【生命科學標書】主要蔬菜重要品質(zhì)性狀形成的遺傳機理與分子改良

1、項目名稱：主要蔬菜重要品質(zhì)性狀形成的遺傳機理與分子改良首席科學家：黃三文 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所起止年限：依托部門：農(nóng)業(yè)部一、關(guān)鍵科學問題及研究內(nèi)容（一）擬解決的關(guān)鍵科學問題圍繞我國蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中對優(yōu)質(zhì)品種的迫切需求，從已有的蔬菜基因組學研究的基礎出發(fā)，針對決定蔬菜商品品質(zhì)的產(chǎn)品器官發(fā)生發(fā)育和決定風味品質(zhì)的風味物質(zhì)合成積累的遺傳機理開展深入研究。科學問題1：蔬菜商品和風味品質(zhì)性狀形成的遺傳構(gòu)成蔬菜產(chǎn)品器官的形成和風味物質(zhì)的合成與積累是由多基因控制的性狀。哪些關(guān)鍵基因控制了葉球的形態(tài)建成，果實形態(tài)的豐富變異的遺傳基礎是什么，風味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶基因是什么，解決控制這些品質(zhì)性狀形成遺傳構(gòu)成的

2、問題是進一步研究其調(diào)控機制的基礎?？茖W問題2：蔬菜商品和風味品質(zhì)性狀形成的基因調(diào)控機制產(chǎn)品器官形成和風味物質(zhì)代謝的生物學過程受到基因網(wǎng)絡及環(huán)境因素的調(diào)控。關(guān)鍵品質(zhì)功能基因是如何表達調(diào)控的，它們之間又是如何相互作用的，溫度與光周期等環(huán)境因素是如何影響它們的表達，解決這些品質(zhì)性狀形成調(diào)控機制的問題是培育優(yōu)質(zhì)品種和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蔬菜產(chǎn)品的理論基礎與技術(shù)支撐。通過對上述兩個關(guān)鍵科學問題的深入研究，探索在全基因組序列基礎上闡明優(yōu)質(zhì)關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)、功能和互作效應及調(diào)控機制，在此基礎上建立現(xiàn)有主要蔬菜品質(zhì)改良全基因組分子設計的理論和方法體系，將提升我國蔬菜品質(zhì)育種的水平，為推動蔬菜產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級提供科學依據(jù)。（二）

3、主要研究內(nèi)容為了保證在有限方向進行重點突破，本項目針對生產(chǎn)中存在的白菜和甘藍未熟抽薹、結(jié)球不緊實和裂球問題、黃瓜和番茄的畸形果和裂果問題，以及黃瓜清香味缺乏和苦味發(fā)生的問題，集中力量研究白菜和甘藍葉球形成、黃瓜和番茄果實形成，以及黃瓜風味形成的遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制，并在此基礎上建立這些蔬菜品質(zhì)改良的全基因組分子設計體系。主要包括以下三大內(nèi)容：蔬菜商品和風味品質(zhì)性狀形成的遺傳構(gòu)成在白菜、甘藍、黃瓜、番茄的全基因組序列基礎上，利用核心種質(zhì)資源和現(xiàn)有主要親本的重測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建這些蔬菜的全基因組遺傳變異圖譜；繼而利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）確定白菜和甘藍葉球的形態(tài)建成、黃瓜和番茄果實的形態(tài)建成，

4、以及黃瓜苦味和清香味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵遺傳位點。在確定關(guān)鍵遺傳位點的基礎上，構(gòu)建重組自交系、近等基因系等分離群體，利用圖位克隆和候選基因等方法分離控制葉球、果實形成和風味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，并利用突變體和轉(zhuǎn)基因方法鑒定這些關(guān)鍵基因的功能。蔬菜商品和風味品質(zhì)性狀形成的基因表達與調(diào)控機制在關(guān)鍵基因分離和鑒定的基礎上，通過功能基因組學、分子生物學、生理生化的技術(shù)手段，重點研究蔬菜葉球、果實和風味形成過程中基因的表達調(diào)控模式、基因之間的相互作用，以及環(huán)境因素對其表達的影響，探討品質(zhì)性狀形成的基因調(diào)控途徑。主要蔬菜品質(zhì)改良的全基因組分子設計在全基因組遺傳變異圖譜的基礎上，開發(fā)背景選擇的SNP芯片用于在回交育

