微生物學檢驗基本技術(shù)1

1、.：.；微生物學檢驗根本技術(shù)1微生物學檢驗根本技術(shù) 隨著現(xiàn)代醫(yī)學及相關科學技術(shù)的開展，各學科相互交叉和浸透，醫(yī)學微生物學檢驗技術(shù)已深化到細胞、分子和基因程度，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛運用。醫(yī)學微生物學實驗室的根本義務之一是利用微生物學檢驗技術(shù)，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進展耐藥性監(jiān)測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學調(diào)查及研討等提供科學根據(jù)。 第一節(jié)微生物形狀學檢查細菌形狀學檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類和鑒定的根底，可根據(jù)其形狀、構(gòu)造和染色反響性等，為進一步鑒定提供參考根據(jù)。 一、顯微鏡檢查 由于細菌個體微小，肉眼不能

2、看到，必需借助顯微鏡的放大才干看到。普通形狀和構(gòu)造可用光學顯微鏡察看，其內(nèi)部的超微構(gòu)造那么需用電子顯微鏡才干看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。 1普通光學顯微鏡 采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4m。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即0.2m，而肉眼可見的最小籠統(tǒng)為0.2mm。故用油浸鏡放大1 000倍，能將0.2m的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學顯微鏡可用于細菌、放線菌和真菌等的察看。 2暗視野顯微鏡 常用于察看不染色微生物形狀和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下察看到光亮的微生

3、物如細菌或螺旋體等。 3相差顯微鏡 相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改動直射光的光位相和振幅，將光相的差別轉(zhuǎn)換為光強度差。在相差顯微鏡下，當光線透過不染色標本時，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差別，可察看到微生物形狀、內(nèi)部構(gòu)造和運動方式等。 4熒光顯微鏡 熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡根本一樣，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數(shù)運用的是落射光安裝，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍紫光。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍光的熒光顯微鏡除可用普透明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結(jié)合的細菌的檢測或鑒定。 5電

4、子顯微鏡 用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細菌超微構(gòu)造的察看。 二、不染色標本檢查 不染色標本普通可用于察看細菌形狀、動力及運動情況。細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進展察看。有鞭毛的細菌運動活潑，無鞭毛的細菌那么呈不規(guī)那么布朗運動。梅毒慘白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形狀和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。 1懸滴法 在干凈凹玻片的凹孔周圍涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的

5、凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封鎖后置高倍鏡下或暗視野察看。 2壓滴法 用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于干凈玻片的中央，在菌懸液上悄然蓋上一蓋玻片，留意防止產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野或暗視野察看。 3毛細管法 主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。通常選用6070mm長。0.51.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養(yǎng)菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野察看。 三、染色標本檢查 細菌標本經(jīng)染色后，由于細菌與周圍環(huán)境間在顏色上構(gòu)成鮮明對比，故在普通光學顯微鏡下可清楚地察看到細菌的形狀特征如細菌的大小

6、、外形、陳列等和某些特殊構(gòu)造如莢膜、鞭毛、芽孢等，并可根據(jù)染色反響性對細菌加以分類鑒定。 一細菌染色的普通程序 細菌染色的普通程序是：涂片枯燥固定染色媒染脫色復染。 1涂片制備 血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培育物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動物組織，病變部分涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培育基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環(huán)取少量的培育物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然枯燥或遠火漸漸烘干。 2固定 目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及構(gòu)造，便于染色；促使細菌粘附在載玻片上，防止在水洗過程中被水沖掉；改動細菌對染料的通透

7、性，有利于菌細胞內(nèi)構(gòu)造的染色。通常用火焰加熱固定，將已枯燥的涂片在火焰中迅速經(jīng)過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。 3染色 根據(jù)檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進展染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。 4媒染 凡能加強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改動的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。 5脫色 凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。 6復染 已脫色處置的細菌或其

8、構(gòu)造常以復染液作復染以便于察看。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。 二常用染色法染液配方見第8章 1 單染色法 只用一種染料染色。由于大多數(shù)細菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用呂氏美藍、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可察看細菌的大小、形狀與陳列，不能顯示細菌的構(gòu)造與染色特性。 2復染色法 用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可察看細菌的大小、形狀與陳列外，還反響出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。 1革蘭染色：細菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染1min，清水沖去染液。加碘液媒染 1min，

