植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)以及有用物質(zhì)生產(chǎn)

1、關(guān)于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)第一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。（一）、概述 第二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為： 酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜類化合物：三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白氨基酸 生氰甙 多炔類、有機酸第三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 植

2、物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時珍在本草綱目中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。 第四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式 生產(chǎn)周期 紫草寧含量（干重）完整植物 23年 12植物細(xì)胞培養(yǎng) 3周 14第五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治

3、療白血病1820（美國）奎寧治療瘧疾510（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥2055（美國）第六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個條件： 1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。 2、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。第七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）

4、、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立 1、種子細(xì)胞的選擇 （1）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類； （2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官 為外植體； (3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：單細(xì)胞培養(yǎng)后，將 單細(xì)胞擴增形成的愈傷組織分2份，1份成分含 量分析，另1份保留培養(yǎng)。第八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng) 種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。第九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 （1）成批培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞 或添加培

5、養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培 養(yǎng)基的方式。 （2）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng) 器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時以 一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。 (3)半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個周期 后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只 保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的 種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 的方式。第十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(三)生物反應(yīng)器類型及特點 大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實驗室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。 第十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切

6、能力弱、易團(tuán)聚等特點。同時，植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計不僅要考慮有利于細(xì)胞生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。 總體上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。第十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細(xì)胞生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣

7、體，所以必須設(shè)計通氣裝置； 為便于取樣觀察，一般還設(shè)計有取樣口。 第十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月生物反應(yīng)器第十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Stirred Tank BioreactorsAn external motor is used to agitate the growth medium with impellers.Sterile air or combinations of gases can be introduced (sparkling)第十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng) 考慮到機械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免

8、，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。 第十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Bubble Column Bioreactor (Airlift Reactor)Introduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenation第十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Internal Loop Airlift BioreactorTube placed inside the reactor creates

9、internal circulation loop 第十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 第十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制精確，處理靈活，缺點是培養(yǎng)體積較小。 第二十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點在于： 可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調(diào)節(jié)； 細(xì)胞位置的固定使其所處的環(huán)境類

10、似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成； 由于細(xì)胞固定在支持物上，培養(yǎng)基可以不斷更換，可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的初生產(chǎn)物對細(xì)胞代謝的反饋抑制，也由于細(xì)胞留在反應(yīng)器中，新的培養(yǎng)基可以再次利用這些細(xì)胞生產(chǎn)初生產(chǎn)物，從而節(jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞所付出的時間和費用； 正是由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，并可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。第二十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類： 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等； 附著式固定化培養(yǎng)

11、系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 第二十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般程序 （1）選材應(yīng)注意以下條件： 藥效肯定； 對其有效成分有充分的了解； 有測定有效成分和藥理的可靠方法； 市場短缺或價格昂貴； 取有藥效成分的部位，且該部位較 易形成愈傷組織。（四）、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)第二十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）細(xì)胞株系建立 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。 在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個基本要求： 有用物質(zhì)的合成積累能力強 生長

12、速度快 第二十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）大量培養(yǎng) 將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”，進(jìn)行大量培養(yǎng)。 （4）產(chǎn)品提取與純化 從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。第二十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素篩選高產(chǎn)細(xì)胞系 從實驗材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。 第二十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，

13、有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系。第二十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞裂）； 第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。 、二步培養(yǎng)法第二十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月、培養(yǎng)基中添加前體 前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。 煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)煙堿酸加入，會增加煙堿的生成量。第二十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用 植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代

14、謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加IAA，能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。 第三十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月、培養(yǎng)條件的影響 光照、溫度等影響次生代謝。在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。 第三十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月、采用固相細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 細(xì)胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)在惰性基質(zhì)中，細(xì)胞生長緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。第三十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月思考題1一個好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？ 用于建立懸浮細(xì)胞

15、系的愈傷組織有何 要求？2建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？3懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長 規(guī)律？4細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？第三十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介第三十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月理化性質(zhì)英文名：Paclitaxel, Taxol or TM分子式：C47H51NO4水溶性：0

16、.7mgml穩(wěn)定性：pH48 穩(wěn)定；pH 8 易分解；在特定條件下紫杉醇可被氧化，但極難還原；第三十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月紫杉醇研發(fā)過程年 代進(jìn) 展1958 NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967 發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968 從紅豆杉中分離出紫杉醇1971 完成結(jié)構(gòu)鑒定1979 發(fā)表作用機制1983 臨床試驗1985 臨床II期1991 臨床III期1992 FDA批準(zhǔn)上市NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一湯姆森科技桂冠獎Ramesh Panchagnula, International Journal of Pharmac

