)， 80mer（Clontech）, 按功能劃分： 基因組芯片： 檢測某一基因是否存在，若 存在，拷貝數(shù)是多少。探針是DNA. 表達譜芯片：確定基因表達的途徑與表達產(chǎn) 物。探針是RNA或cDNA 測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲 得探針的序列結果。第十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月17基因芯片應用基因表達檢測多態(tài)性分析遺傳圖譜定位基因分型通過雜交反應測定序列第十七張，PPT共

8、七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月18基因芯片應用領域遺傳疾病研究癌癥家系遺傳疾病普通基因突變疾病感染性疾病藥物篩選動物植物遺傳篩選育種 個人基因身份證環(huán)境監(jiān)測第十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月19（三）、生物芯片應用優(yōu)勢高通量平行分析樣品自動化程度高省時省力所需樣品試劑少保護環(huán)境成本低第十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月20生物芯片應用優(yōu)勢生物信息數(shù)據(jù)累積為生物信息公共數(shù)據(jù)庫添加更多數(shù)據(jù)有利于研究基因序列與生物表型之間的關系有助于理解疾病發(fā)生的機制第二十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月21二、生物芯片制作技術介紹第二十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6

9、月22生物芯片制作方法分類第二十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月23 原位合成 (In Situ Synthesis)化學合成原子印章原位光刻合成第二十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月24原位光刻合成 美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術，是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關鍵技術。第二十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月25 原位光刻合成原理Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linke

10、r molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary D

11、NA probes to be constructed at each site.第二十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月26預先合成后點樣(off-chip synthesis)接觸式點樣非接觸式點樣第二十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月27基因芯片點樣的方式接觸式點樣-適合于DNA芯片的制作 即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上第二十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月28接觸式點樣Best!第二十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月29ArrayIt ChipMaker Pins帶有細槽的不銹鋼針尖載樣能力: 200 to

12、600 nL點樣體積: 250 pL to 2.5 nL (pin size)點樣直徑: 100 m to 500 m (pin size)Dipping of pin for sample pickupTouching of slide with pin to leave spot Control print volume with pin size第二十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月30Stealth and Chipmaker Pin (TeleChem)第三十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月31Chipmaker 點樣技術第三十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于20

13、22年6月32Stealth Pins第三十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月33CatalogNumberSpot Diameter(m)Uptake volume (l)Delivery Volume(nl)Minimum spot spacing (m )Maximum subgrid per pin (spots)Density (spots/cm2)Maximum numberOf spots (18mm72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-

14、1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,400第三十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月34TeleChem公司點樣針技術不斷發(fā)展的專利針技術共有30種針供選擇與斯坦福大學共同發(fā)展專利 pin, 帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高單

15、次帶樣可連續(xù)點樣達200-1500次特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液實際點樣直徑75-250um,可根據(jù)不同樣品選擇相應pin相當容易更換pin和pin head以適應不同需要第三十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月35基因芯片點樣的方式非接觸式點樣-適合于蛋白芯片的制作 它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面第三十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月36非接觸式噴點技術ThermalSolenoid螺線管PiezoelectricDP第三十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月37Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結合起來精確控制滴液 P

16、iezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側壁，噴管出現(xiàn)收縮壓迫液體從噴嘴噴出。 DP第三十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月38非接觸式點樣：synQUAD Technology第三十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月39Aspirate and Print for Making Arrays第三十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月40Characteristics of synQUAD TechnologyWide dispense rangeLow nanoliter t

17、o high microliterExcellent linearityPrecise and accurateCVs typically less than 10%Precision less than 5%Non-contact dispense mechanismEasier mechanical alignment (384, 1536,)“On-the-fly” printing possibleCapable of dispensing onto membranes or slidesMultiple liquid handling modesAspirate/DispenseCo

18、ntinuous Reagent Dispensing第四十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月41synQUAD vs Piezoelectric PrintingsynQUAD / nQUAD Patented by Cartesian Uses commercially available components Robust and reliable delivery mechanism Low nanoliter to low microliter dispense volume maximum density: 200 to 400 spots/cm2 Piezoelectri

19、c Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubbles Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm2第四十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月42三、生物芯片檢測系統(tǒng)CCD掃描儀 非共聚焦激光掃描儀激光共聚焦掃描儀第四十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月43數(shù)值孔徑與采光效率NA 0.3 NA 0.8NA = sin(), where is the angle of the cone第四十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月44

20、激光共聚焦（聚焦）The fluorescence source is at the objective lens focusLight goes through the pinhole to the detector第四十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月45激光共聚焦（非聚焦）Fluorescence source below focus (e.g. out of focus)Out of focus light is mostly blocked at the pinhole第四十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月46Confocal Artifact Rejecti