9、水洗，甩干。用95%乙醇脫色，悄然搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數(shù)滴進展復染，約30s，水洗。干后顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。 2抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：細菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。繼續(xù)染5min奴卡菌需求加長時間，水洗，甩干。滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色零落為止，水洗，甩干。加呂氏美藍復染液數(shù)滴復染1min，水洗。干后顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。 金胺O-羅

10、丹明B染色法：細菌涂片固定后加第1液3090s。棄去第1液后加第2液染15min。用第3液脫色12min，水洗。滴加第4液染30s，水洗，干后置熒光顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。 3特殊染色法 1鞭毛染色改良Ryu法：玻片的處置 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。在玻片上滴蒸餾水1滴。挑取培育物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛零落。置35孵箱自然枯燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染12 min悄然水洗。干后顯微鏡鏡檢察看結(jié)果 鞭毛和菌體呈紫色。 2異染顆粒染色(阿爾培托法)：細菌涂片經(jīng)火焰

11、固定，加甲液染色35min。水洗。滴加乙液，染1min。水洗。干后顯微鏡鏡檢察看結(jié)果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。 3莢膜染色：奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，繼續(xù)3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然枯燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或

12、不著色。 4芽胞染色：染液：第一液為萋納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。 4負染色法 背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來察看真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋覓有莢膜的菌細胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。 5熒光染色法 經(jīng)熒光素染色的細菌，或熒光素標志的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結(jié)

13、合構(gòu)成的復合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。 第二節(jié) 微生物培育與分別方法 大多數(shù)細菌均可以經(jīng)過人工方法培育，而衣原體和病毒的分別培育往往需求活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。只需將微生物培育出來才干對它進展研討、鑒定和運用。 一、接種與分別方法 根據(jù)待檢標本的性質(zhì)、培育目的和所用培育基的種類，采用不同的接種方法。 1平板劃線分別培育法 對混有多種細菌的臨床標本，采用劃線分別和培育，使原來混雜在一同的細菌沿劃線在瓊脂平板外表分別，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需求借助瓊脂平板劃線分別目的菌。平板劃線分別法通常有兩種方法： 1分區(qū)劃

14、線分別法：此法常用于含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分別。先用接種環(huán)挑取標本涂布于瓊脂平板1區(qū)占培育基總面積的1/4并作數(shù)條劃線，再于2、3、4區(qū)依次劃線。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接13次。一個勝利分區(qū)劃線的平板，培育后分別察看1區(qū)構(gòu)成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分別到單個菌落。 2延續(xù)劃線分別法：此法常用于含菌量不多的標本或培育物中的細菌分別培育。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處悄然涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板外表曲線延續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板外表。 2 瓊脂斜面接種法 主要用于菌

15、落的移種，以獲得純種進展鑒定和保管菌種等。用接種環(huán)針挑取單個菌落或培育物，從培育基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折延續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培育基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。 3穿刺接種法 此法多用于半固體培育基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培育基接種，半固體培育基的穿刺接種可用于察看細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培育基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培育基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。 4液體培育基接種法 用于各種液體

16、培育基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個菌落，傾斜液體培育管，在液面與管壁交界處研磨接種物以試管直立后液體淹沒接種物為準。此接種法應防止接種環(huán)與液體過多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免構(gòu)成氣溶膠，呵斥實驗室污染。 5傾注平板法 本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數(shù)。取純培育物的稀釋或原標本1ml至無菌培育皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至4550左右的瓊脂培育基1520ml傾注入該無菌培育皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37培育，長出菌落后進展菌落計數(shù)，以求出每毫升標本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個方格每格為1cm2中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù)，并算出平皿直徑，然后按以下公式計數(shù)，求

17、出每毫升標本中的細菌數(shù)。 全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)r2 每ml標本中的細菌數(shù)=全平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù) 6涂布接種法 本法多用于紙片分散法藥敏實驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培育基外表，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂外表，然后貼上藥敏紙片，或直接培育，本法經(jīng)培育后細菌構(gòu)成菌苔。 二、細菌的培育方法 根據(jù)不同的標本及不同的培育目的，可選用不同的培育方法。通常把細菌的培育方法分為需氧培育、二氧化碳培育、微需氧培育和厭氧培育四種。 1需氧培育 是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培育，將已接種好的平板、斜面、液體培育基等在空氣中置35孵育