5、種和系譜選擇時保留現(xiàn)有主要親本的已有優(yōu)異遺傳背景；在蔬菜品質(zhì)性狀形成的遺傳構(gòu)成與調(diào)控機制研究的基礎上，開發(fā)前景選擇分子標記用于快速導入新基因來定向改良現(xiàn)有主要親本；并將前景背景選擇的分子改良技術(shù)體系與國內(nèi)白菜、甘藍、番茄和黃瓜育種優(yōu)勢單位的育種實踐相結(jié)合，選育優(yōu)質(zhì)新品種。二、預期目標（一）總體目標通過本項目的實施，闡明蔬菜作物產(chǎn)品器官形成和風味物質(zhì)代謝的遺傳構(gòu)成和調(diào)控機制，開發(fā)形成以高通量背景選擇和前景選擇相結(jié)合的品質(zhì)改良全基因組分子設計技術(shù)平臺，大規(guī)模改良現(xiàn)有主要親本，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)，培育有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)新品種，從而實現(xiàn)提升我國蔬菜育種的自主創(chuàng)新能力和核心競爭力，保障我國蔬菜產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級

6、提供科學支撐的總體目標。（二）五年預期目標（1）揭示白菜、甘藍、黃瓜及番茄遺傳變異的主要形式，建立這些主要蔬菜作物的全基因組遺傳變異圖譜，每種蔬菜至少鑒定100萬個SNP位點和10萬個SV位點，為解析多基因控制性狀的遺傳構(gòu)成提供基礎工具，也為分子改良所需的背景選擇SNP芯片的設計提供技術(shù)依據(jù)。（2）闡明白菜和甘藍葉球形成的遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制，揭示小RNA在葉球發(fā)育中的重要地位，分離和鑒定34個控制葉球形成的關(guān)鍵基因，探明這些關(guān)鍵基因如何與誘發(fā)環(huán)境因素互作來控制未熟抽薹、裂球和結(jié)球不緊實。（3）闡明黃瓜和番茄果實形成的遺傳構(gòu)成和調(diào)控機制，分離和鑒定34個控制果實形成的關(guān)鍵基因，探明這些關(guān)鍵基

7、因如何與誘發(fā)環(huán)境因素互作來控制裂果、畸形發(fā)育。（4）闡明黃瓜黃瓜風味形成的遺傳構(gòu)成和代謝調(diào)控機制，分離和鑒定34個控制黃瓜葫蘆素（苦味物質(zhì)）和壬二烯醛（清香味物質(zhì)）等風味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因。（5）建立主要蔬菜品質(zhì)改良全基因組分子設計的理論和技術(shù)體系，包括根據(jù)全基因組遺傳變異圖譜開發(fā)的背景選擇SNP芯片和根據(jù)上述商品和風味品質(zhì)性狀遺傳機理研究結(jié)果開發(fā)的前景選擇分子標記；系統(tǒng)改良現(xiàn)有主要親本，培育有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)新品種。創(chuàng)制40份優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)，培育出5 8個優(yōu)質(zhì)新品種或組合。（6）凝聚和培養(yǎng)一支蔬菜基因組學、分子遺傳及育種的創(chuàng)新團隊，培養(yǎng)一批有國際影響的中青年學科帶頭人和學術(shù)骨干，培養(yǎng)60 80

8、名研究生和10 15名博士后。豐富和發(fā)展我國蔬菜品質(zhì)育種的科學理論與實踐，提升我國蔬菜育種界的源頭創(chuàng)新和集成創(chuàng)新能力。（7）發(fā)表核心刊物論文150篇以上，SCI論文80篇以上，其中影響因子高于5的論文10篇以上；申請專利20 30項。三、研究方案（一）總體學術(shù)思路和技術(shù)途徑本項目針對生產(chǎn)中存在的蔬菜商品品質(zhì)和風味品質(zhì)的突出問題，選取全基因組序列已經(jīng)測定、常規(guī)育種基礎好的大宗蔬菜白菜、甘藍、黃瓜和番茄為研究對象，從與商品和風味品質(zhì)密切相關(guān)的產(chǎn)品器官形成和風味物質(zhì)代謝調(diào)控的生物學過程入手，深入蔬菜重要品質(zhì)性狀形成的遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制，建立品質(zhì)改良的全基因組分子設計的理論和方法體系，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)新材

