菠蘿蛋白酶粗提液的凝膠過(guò)濾層析

1、菠蘿蛋白酶粗提液的凝膠過(guò)濾層析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦斫夂驼莆漳z過(guò)濾層析技術(shù)原理和實(shí)驗(yàn)操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理層析以基質(zhì)為固定相，以液體或氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。種類：柱層析、紙層析、薄層層析、薄膜層析常用術(shù)語(yǔ)固定相流動(dòng)相床體積，Vt洗脫體積，Ve外水體積，Vo內(nèi)水體積，Vi基質(zhì)體積，Vg凝膠過(guò)濾利用具有一定孔徑的多孔凝膠作為固定相，把分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)的層析技術(shù)，又稱為分子篩。凝膠的類型有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等。 葡聚糖凝膠用得最多，它是-1，6葡聚糖與1-氯-2，3-環(huán)氧

2、丙烷反應(yīng)交聯(lián)而成的 ，有不同型號(hào)的凝膠。 凝膠的吸水能力與凝膠的交聯(lián)度關(guān)系密切。G表示交聯(lián)度，G后面的數(shù)字是凝膠吸水量（ml/g干膠）乘以10所得的值。交聯(lián)度越大，G值小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，顆粒內(nèi)孔徑越小，吸水值小，分辨率高，分級(jí)范圍窄，機(jī)械性能好。交聯(lián)度越小，G值大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，顆粒內(nèi)孔徑越大，吸水值大，分辨率低，分級(jí)范圍寬，機(jī)械性能不好。三實(shí)驗(yàn)設(shè)備:層析柱(2x20cm)、恒流泵、自動(dòng)部分收集器、水浴鍋、751-紫外分光光度計(jì)四實(shí)驗(yàn)試劑1、Sephadex G75（葡聚糖G75）2、柱層析試劑0.1M PBS 3000 ml pH7.83、測(cè)酶活試劑： （1）1%酪蛋白300 ml ：（2）

3、激活劑 300 ml ：（3）5%TCA（三氯乙酸）400 ml4、酶液濃縮 （1）用實(shí)驗(yàn)一的透析袋。 （2）PEG（聚乙二醇）6000 五實(shí)驗(yàn)步驟凝膠的預(yù)處理凝膠（干粉）必須使用前在過(guò)量的溶劑中充分吸脹，一般多為dH2O、鹽溶液或buffer，放置室溫較長(zhǎng)時(shí)間，使之充分吸脹。用傾斜法出去混雜的小顆粒，重復(fù)3到4次，以防止粉末等物質(zhì)塞住膠孔。加熱100溶脹，不同交聯(lián)度，時(shí)間不同，G50需2小時(shí)，可殺死細(xì)菌和霉菌，且可排除凝膠內(nèi)包藏的氣泡。柱的選擇 柱的直徑與長(zhǎng)度之比，一般為1:251:100裝柱1、垂直安裝好層析柱，篩板不能留有氣泡。2、先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，

4、然后邊攪拌，邊將糊狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降；3、待其自然沉降至柱高的1/4時(shí)，打開(kāi)出水口，使上端液面緩慢下降至需要的高度；4、將層析柱與洗脫液連接，讓2-3倍柱體積的洗脫液流過(guò)固定相，使其平衡。5、調(diào)節(jié)流速，每管4ml，每6min收集1管。加樣吸出床上方多余液體直至與膠面相切。沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開(kāi)下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1 ml洗脫液沖洗管壁2次。最后加入34 ml洗脫液于凝膠上，蓋上蓋子，柱進(jìn)水口連通恒流泵，柱出水口與部分收集器相連。洗脫以4ml/管，每6min收

5、集1管的速度收集，同時(shí)檢測(cè)280nm吸收值，直至數(shù)值由0達(dá)到最大值再到0，結(jié)束收集，約2025管。蛋白檢測(cè)和酶活測(cè)定用紫外分光光度計(jì)測(cè)各管的A280A280數(shù)值高的管進(jìn)行酶活測(cè)定A275把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干凈的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液濃縮到12ml，用吸管把酶取出，-10保存，留到下次電泳實(shí)驗(yàn)用。實(shí)驗(yàn)完畢，玻棒攪動(dòng)G75，加少量緩沖液，倒回?zé)偟膶?shí)驗(yàn)流程裝柱（裝柱時(shí),柱內(nèi)留10 ml 的水,倒入Sephadex G75，要求Sephadex G75均勻，大約1.5h） 調(diào)節(jié)流速4mL/管/6分（注意：恒流泵的轉(zhuǎn)速不能太高）加樣:約58ml收集管（收集202

6、5管）用紫外分光光度計(jì)測(cè)各管的A280A280數(shù)值高的管進(jìn)行酶活測(cè)定：按下表進(jìn)行，其中，以一管作為對(duì)照。把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干凈的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液濃縮到23mL，用吸管把酶取出，留到下次電泳實(shí)驗(yàn)用。 把Sephadex G75倒到燒杯中 清洗干凈層析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管試劑對(duì)照(調(diào)零)試管1TCA(ml)1%酪蛋白 (ml)酶液(ml)激活劑(ml)310.10.910.10.937 水浴 10minTCA(ml) 3靜置5min ，濾紙過(guò)濾A275 酶活單位(U) 酶活單位：在上述條件下(37,酶促反應(yīng)10min)，每10min增加0.01個(gè)光吸收值的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果試 管12345678910A280 A275 酶活(U) 11121314151617181920