18、箱內(nèi)孵育1824h，無特殊要求的細菌均可生長。少數(shù)生長緩慢的細菌需求培育3-7d甚至1個月才干生長。為使孵育箱內(nèi)堅持一定的濕度，可在其內(nèi)放置一杯水。對培育時間較長的培育基，接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培育基干裂。 2二氧化碳培育 某些細菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培育，特別是在初次分別時，須在5%10 %二氧化碳環(huán)境中培育才干生長。常用的培育法如下。 1二氧化碳培育箱法：二氧化碳孵箱能自動調(diào)理二氧化碳的含量、溫度和濕度，培育物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時間后可直接察看生長結(jié)果。 2燭缸培育法：取有蓋磨口標本缸或玻璃枯燥器，將

19、接種好的培育基放入缸內(nèi)，點燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培育物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭熄滅氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%10%。將缸置于35普通孵育箱內(nèi)孵育。 3氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培育皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉形狀，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管安瓿產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可到達需求的二氧化碳培育環(huán)境，置于35孵育箱內(nèi)孵育。 4化學法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋嚴密封，傾斜缸位使鹽

20、酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35孵育箱內(nèi)孵育。 3微需氧培育 微需氧菌培育在大氣中及絕對無氧環(huán)境中均不能生長，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中才可生長，將標本接種到培育基上，置于上述氣體環(huán)境中，35進展培育即微需氧培育法。 4厭氧培育 厭氧菌對氧敏感，培育過程中需呵斥低氧化復原電勢的厭氧環(huán)境。厭氧培育常用的方法有：物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培育法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。 三、細菌在培育基上生長特性 1固體培育基 標本或液體培育物劃線接種到固體培育基外表后，單個細菌經(jīng)分裂繁衍可構(gòu)成一個肉眼可見的細菌集團，稱為菌落colony。

21、(1)菌落的形狀特征：大小、外形露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)那么等、突起或扁平、凹陷、邊緣光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等、顏色紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等、外表光滑、粗糙等、透明度不透明、半透明、透明等和粘度等。據(jù)細菌菌落外表特征不同，可將菌落分為3型： 光滑型菌落S型菌落：菌落外表光滑、潮濕、邊緣整齊，新分別的細菌大多呈光滑型菌落。粗糙型菌落R型菌落：菌落外表粗糙、枯燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體外表多糖或蛋白質(zhì)構(gòu)成。R型細菌抗原不完好，毒力和抗吞噬才干都比S型細菌弱。但也有少數(shù)細菌新分別的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。粘液型菌落M型

22、菌落：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結(jié)核桿菌等。 (2)菌落溶血特征：菌落溶血有以下3種情況。溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培育基出現(xiàn)12mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；溶血：又稱完全溶血，菌落周圍構(gòu)成一個完全明晰透明的溶血環(huán)，是細菌產(chǎn)生的溶血素使紅細胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周圍的培育基沒有變化，紅細胞沒有溶解或缺損。 (3)色素：有些細菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培育基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 (4)氣味：某些細菌在培育基中生長繁衍后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌生姜氣味、變形桿菌巧克力燒焦的臭

23、味、厭氧梭菌*的惡臭味、白色假絲酵母菌酵母味和放線菌泥土味等。 2液體培育基 細菌在液體培育基中有3種生長景象：大多數(shù)細菌在液體培育基生長繁衍后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀陳列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等那么呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌普通呈外表生長，常構(gòu)成菌膜。 3半固體培育基 半固體培育基主要用于細菌動力實驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培育基依然廓清透明，為動力實驗陰性。 第三節(jié) 細菌的生物化學實驗 各種細菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因此對底物的分解才干不同，其代

24、謝產(chǎn)物也不同。用生物化學方法測定這些代謝產(chǎn)物，可用來區(qū)別和鑒定細菌的種類。利用生物化學方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生物化學實驗或稱生化反響。生物化學實驗的方法很多，主要有以下幾類。 一、碳水化合物的代謝實驗 1糖醇、苷類發(fā)酵實驗 1原理：不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖醇、苷類的酶，因此對各種糖醇、苷類的代謝才干也有所不同，即使能分解某種糖醇、苷類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細菌對培育基中所含糖醇、苷降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的才干，可用以鑒定細菌種類。 (2)方法：在根底培育基中如酚紅肉湯根底培育基pH7.4參與0.51.0w/v的特定糖醇、苷類。所運用的糖醇、苷類有很多種，根據(jù)不同需求可選擇單糖、