9、料，培育優(yōu)質(zhì)新品種，力圖實現(xiàn)“從基因組到品種”的整體構(gòu)想。針對品質(zhì)性狀形成遺傳構(gòu)成的關(guān)鍵科學問題（科學問題1），在基因組框架圖的基礎上，利用核心資源和現(xiàn)有主要親本重測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建全基因組遺傳變異圖譜；結(jié)合對重要品質(zhì)性狀的詳細調(diào)查和分析，確定控制葉球形成、果實形成和風味形成的關(guān)鍵遺傳位點；結(jié)合圖位克隆、候選基因分析、突變體分析和轉(zhuǎn)基因驗證等技術(shù)手段，分離和鑒定品質(zhì)性狀形成的關(guān)鍵基因，回答哪些基因控制了品質(zhì)性狀形成的科學問題。針對品質(zhì)性狀形成基因調(diào)控機制的關(guān)鍵科學問題（科學問題2），選擇已經(jīng)詳細鑒定過表型的自然和人工突變體以及轉(zhuǎn)基因材料，對葉球和果實的不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄組（包括小

10、RNA）進行分析，從全基因組水平確定與關(guān)鍵基因共表達或者反向表達的基因集，構(gòu)建關(guān)鍵基因的表達網(wǎng)絡；不少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的形態(tài)建成基因是轉(zhuǎn)錄因子，項目將確定參與葉球和果實形成轉(zhuǎn)錄因子的下游受控基因；通過酵母雙雜交等技術(shù)手段確定與關(guān)鍵基因有蛋白互作的基因；通過突變體的遺傳分析，確定關(guān)鍵基因的上下游基因，確定其信號傳導途徑；分析風味形成基因參與的代謝網(wǎng)絡；綜合上述分析手段，探明葉球和果實形成和風味物質(zhì)代謝的基因調(diào)控機制。利用上述研究中關(guān)鍵基因的序列開發(fā)前景選擇分子標記，為現(xiàn)有主要親本的定向品質(zhì)改良提供選擇工具；利用全基因組遺傳變異圖譜開發(fā)背景選擇SNP芯片，用于在育種中保持現(xiàn)有主要親本的良好遺傳背景；并且將

11、這套全基因組分子設計的技術(shù)體系應用在優(yōu)質(zhì)新品種培育的實踐上，實現(xiàn)“從基因組到品種”的戰(zhàn)略構(gòu)想。上述研究將為蔬菜品種改良的國家支撐計劃和“863”等科技計劃的順利實施提供依據(jù)與支撐，為蔬菜學學科體系的發(fā)展提供新理論、新技術(shù)與新方法?？傮w學術(shù)思路和技術(shù)途徑如下圖（圖1）所示：圖1. 總體學術(shù)思路與主要技術(shù)途徑（二）創(chuàng)新點與特色（1）以國家重大需求為導向：本項目以大面積種植的白菜、甘藍、番茄和黃瓜為主要研究對象，針對生產(chǎn)中亟待解決的未熟抽薹、裂球裂果、風味不佳等商品和風味品質(zhì)問題，緊密圍繞產(chǎn)品器官形成和風味物質(zhì)代謝的遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制的關(guān)鍵科學問題，進行深入的研究。這些均屬推動優(yōu)質(zhì)蔬菜品種國產(chǎn)化

