臨床免疫學與檢驗：第五章 凝集反應(yīng)

1、第五章 凝集反應(yīng)顆粒性抗原(如細菌和紅細胞等)或表面覆蓋了抗原（或抗體）的顆粒狀物質(zhì)（如醛化紅細胞、聚苯乙烯膠乳顆粒等）與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合后，可出現(xiàn)肉眼可見的凝集（agglutination）現(xiàn)象,即凝集反應(yīng)。早在1896年，Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效地診斷傷寒病。1900年 Landsteriner 在特異性血凝現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了人類ABO血型，并于1930年獲得了諾貝爾獎金。第一節(jié) 凝集反應(yīng)的特點定義 細菌或紅細胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，可出現(xiàn)肉眼可見的凝集（agglutination)現(xiàn)象。階段性 1.抗原抗體的特異性結(jié)合 2.出現(xiàn)可見的顆

2、粒凝集應(yīng)用 該試驗是一種定性的檢測方法，根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果的陰性或陽性；也可以半定量檢測，即將標本作一系列的倍比稀釋后進行試驗，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高的稀釋度作為滴度。特點 該方法簡便、敏感度高，應(yīng)用廣泛。凝集反應(yīng)的類型直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)自身紅細胞凝集試驗抗球蛋白試驗玻片法正向間接凝集反應(yīng)直接法直接法試管法反向間接凝集反應(yīng)間接法間接凝集抑制反應(yīng)協(xié)同凝集反應(yīng)第二節(jié) 直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)（Direct agglutination） 細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原，在適當?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。凝集素(agglutinogen)：凝集反應(yīng)中的抗體凝集原(ag

3、glutinin)：凝集反應(yīng)中的抗原方法：1.玻片凝集試驗: 如:菌種的診斷或分型 2.試管凝集試驗：如：Widal test Weil-felix test第三節(jié) 間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination）或被動凝集反應(yīng)（passive agglutination）。一、載體的種類及處理方法常用載體有：紅細胞（O型人紅細胞，綿羊紅細胞）、聚苯乙烯膠乳顆粒、明膠顆粒、離子交換樹脂、活性炭、火棉膠等。處理方法：顆粒表面的處理（醛化

4、、鞣化、化學處理）二、間接凝集反應(yīng)的類型： 1.（正向間接凝集反應(yīng)） 2. 反向間接凝集反應(yīng) 3. 間接凝集抑制反應(yīng) 4. 協(xié)同凝集反應(yīng) 1（正向）間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體以檢測標本中的相應(yīng)抗體（圖15-1）。2反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應(yīng)抗原（圖15-2）。3間接凝集抑制反應(yīng)診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。檢測方法為將標本先與抗體試劑作用，然后再加入致敏的載體，若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明標本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結(jié)合，因此仍與載體上的抗原起作用。如標本中存在相同抗原，則凝集反應(yīng)被抑制（圖15-3）。圖15-3

5、 間接凝集抑制反應(yīng)原理示意圖4協(xié)同凝集反應(yīng)協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination）與間接凝集反應(yīng)的原理相類似，但所用載體既非天然的紅細胞，也非人工合成的聚合物顆粒，而是一種金黃色葡萄球菌。它的菌體細胞壁中含有A蛋白（staphylococcusprotienA，SPA）。SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，因此當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。協(xié)同凝集反應(yīng)也適用于細菌的直接檢測。二、間接血凝試驗血凝試驗（hemagglutinationtest）是紅細胞凝集試驗的簡稱。間接血凝試驗是以紅細胞作為載體的間接凝集試驗，在臨

6、床檢驗中應(yīng)用廣泛，其操作過程如下：1.載體紅細胞是大小均一的載體顆粒，最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細胞及O型人紅細胞。新鮮紅細胞能吸附多糖類抗原，但吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用23天。為此一般在致敏前先將紅細胞醛化，可長期保存而不溶血。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。紅細胞經(jīng)醛化后體積略有增大，兩面突起呈圓盤狀。醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力，血凝反應(yīng)的效果基本上與新鮮紅細胞相似。如用兩種不同醛類處理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸處理。醛化紅細胞能耐60加熱，并可反復凍融不破碎，在4可保存36個月，在20可保