25、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見表6-4-1。將待鑒定的純培育細菌接種入實驗培育基中，置35孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時到兩周視方法及菌種而定后，察看結(jié)果。假設用微量發(fā)酵管，或要求培育時間較長時，應留意堅持其周圍的濕度，以免培育基枯燥。 (3)結(jié)果：能分解糖醇、苷產(chǎn)酸的細菌，培育基中的指示劑呈酸性反響如酚紅變?yōu)辄S色，產(chǎn)氣的細菌可在小倒管Durham小管中產(chǎn)生氣泡，固體培育基那么產(chǎn)生裂隙。不分解糖那么無變化。 (4)運用：糖醇、苷類發(fā)酵實驗，是鑒定細菌的生化反響實驗中最主要的實驗，不同細菌可發(fā)酵 不同的糖醇、苷類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸埃希菌那么可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即使是兩種細菌均可發(fā)

26、酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡一樣，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者那么產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此實驗鑒別細菌。 表6-4-1 常用于細菌糖發(fā)酵實驗的糖、醇類 單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖 雙糖 蔗糖葡萄糖果糖 乳糖葡萄糖半乳糖 麥芽糖兩分子葡萄糖 三糖 棉子糖葡萄糖果糖半乳糖 多糖 菊糖多分子果糖 淀粉 醇類 側(cè)金盞花醇 衛(wèi)茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖類 肌醇 2葡萄糖代謝類型鑒別實驗 (1)原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有分子氧參與的，稱為氧化型；能進展無氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌為

27、產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中那么不能分解葡萄糖。本實驗又稱氧化發(fā)酵O/F或HughLeifson，HL實驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。 (2)方法：挑取少許純培育物不要從選擇性平板中挑取接種2支HL培育管中，在其中一管參與高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣作為密封管，另一管不加作為開放管。置35孵箱孵育48h以上。 (3)結(jié)果： 兩管培育基均不產(chǎn)酸顏色不變?yōu)殛幮?；兩管都產(chǎn)酸變黃為發(fā)酵型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。 (4)運用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或

28、產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌發(fā)酵型與微球菌氧化型。 3甲基紅MR實驗 (1)原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培育基pH下降至4.5以下時，參與甲基紅指示劑呈紅色。如細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)如醇、醛、酮、氣體和水，培育基pH在 5.4以上，參與甲基紅指示劑呈桔黃色。 (2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35孵育48h96h后，于5ml培育基中滴加56滴甲基紅指示劑，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果斷定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。 (4)運用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，

29、如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。 4半乳糖苷酶實驗ONPG實驗 (1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需求乳糖通透酶和半乳糖苷酶才干快速分解。有些細菌只需半乳糖苷酶，因此只能緩慢發(fā)酵乳糖，一切乳糖快速發(fā)酵和緩慢發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-D-半乳糖苷O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 (2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35水浴或孵箱孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為

30、陽性，無色為陰性。 (4)運用：可用于緩慢發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒定，本法對于迅速及緩慢分解乳糖的細菌均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為實驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。 5VP實驗 (1)原理：測定細菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的才干。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧構(gòu)成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進而與培育基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合構(gòu)成紅色化合物。即V-P實驗陽性。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35孵育2448h，參與50g/L萘酚95乙

31、醇溶液0.6ml，悄然振搖試管，然后加0.2ml 400g/L KOH，悄然振搖試管30s至1min，然后靜置察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性。 (4)運用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本實驗常與MR實驗一同運用，普通情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細菌不一定都這樣規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇特變形桿菌的VP實驗和MR實驗常同為陽性。 6膽汁七葉苷水解實驗 1原理：在10%40膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的才干。七葉苷被細菌分解生成的七葉素，七葉素與培育基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反響構(gòu)成黑色化合物。 (2)方法：將被檢菌接種于

32、膽汁七葉苷培育基中，35孵育1824h后，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。 (4)運用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌如脆弱擬桿菌等的初步鑒別。D群鏈球菌本實驗為陽性。 7淀粉水解實驗 (1)原理：產(chǎn)生淀粉酶的細菌能將淀粉水解為糖類，在培育基上滴加碘液時，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。 (2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35孵育1824h，參與革蘭碘液數(shù)滴，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：陽性反響，菌落周圍有無色透明區(qū)，其它地方藍色；陰性反響，培育基全部為藍色。 (4)運用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水

33、解實驗陽性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。 8甘油復紅實驗 (1)原理：甘油可被細菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無色的復紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。 (2)方法：取被檢菌接種于甘油復紅肉湯培育基中，于35孵育，察看28d。應同時做陰性對照。 (3)結(jié)果：紫紅色為陽性，與對看管顏色一樣為陰性。 (4)運用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲丙型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本實驗為陰性， 乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不定，其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性。 9葡萄糖酸氧化實驗 (1)原理：某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成-酮基葡萄糖酸。-