12、、實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級中亟待解決的重大科學問題，體現(xiàn)了國家的重大需求。（2）以多基因控制品質(zhì)性狀的遺傳構(gòu)成為科學突破口：蔬菜的商品和風味品質(zhì)性狀是由多基因控制的，其遺傳構(gòu)成的問題是蔬菜學科多年來沒有得到有效解決的難題。人類復雜疾病的研究表明，基因組序列是解析復雜性狀遺傳的必須工具。在本項目研究的四種蔬菜中，黃瓜、白菜和甘藍的基因組框架圖都是由項目申請單位主導完成的，并且也基本完成了核心資源的重測序工作，這使得本項目團隊在研究蔬菜品質(zhì)性狀遺傳構(gòu)成上取得了先機，有可能實現(xiàn)重大突破。（3）以葉球形態(tài)建成的基因調(diào)控機制為理論突破口：以往對植物的研究大多以擬南芥和水稻等模式植物為實驗材料，蔬菜作物產(chǎn)品器官的

13、形態(tài)和生理特性與模式植物有很大區(qū)別，其遺傳基礎和基因表達調(diào)控的機制有其自身的特點。前期研究發(fā)現(xiàn)一批新的與白菜葉球形態(tài)建成有關(guān)的miRNA和功能基因，本項目將在基因組框架圖的基礎上，對miRNA的靶標位點和已知功能基因的表達調(diào)控網(wǎng)絡進行新穎細致的分析，提出葉球發(fā)育遺傳調(diào)控的新理論。（4）以假說和數(shù)據(jù)聯(lián)合驅(qū)動為科學方法論：生物學研究主要依賴假說驅(qū)動的科學方法論，即根據(jù)已有的知識建立工作假說、設計實驗加以驗證。測序技術(shù)的飛速發(fā)展導致海量基因組（包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、甲基化等）數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，數(shù)據(jù)驅(qū)動的科學方法論（通過生物信息學尋找基因組數(shù)據(jù)自身的規(guī)律）將發(fā)揮更大的輔助作用。兩種方法論的互補將導致大量的科學

14、發(fā)現(xiàn)，這一點在現(xiàn)代物理學研究中已經(jīng)得到驗證。在本項目中將采用假說和數(shù)據(jù)聯(lián)合驅(qū)動的科學方法論，研究內(nèi)容1主要通過基因組數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，屬于數(shù)據(jù)驅(qū)動；研究內(nèi)容2主要通過對葉球和果實形成以及風味物質(zhì)代謝的已有知識進行總結(jié)和歸納，提供新的工作假說，進行驗證，屬于假說驅(qū)動。兩種方法論穿插交織在整個研究過程中，將會得到新的科學發(fā)現(xiàn)。（5）以“從基因組到品種”為產(chǎn)業(yè)突破口：DNA測序成本的快速降低為農(nóng)業(yè)基因組學的研究和應用帶來歷史性的機遇，如何利用基因組學的方法手段加快育種進程是目前農(nóng)業(yè)科研界面臨的共同難題。本項目在主要蔬菜全基因組測序已經(jīng)完成的基礎上，將前沿的基因組學及生物信息學與蔬菜育種實踐

15、緊密聯(lián)系起來，利用白菜、黃瓜和番茄等蔬菜生命世代短（34個月）和國內(nèi)遺傳育種基礎較好的優(yōu)勢，開發(fā)品質(zhì)改良的全基因組分子設計技術(shù)體系，培育優(yōu)質(zhì)新品種, 為產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級提供科學和技術(shù)支撐。（三）取得重大突破的可行性分析（1）研究目標明確，立論依據(jù)充分圍繞國家重大需求和學科前沿，瞄準蔬菜品質(zhì)育種必須解決的兩大基礎科學問題，開展本項研究。借鑒了國內(nèi)外大田作物和模式生物研究多基因控制性狀的最新成果和進展，具有可靠的立論依據(jù)。（2）研究材料完備，方法成熟先進項目申請單位是國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫的依托單位，擁有近一萬份白菜、甘藍、黃瓜和番茄種質(zhì)資源，前期已經(jīng)對資源進行初步的品質(zhì)性狀調(diào)查，從中發(fā)掘和培育出一批