21、onNo Pinhole With PinholeDust artifacts reduced by at least a factor of 10第四十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月47CCD Camera SystemsAdvantages: Few moving partsFast scanning of bright samplesDisadvantages: NA limited to about 0.40: Less appropriate for dim samplesOptical scatter can limit performanceNeed to “sti

22、tch” together large imagesConfocal Laser ScannersAdvantagesSmall depth of focus reduces artifactshigh light collection efficiency. PMT detectors have the highest sensitivity in the visible range第四十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月48DNAscope LM+ 激光共聚焦芯片掃描儀第四十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月49xxyzxMACROscopeFilters第四十九張，P

23、PT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月50How the Scan System Works F-theta Telecentric Scan SystemSampleScanning MirrorLaser Scan LensBAC第五十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月51How to scan a whole sampleHome SensorScanning MirrorSampleLaser Scan Lens第五十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月52DNAscope LM+ 優(yōu)點 共聚焦面積寬 : 20mm70mm可以掃描多種介質 (Images both Gla

24、ss Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes)背景噪聲低，信噪比高全自動成像，分析結果 Small footprint (W20cm x L30cm x H20cm)第五十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月53Imaging Arrays Both Dry & WetDryPBSbufferCy3 Cy5Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats第五十三張，P

25、PT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月54Tube 1Tube 2Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes 第五十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月55四、生物芯片技術思路的比較第五十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月56Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:Probe and target DNA/RNA (Complexity)Chip surface (autofluorescence & no

26、n-spec. bkg)Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.)Hybridization efficiency (lots of factors)Detection technology (signal type, efficiency, noise) Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 20n or 80 n 50,000 nsequencingexpressionexpressiongenomic analysis第五十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月57cDN

27、A芯片的缺點由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結果的準確性也受到影響。有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。PCR產(chǎn)物是結合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性抑制，影響探針和模板的結合能力和穩(wěn)定性，進一步影響cDNA芯片的分辨能力和結果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產(chǎn)物濃度不均一也可能導致錯誤的結論。 第

28、五十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月58寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點 探針序列經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；減少二級結構 及其對雜交結果的影響雜交溫度均一，提高雜交效率；合成產(chǎn)物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點樣量差異 ；可以設計檢測不同剪切方式的基因；無需擴增，防止擴增失敗影響實驗 。第五十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月59預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本cDNA芯片方法/步驟 試劑/儀器（萬） 人員（人） 耗時（月） 構建或購買基因文庫 1-31-2 3-6 PCR引物設計與合成55-65萬 （2000個片段）1 3PCR產(chǎn)物純化及定

29、量1.2/20 （2000個片段1 2點樣 點樣儀60萬 1 3天 雜交 0.3萬試劑 1 2掃描 掃描儀60萬 1 1-2合計 197.5 209.56-7 11-15 第五十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月60預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）寡聚核苷酸的篩選及合成 (2000個基因)200（每個基因用1個70堿基的寡核苷酸片段代替，合成1個堿基14元人民幣計）。1(寡核苷酸片段的篩選，還需專業(yè)的軟件)3-4個月，如購置DNA合成儀，成本？，但時間較長點樣 點樣儀60萬 1 1個月 雜交 0.3萬試劑 1 2個月 掃描

30、 掃描儀60萬1 1-2個月 總計320.3萬47-9第六十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月61預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本應用Operon探針寡聚核苷酸芯片方法/步驟 試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）探針100點樣 60（點樣儀）1 1 雜交 0.3（試劑） 1 2掃描 60（掃描儀）1 1-2總計220.334-5第六十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月62Affymetrix技術平臺綜合成本芯片萬雜交小時洗滌小時掃描分鐘合計220萬小時第六十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月63總結采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實力雄厚的科研實驗

31、室，可以在最短的時間內(nèi)盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實驗結果，并可在國際權威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關研究領域在國際領域占領一席之地。 第六十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月64總結采用合成后點樣的生物芯片平臺比較適合于目標定位于研發(fā)、生產(chǎn)的實驗室及生物公司。雖然購買芯片點樣掃描系統(tǒng)的經(jīng)費看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費用要低，研發(fā)的方向可以結合實驗室的研究特點，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的芯片為材料進行的研究一般為驗證性工作，且因為材料的可靠性低，很難在國際權威雜志上獲得

32、認可。目前開發(fā)生產(chǎn)的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產(chǎn)品。第六十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月65五、生物芯片制作所需耗材第六十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月66 Microarraying Accessories（芯片配件）Pins and PrintheadsOmniGrid Slides and ReagentsOmniGrid Epoxy(環(huán)氧基修飾)OmniGrid Amine(氨基修飾)OmniGrid Aldehyde(醛基修飾)Complete line of associated reagentsHybridization ChambersHybChamberHybChamber Mica第六十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月67Sli