34、酮基葡萄糖酸是一種復原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反響，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培育基中(1ml)，置35孵育48h,參與班氏試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽性。不變或仍為藍色為陰性。 (4)運用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。 二、氨基酸和蛋白質(zhì)的代謝實驗 1硫化氫實驗 (1)原理：某些細菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結(jié)合構(gòu)成黑色沉淀物。 (2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培育基或克氏雙糖鐵瓊脂KIA中，35孵育1824h，察看有無黑色沉淀出現(xiàn)?；蛴么姿?/p>

35、鉛紙 條，懸掛于KIA管中白色濾紙，根據(jù)試管大小裁剪適當，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于5060烘干，12115min高壓滅菌備用。醋酸鉛是最敏感的方法。 (3)結(jié)果：有黑色沉淀物為陽性。 (4)運用：主要用于鑒別腸桿菌科細菌，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。 2明膠液化實驗 (1)原理：細菌分泌的胞外蛋白水解酶明膠酶能分解明膠，使明膠失去凝固才干而液化。 (2)方法：將待檢菌接種于明膠培育基中，35孵育24h到7d或更長時間，每24h取出放入4冰箱約2h后，察

36、看有無凝固。 (3)結(jié)果：如無凝固，那么表示明膠已被水解，液化實驗陽性。如凝固，那么繼續(xù)培育。 (4)運用：奇特變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化。 3吲哚實驗靛基質(zhì)實驗 (1)原理：某些細菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對二甲氨基苯甲醛構(gòu)成紅色的玫瑰吲哚。 (2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培育基中，35孵育2448h，參與靛基質(zhì)試劑，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽性，無色為陰性。 (4)運用：主要用于腸桿菌科細菌

37、的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。 4苯丙氨酸脫氨酶實驗 (1)原理：測定細菌能否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，參與三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反響。假設延伸時間，會引起退色。 (2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培育基中，35孵育1824h，滴加100g/L三氯化鐵試劑45滴，立刻察看菌落生優(yōu)點有無綠色出現(xiàn)。 (3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。 (4)運用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。 5氨基酸脫羧酶實驗 (1)原理：某些細菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺

38、的生成使培育基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。 (2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸脫羧酶實驗管和1支氨基酸脫羧酶對看管無氨基酸，各覆蓋至少0.5cm高度 的無菌石蠟油，35孵育14d，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設為溴甲酚紫指示劑，那么實驗管紫色為陽性，黃色為陰性，對看管應為黃色。 (4)運用：主要用于某些細菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產(chǎn)氣腸桿菌陽性與陰溝腸桿菌陰性；鳥氨酸用于陰溝腸桿菌陽性和克雷伯菌陰性；精氨酸用于陰溝腸桿菌陽性和產(chǎn)氣腸桿菌陰性等。 6精氨酸雙水解酶實驗 (1)原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后,生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺

39、均為堿性物質(zhì)，故可使培育基變堿，用 指示劑指示出來。 (2) 方法：將待檢菌接種于實驗培育上，置35孵箱孵育14d，察看結(jié)果。 (3) 結(jié)果：溴甲酚紫指示劑呈紫色為陽性，酚紅指示劑呈紅色為陽性。黃色為陰性。 (4) 運用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。 7尿素酶實驗 (1)原理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培育基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培育基中，35孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽性，不變?yōu)殛幮浴?(4)運用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的鑒定。 8霍亂紅實驗 (1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吲哚

40、，并能使硝酸鹽復原為亞硝酸鹽，當參與硫酸后生成亞硝酸吲哚，呈紅色反響。 (2)方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，置35孵育24h，參與濃硫酸數(shù)滴，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈紅色者為陽性。 (4)運用：霍亂弧菌呈陽性反響，但本實驗并非霍亂弧菌所特有。凡能產(chǎn)生吲哚并復原硝酸鹽為亞硝酸鹽的細菌，均可呈現(xiàn)陽性反響。 三、碳源和氮源利用實驗 1枸櫞酸鹽利用實驗 (1)原理：某些細菌能利用枸櫞酸鹽作為獨一碳源，而在此培育基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培育基變堿性。 (2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培育基上，置35孵育14d，逐日察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，