17、eutics.1998(172)1-15.第三十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月市場需求抗癌一線用藥銷售額年增長率5億美元 理論需求量 2g /人, 500萬人/年 1000kg/年實際銷量350 kg/年紫杉醇供需相差十分懸殊 圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢圖（單位：公斤）圖2：國際紫杉醇銷售額（億美元）第三十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月紫杉醇開發(fā)的關(guān)鍵問題上游產(chǎn)業(yè)藥源問題 下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效（活性、水溶性）安全性生物相容性第四十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月藥源問題紅豆杉 主要原料植物 國家一級保護(hù)野生植物，全球十大瀕危物種 之一生長緩慢 分布有限 T

18、axol含量低 樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500病人第四十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人工栽培 采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物 從紅豆杉非樹皮部位提取 產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點：生長周期縮短 簡便、直接缺點：1、紫杉醇含量低 生長緩慢 2、提取工藝復(fù)雜藥源問題解決辦法（一）第四十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成全合成 1994年獲得成功 現(xiàn)有六種途徑半合成 以10-DAB和Baccatin 作為半合成原料獲得紫杉醇

19、 新方法用10-DAT 缺點：1、合成過程煩瑣復(fù)雜，幾十步 2、費用高，化學(xué)試劑昂貴 3、總收率太低（2%）優(yōu)點：1、原料枝葉含量豐富、 提取相 對容易，充分利用再生資源 2、產(chǎn)率高 3、最具實用價值可以工業(yè)化生產(chǎn) 4、獲取紫杉醇構(gòu)效關(guān)系信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造缺點：合成過程相對復(fù)雜 （11步化學(xué)轉(zhuǎn)化和7步分離）第四十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細(xì)胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成 研究階段 紅豆杉生物合成途徑基本明確 10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá) 利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量 優(yōu)點：1、擺脫自然因素，可長期穩(wěn)定 生長 2、適應(yīng)市場、方便調(diào)節(jié) 3、

20、成分簡單，有利于分離純化 4、成本低、生長周期短 5、為半合成提供原料 6、有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定 2、工業(yè)化放大研究第四十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月紫杉醇水溶性很差0.77mM/L使用增溶劑： 聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇 存在問題穩(wěn)定性和水溶性較差（7mm/L）過敏反應(yīng)產(chǎn)生沉淀缺點：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定 2、工業(yè)化放大研究藥效問題第四十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、植物來源藥物的特點 全世界有40%的藥物來源于植物。我國是中草藥資源最豐富的國家，有詳細(xì)記載的近5000種。中草藥治療疾病的歷史上千年，中醫(yī)藥已形成完整的科學(xué)體系。對于植物藥效成分的

21、研究已形成“天然藥物化學(xué)”研究的新領(lǐng)域。 藥用植物中具有藥物功能的物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。除小分子的天然有機化合物以外，還有多種生物大分子活性物質(zhì)。 對不同組方的藥用成分和功能的研究是一項巨大的工程，相當(dāng)于基因組和蛋白質(zhì)組工程。中藥復(fù)方復(fù)雜系統(tǒng)研究（北京大學(xué)韓啟德院士）第四十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、植物來源藥物的種類 1、天然有機化合物 （1）糖和糖苷類 （2）苯丙素類：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等 （3）醌類：輔酶Q10、紫草素 （4）黃酮類：黃酮醇、花色素 （5）鞣質(zhì)：奎寧酸、槲皮醇。 （6）萜類：青蒿素、齊墩果酸 （7）甾體 ：烏沙苷元、毛第黃毒苷元 （8）生物堿：咖

22、啡因、喜樹堿第四十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、植物蛋白質(zhì)、多肽、酶類生理活性物質(zhì) 表2-163、植物糖類藥物包括單糖、聚糖和糖衍生物 。 表2-174、植物脂類藥物 （1）脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸 （2）磷脂類：大豆磷脂 （3）固醇類：豆固醇、-谷固醇。第四十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、植物來源藥物的植被實例 1、植物SOD 2、植酸鈣鎂與肌醇 3、植物不飽和脂肪酸四、植物藥物來源的研究前景 1、植物細(xì)胞培養(yǎng) 2、植物組織培養(yǎng) 3、有效成分的分離、純化，結(jié)構(gòu)和功能測定。第四十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、若干有用物質(zhì)的生產(chǎn) 、生物堿 許多生物堿已經(jīng)用作醫(yī)學(xué)上的藥物。如嗎啡等生物堿通常從鴉片中提取，用作神經(jīng)麻醉劑，利用罌粟種子的愈傷組織培養(yǎng)，可提取嗎啡堿及其它生物堿。第五十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月、苷類物質(zhì) 利用人參愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷已進(jìn)入工廠化生產(chǎn)。、醌類物質(zhì) 利用紫草、決明等愈傷組織培養(yǎng)，生產(chǎn)具有抗細(xì)菌活性的醌類物質(zhì)。第五十三張，PPT共六十