16、具備優(yōu)異品質(zhì)性狀的種質(zhì)資源，并已構(gòu)建了各種分離群體（包括近等基因系、重組自交系群體等），黃瓜和番茄的突變體群體也基本完成，為后續(xù)遺傳分析和基因鑒定帶來了很大的便利。項目綜合采用基因組學、生物信息學、群體遺傳學、分子生物學等學科的最新技術(shù)，方法成熟、先進。 （3）研究基礎堅實，隊伍精干合理項目團隊先后組織完成了黃瓜、白菜和甘藍基因組測序，并參與了番茄基因組測序，基本確立了我國在蔬菜基因組學領域的暫時領先地位?；蚪M學的優(yōu)勢為我國在蔬菜分子遺傳學的發(fā)展打下了很好的基礎，先后構(gòu)建了多張蔬菜分子標記連鎖遺傳圖譜，其中黃瓜圖譜是葫蘆科首張遺傳細胞遺傳整合圖譜，包含近1000個SSR標記。項目團隊已經(jīng)分離

17、鑒定或精細定位了多個蔬菜產(chǎn)品器官形成和風味代謝的關(guān)鍵基因。實現(xiàn)了不同學科的交叉和融合，集中了中國農(nóng)業(yè)科學院、中國科學院、上海交大、中國農(nóng)大、南京農(nóng)大等相關(guān)重點科研院校在本領域的優(yōu)秀人才，組成了精干、高效、務實的研究團隊，為本項目的順利完成提供了人才保障。團隊配置體現(xiàn)了“從基因組到品種”整體構(gòu)想的需要，既有從事基因組學和分子生物學的中青年科技骨干，也有具備多年田間實踐經(jīng)驗的育種專家。（4）支撐體系強大，國際合作密切依托國家蔬菜改良中心和4個密切相關(guān)的國家重點實驗室及多個部門重點開放實驗室，擁有較好的研究條件和設備，為本項研究提供了堅實的物質(zhì)基礎?！笆晃濉逼陂g，項目主持單位主辦了多次葫蘆科和十字

18、花科基因組國際研討會，在蔬菜基因組學領域具有廣泛的國際影響。例如，2008年11月舉辦的“國際葫蘆科基因組學和生物學會議”吸引了美國康奈爾大學、威斯康星大學、西班牙農(nóng)科院、日本蔬菜茶葉研究所、澳大利亞多態(tài)性芯片技術(shù)中心等多家知名大學和科研機構(gòu)參加。這些學術(shù)活動一方面能及時獲取國外最新學術(shù)思路、技術(shù)和資源，另一方面為國際合作奠定基礎，獲得一批有重要理論和應用價值的成果。2013年項目申請單位（中國農(nóng)業(yè)科學院和中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所）將舉辦“國際茄科基因組大會”，估計將有200多名國際同行和300多名國內(nèi)同行參加。這種密切的國際合作為本項目的研究提供了國際視野，也提升了我國科學研究在國際

19、的影響力。（四）課題設置基于項目擬達到的總體目標，以“蔬菜商品和風味品質(zhì)性狀形成的遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制”的關(guān)鍵科學問題為切入點，共設置6個研究課題。課題1 蔬菜品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析蔬菜品質(zhì)性狀是多基因控制性狀，而全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是研究多基因性狀的有力手段。全基因組遺傳變異圖譜，是GWAS的必需“藍圖”。本課題重點開展以下研究：1 主要研究內(nèi)容種質(zhì)資源品質(zhì)性狀的觀察分析：對白菜、甘藍、黃瓜和番茄種質(zhì)資源的品質(zhì)性狀，包括白菜和甘藍的結(jié)球習性和緊實度、未熟抽薹和裂球率，黃瓜瓜把長度、畸形果率，番茄果實形狀、大小、畸形果率、裂果率，黃瓜果實苦味和清香味等風味物質(zhì)的化學成份等，進行觀察

20、測定。全基因組遺傳變異圖譜構(gòu)建：在白菜、甘藍、黃瓜、番茄的全基因組序列基礎上，利用不同種質(zhì)資源的重測序數(shù)據(jù)，定位所有SNP位點和結(jié)構(gòu)變異位點（Structural variation, SV），確定全基因組范圍內(nèi)的連鎖不平衡區(qū)塊。全基因組關(guān)聯(lián)分析： 在性狀調(diào)查和全基因組變異圖譜的基礎上，通過關(guān)聯(lián)分析，確定白菜、甘藍葉球的形態(tài)建成、黃瓜和番茄果實的形態(tài)建成，以及黃瓜苦味和清香味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵遺傳位點。2. 研究目標創(chuàng)建白菜、甘藍、黃瓜和番茄的全基因組遺傳變異圖譜，包含至少100萬個SNP標記和5萬個SV標記，確定控制葉球、果實形成、風味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵遺傳位點，為關(guān)鍵基因的分離和鑒定提供候選基因。