41、培育基變藍色為陽性；無菌落生長，培育基綠色為陰性。 (4)運用：可用此實驗作細菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。 2丙二酸鹽利用實驗 (1)原理：某些細菌能利用丙二酸鹽作為獨一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培育基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培育基中，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基由綠色變?yōu)樗{色為陽性。顏色無變化為陰性。 (4)運用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸櫞酸桿

42、菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反響，其它各菌屬均為陰性。 3醋酸鈉利用實驗 (1)原理：細菌利用銨鹽作為獨一氮源，同時，利用醋酸鹽作為獨一碳源時，可在醋酸鹽培育上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培育基變?yōu)閴A性。 (2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培育基中，置35孵育27d，逐日察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基上有細菌生長，并變?yōu)樗{色為陽性。 (4) 運用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。 4馬尿酸鈉水解實驗 (1)原理：某些細菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，構(gòu)成苯甲酸鐵沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培

43、育基中，置35孵育48h，離心沉淀，取上清液0.8ml，參與三氯化鐵試劑0.2ml，立刻混勻，經(jīng)1015min察看 結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)恒定之沉淀物為陽性。 (4) 運用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。 5、乙酰胺利用實驗 (1)原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培育基變堿。 (2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培育基中，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基由綠色變?yōu)樗{色為陽性。如不生長，或稍有生長，但培育基顏色不變?yōu)殛幮浴?(4)運用：主要用于非發(fā)酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產(chǎn)堿桿菌、食酸假單胞菌為陽性，其它非發(fā)酵菌大多數(shù)為陰性。 四、酶類實

44、驗 1.氧化酶實驗 (1)原理：氧化酶又稱細胞色素氧化酶，是細胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反響，而是先使細胞色素C氧化，然后 此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響。因此，本實驗結(jié)果與細胞色素C的存在有關。 (2)方法：取干凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液1滴，1min內(nèi)察看結(jié)果。也可將試劑滴加到菌落上進展實驗。 (3)結(jié)果：陽性者立刻變粉紅色，510s內(nèi)呈深紫色。無色為陰性。 (4)運用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細菌的區(qū)別，前者陽性

45、，而后者陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。 本卷須知： 實驗時應防止接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應經(jīng)常改換新試劑，并盛于棕色瓶中，假設試劑已變成深藍色，應棄去不用。 2觸酶實驗 (1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而構(gòu)成氧分子，出現(xiàn)氣泡。 (2)方法：取干凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細菌，加3H2O2 1滴，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設立刻出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。 (4)運用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰

46、性，故常用此實驗來鑒定。此外，金氏桿菌屬的細菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別那么用耐熱觸酶實驗，結(jié)核分枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。 本卷須知：3H2O2溶液要新穎配制。不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細胞含有觸酶，可致假陽性反響，取對數(shù)生長期的細菌。 3凝固酶實驗 (1)原理：凝固酶實驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要實驗。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，包圍于細菌外面而凝聚成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此凝聚因子所致；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產(chǎn)物，使纖維蛋白原

47、變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。試管法可同時測定結(jié)合型和游離型凝固酶。 (2)方法: 玻片法：在一張干凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培育物與其混合設陽性和陰性對照制成菌懸液，假設經(jīng)1020s內(nèi)無自凝 景象發(fā)生，那么參與人或兔新穎血漿1環(huán)，與菌懸液混合，察看結(jié)果。試管法：于試管內(nèi)加14稀釋的兔或人血漿0.5ml，再加12個待試菌菌落，置37水浴，每30min察看1次結(jié)果。 (3)結(jié)果：玻片法：510s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。2h后無上述景象出現(xiàn)，那么放置過夜后再察看。 (4)運用：本實驗僅用于致病性葡萄球的鑒定。 本卷須知：玻片法為挑選實驗，陽性、陰性均

48、需進展試管法測定。血漿必需新穎。應運用肝素而非枸櫞酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。本實驗也可用市購的膠乳凝集實驗試劑盒測定。 4DNA酶實驗 (1)原理： 某些細菌能產(chǎn)生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸那么不會。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在 菌落周圍構(gòu)成透明區(qū)。 (2)方法：在DNA瓊脂平板上點種待檢菌，35孵育1824h，用1 mol/L鹽酸傾注平板，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：如菌落周圍有透明區(qū)者為陽性，無透明區(qū)為陰性。 (4)運用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。沙雷菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌DNA酶均陽性。 5膽汁溶菌實驗 (1)原理：膽