7、存一年以上。2.致敏致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。用蛋白質(zhì)致敏紅細胞的方法有直接法和間接法。直接法只須在低pH，低離子濃度下，用醛化紅細胞直接吸附即可。間接法則需用偶聯(lián)劑將蛋白質(zhì)結(jié)合到紅細胞上。常用偶聯(lián)劑為雙偶氮聯(lián)苯胺（bidiazotizedbenzidine，BDB）和氯化鉻。3.血凝試驗可在微量滴定板或試管中進行，將標本倍比稀釋，一般為1:64，同時設(shè)不含標本的稀釋液對照孔。在含稀釋標本1滴的板孔（或試管）中，加入0.5致敏紅細胞懸液1滴，充分混勻，置室溫12小時，即可觀察結(jié)果。凡紅細胞沉積于孔底，集中呈一圓點的為不凝集（）。如紅細胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細

8、胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱（圖15-4），以凝集的孔為滴度終點。圖15-4血凝反應(yīng)強度示意圖三、膠乳凝集試驗膠乳凝集試驗也是一種間接凝集試驗，所用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8m大小的圓形顆粒，帶有負電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結(jié)合牢固性差。也可制備成具有化學活性基團的顆粒，如帶有羧基的羧化聚苯乙烯膠乳等，抗原或抗體以共價鍵交聯(lián)在膠乳表面?；瘜W交聯(lián)一般通過縮合劑碳化二亞胺將膠乳上的羧基與被交聯(lián)物上的氨基縮合在一起。這種用交聯(lián)致敏的膠乳試劑性能穩(wěn)定，保存期長。四、間接凝集反應(yīng)的應(yīng)用間接凝集反應(yīng)具有快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實驗設(shè)備等特點，而且能用于抗原或抗體的測定

9、，因此在臨床檢驗中廣為應(yīng)用。（一）抗原的檢測反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。間接凝集反應(yīng)的敏感度雖較沉淀反應(yīng)高，但低于新發(fā)展的各種標記免疫測定。例如檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的間接血凝試驗敏感度一般在25ng/ml，對獻血員的篩檢已不符合要求。（二）抗體的檢測可用于檢測細菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體。例如間接血凝試驗或明膠顆粒凝集試驗用于檢測抗人免疫缺陷病毒（HIV）抗體以診斷艾滋病、膠乳凝集試驗用于檢測抗溶血素O等。也有用于檢測自身免疫性疾病的抗體，例如類風濕因子膠乳凝集試驗、抗DNA抗體和抗甲狀腺球蛋白抗體的間接血凝試驗等。第四節(jié) 自

10、身紅細胞凝集試驗自身紅細胞凝集試驗（autologous red cell agglutination assay）與一般間接血凝試驗不同之處為反應(yīng)中的紅細胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細胞。主要試劑材料為抗人O型紅細胞的單克隆抗體，這種抗體能與不論何種血型的紅細胞結(jié)合，但不引起凝集反應(yīng)。這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體可用于檢測標本中的抗原；如與特異性抗原連接，則可用于檢測標本中的抗體。反應(yīng)中的標本為受檢者的全血。圖12-5 自身紅細胞凝集試驗原理示意圖自身紅細胞凝集試驗的特點是受檢標本為全血，不需分離血清，采指血或耳垂血進行試驗，受檢者即刻可知檢測結(jié)果。此試驗已成功地用于抗HIV抗體

11、的檢測。也有檢測HBsAg的試劑供應(yīng)，其敏感度與間接血凝試驗相仿。第五節(jié) 抗球蛋白參與的血凝試驗抗球蛋白參與的血凝試驗由Coombs于1945年建立，故又稱為Coombs試驗，是檢測抗紅細胞不完全抗體的一種很有用的方法。所謂不完全抗體，多半是7S的IgG類抗體，能與相應(yīng)的抗原牢固結(jié)合，但在一般條件下不出現(xiàn)可見反應(yīng)。Coombs利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細胞凝集。經(jīng)常用作試驗的有兩類方法。（一）直接Coombs試驗將含球蛋白的試劑直接加到紅細胞表面結(jié)合抗體的細胞懸液中，即可見細胞凝集（圖15-6）?？捎貌Ｆǘㄐ詼y定，也可用試管法作半定量分析。常用于新生兒溶血癥、自身免疫性溶血癥、特發(fā)性自身免疫性貧血和醫(yī)源性溶血性疾病等的檢測。圖15-6直接Coombs試驗（二）間接Coom