49、汁或去氧膽酸鈉能導致某些細菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細菌細胞膜上的外表張力，使細菌的細胞膜破損或使菌體裂 解。另一方面能夠與激活細菌體內(nèi)的自溶酶有關。 (2)方法：試管法：用純培育物制備1ml生理鹽水濃菌懸液，pH調(diào)至7.0，分裝兩支試管，各0.5ml。其中一管加0.5ml 100g/L去氧膽酸鈉為實驗 管，另一管加0.5ml生理鹽水作對照。35孵育每小時察看1次結(jié)果。平板法：在血平板上選取單個可疑菌落，作好標志，直接在菌落上加1接種環(huán)20g/L去氧膽酸鈉pH7.0，置35孵育30min平板不要翻轉(zhuǎn)察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：試管法：在3h內(nèi)液體透明為陽性。平板法：如菌落消逝，僅留

50、下溶血區(qū)為陽性，菌落不消逝為陰性。 (4)運用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。 6硝酸鹽復原實驗 (1)原理：硝酸鹽復原反響包括兩個過程，其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽復原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其它含氮化合物；另一是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽替代氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽復原過程可因細菌不同而異。有的細菌僅使硝酸鹽復原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細菌可使其復原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽復原為氮，如沙雷菌屬；有的細菌還可以將其復原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽假設復原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，那么稱為脫硝化或脫氮化

51、作用。某些細菌能復原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與-萘胺結(jié)合生成N-萘胺偶苯磺酸。 (2)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培育基內(nèi)含小倒管中，35孵育14d。將甲、乙等量混合液用時混合0.1ml加于試管內(nèi)，立刻或10min內(nèi)察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反響。如欲察看有無氮氣產(chǎn)生，可于培育基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，那么表示有氮氣生成。如欲檢查培育基中硝酸鹽能否被分解，可取鋅粉少許參與培育基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色闡明硝酸鹽仍存在；假設不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。 (4)運用：本實驗廣泛用于細菌鑒定。腸桿菌科細菌均能復

52、原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細菌能產(chǎn)生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的那么能復原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能復原硝酸鹽為亞硝酸鹽。 7卵磷脂酶實驗 (1)原理：細菌產(chǎn)生的卵磷脂酶，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂構(gòu)成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。 (2)方法：取待檢菌劃線接種或點種在卵黃瓊脂平板上，置35孵育36h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：3h后在菌落周圍構(gòu)成乳白色混濁，即為卵磷脂酶實驗陽性，6h后該混濁圈可擴展到直徑56mm。 (4) 運用：該實驗主要用于厭氧的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為陰性。蠟

53、樣芽孢桿菌亦為陽性。 8磷酸酶實驗 (1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反響可根據(jù)反響基質(zhì)不同而異，如用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。 (2)方法：取待檢菌接種于磷酸酚酞瓊脂平板上，置35孵育1824h，于平皿蓋內(nèi)加1滴濃氨水，熏蒸片刻，察看結(jié)果。亦可用液體培育基，經(jīng)孵育后，向管內(nèi)加400g/L氫氧化鈉溶液1滴，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：菌落變?yōu)榧t色者為陽性。 (4)運用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。 9脂酶實驗 (1)原理：細菌產(chǎn)生的脂酶可分解脂肪為游離脂肪酸。在培育基中參與維多利亞藍可與脂肪結(jié)合成為

54、無色化合物，假設脂肪被分解，那么維多利亞藍釋出，呈藍色。 (2)方法：將待檢菌接種于含維多利亞藍的脂酶培育基中，置35孵育24h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基變?yōu)樯钏{色者為陽性，否那么可呈無色或粉紅色。 (4)運用：主要用于厭氧菌鑒定。在擬桿菌中產(chǎn)黑色素擬桿菌中間亞種產(chǎn)生脂酶，其它擬桿菌陰性；在梭菌屬中諾維梭菌和產(chǎn)芽胞梭菌也產(chǎn)生此酶，其它梭菌為陰性。 10CAMP實驗 (1)原理：B群鏈球菌無乳鏈球菌產(chǎn)生一種“CAMP因子，此種物質(zhì)能促進葡萄球菌的-溶血素的活性。因此，可在兩種細菌的交界處溶血力加強，出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)。 (2)方法：在羊血或馬血瓊脂平板上，先以-溶血的金黃色葡萄球菌劃一橫

55、線接種。再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者應相距1cm，于35孵育1824h，察看結(jié)果。每次實驗應做陰陽性對照。 (3)結(jié)果：兩種細菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽性。 (4)運用：主要用于B群鏈球菌陽性的鑒定，其他鏈球菌均為陰性。 11石蕊牛乳實驗 (1)原理：由于牛乳內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，各種細菌對這些物質(zhì)的分解才干不同，故可有數(shù)種不同反響，用以鑒別細菌。 (2)將待檢菌接種于石蕊牛乳培育基中，假設為芽胞梭菌，要在培育基中參與無菌鐵末，置35孵育1824h，必要時可延伸至14d。察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：產(chǎn)酸：發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變?yōu)榉奂t色。產(chǎn)氣：發(fā)酵乳糖而同時產(chǎn)氣，可沖開上面的凡士

56、林。凝固：因產(chǎn)酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。胨化：將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解為胨，培育基上層液體變清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。產(chǎn)堿：乳糖未發(fā)酵，因分解含氮物 質(zhì)，生成胺及氨，培育基變堿，指示劑變?yōu)樗{色。 (4)運用：主要用于梭菌、鏈球菌和丙酸桿菌的鑒定。 腦腦2021-07-13 09:48五、抑菌實驗 1Optochin敏感實驗 (1)原理：Optochin(奧普托欣)是鹽酸乙基氫化羥基奎寧的商品名。對肺炎鏈球菌有特異抑制造用，其作用機制能夠是干擾葉酸生物合成作用，而對其它鏈球菌那么無此作用。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培育物均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上一張含5g奧普托欣紙片，置

57、燭缸或二氧化碳孵箱，35 孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于14mm為敏感，小于或等于 14mm為陰性。 (4)運用：主要用于肺炎鏈球菌敏感與其它鏈球菌耐藥的鑒別。 2桿菌肽敏感實驗 (1)原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎是100%敏感，而其它群鏈球菌對桿菌肽通常耐藥。故此實驗可對鏈球菌進展鑒別。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培育物均勻涂布于血瓊脂平板上，稍干后貼一張含0.04U的桿菌肽紙片，置35 孵育1824h，察看結(jié)果。 (3) 結(jié)果：抑菌圈直徑大于10mm為敏感，小于10mm為耐藥。 (4)運用：主要用于A群與非A群鏈球菌的鑒別。從臨床分別的菌株中有5%15%非

58、A群鏈球菌也對桿菌肽敏感，如6%的B群鏈球菌、7.5%的C群鏈球 菌和G群鏈球菌等。 3新生霉素敏感實驗 (1)原理：金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低濃度新生霉素所抑制，表現(xiàn)為敏感，而腐生葡萄球菌那么表現(xiàn)為耐藥。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂平板或血平板上，在平板中央貼含5g/片新生霉素診斷紙片一張，置35孵育1618h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于16mm為敏感，小于或等于16mm為耐藥。 (4)運用：主要用于葡萄球菌某些種的鑒定。 4O/129實驗 (1)原理：O/1292，4二氨基-6，7-二異丙基喋啶能抑制弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和鄰單胞菌屬細菌生長，而

59、氣單胞菌屬和假單胞菌屬細菌那么耐藥。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于堿性瓊脂平板上，將10g/片及150g/片的O/129診斷紙片貼于平板上，置35孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)抑菌圈者表示敏感，無抑菌圈者為耐藥。 (4)運用：主要用于弧菌屬、鄰單胞菌屬與氣單胞菌屬的鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌為敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。其它菌屬有發(fā)光桿菌屬為敏感，假單胞菌屬為耐藥。 5氰化鉀實驗 (1)原理：氰化鉀可抑制某些細菌的呼吸酶系統(tǒng)。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀與鐵卟啉結(jié)合，使這些酶失去活性，使細菌生長遭到抑制。 (2)方法：將

60、待檢菌接種于氰化鉀培育基中，同時接種一支不含氰化鉀的對照培育基，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：細菌在氰化鉀培育基中生長的不受抑制為陽性，不生長抑制為陰性。 (4)運用：腸桿菌科中的沙門菌屬、志賀菌屬和埃希菌屬細菌的生長遭到抑制，而其它各菌屬的細菌均可生長。 六、其它實驗 1克氏雙糖鐵或三糖鐵瓊脂培育基實驗 (1)原理：克氏雙糖鐵(KIA)或三糖鐵瓊脂(TSI)培育基制成高層和短的斜面，其中葡萄糖含量僅為乳糖或蔗糖的非常之一，假設細菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖量較少，所生成的少量酸可因接觸空氣而氧化，并因細菌生長