21、課題承擔單位：中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 北京師范大學 浙江大學課題負責人：黃三文研究員學術(shù)骨干：林魁，曹家樹，張忠華， 程峰經(jīng)費比例：18.6%課題2 蔬菜品質(zhì)性狀形成關(guān)鍵基因的分離與鑒定關(guān)鍵基因的克隆是研究其互作、調(diào)控機制的前提。在確定關(guān)鍵遺傳位點的基礎上，針對性狀表現(xiàn)選擇用于精細遺傳作圖的重組自交系、近等基因系等分離群體，通過圖位克隆和候選基因等方法分離控制白菜和甘藍葉球、黃瓜和番茄果實形成，以及黃瓜風味物質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，并利用突變體和轉(zhuǎn)基因方法鑒定這些關(guān)鍵基因的功能。1 主要研究內(nèi)容白菜和甘藍葉球形成的關(guān)鍵基因分離和鑒定：利用白菜類蔬菜和甘藍類蔬菜亞種間豐富的形態(tài)變異，在大白菜和甘

22、藍基因組框架圖的基礎上，對其它亞種進行重測序，結(jié)合圖位克隆和轉(zhuǎn)基因鑒定，克隆甘藍和白菜葉球形態(tài)建成的關(guān)鍵基因；利用擬南芥已知的開花控制基因作為候選基因的目標，克隆甘藍和白菜控制抽薹開花的關(guān)鍵基因。黃瓜果實形態(tài)性狀關(guān)鍵基因的分離與鑒定：利用多種遺傳群體材料，構(gòu)建飽和度高的遺傳連鎖圖，對黃瓜果實外觀品質(zhì)形成有關(guān)的農(nóng)藝性狀，包括黃瓜瓜把長短、畸形果率、果皮光澤和薄厚、種子腔直徑、果肉厚度等，進行精細定位，結(jié)合課題1的基因組關(guān)聯(lián)分析以及突變體分析和轉(zhuǎn)基因驗證，克隆包括主要瓜把長度主效QTL（)在內(nèi)的關(guān)鍵基因。番茄果實形成的關(guān)鍵基因分離和鑒定：通過圖位克隆技術(shù)分離控制番茄果實大小的RG基因、控制果實形狀

23、的PST基因，以及從課題1 得到的主效QTL。利用轉(zhuǎn)基因互補實驗、過量表達和RNAi基因表達抑制等技術(shù)手段來鑒定這些基因在果實生長中的功能，重點分析其在引起畸形果、裂果等不正常果中的作用。黃瓜風味形成關(guān)鍵基因的分離與鑒定：通過圖位克隆技術(shù)分離黃瓜苦味形成的關(guān)鍵基因Bi和Bt；在課題1關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，通過圖位克隆和候選基因相結(jié)合的方法，鑒定黃瓜清香味形成中壬二烯醛代謝的關(guān)鍵酶基因。2. 研究目標通過圖位克隆、候選基因法、突變體分析和轉(zhuǎn)基因驗證，分離和鑒定56個控制葉球和果實形態(tài)的關(guān)鍵基因以及34個控制黃瓜風味品質(zhì)的關(guān)鍵基因，為后續(xù)基因調(diào)控網(wǎng)絡研究打下基礎。課題承擔單位：上海交通大學 西南大學 中

24、國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 中國農(nóng)業(yè)大學 揚州大學課題負責人：蔡潤教授學術(shù)骨干：王小佳，楊文才，陳學好，王保經(jīng)費比例：16.0%課題3 大白菜和甘藍葉球形成的基因表達調(diào)控機制大白菜和甘藍葉球的形態(tài)建成取決于一系列基因的時空表達和調(diào)控作用。針對生產(chǎn)中出現(xiàn)的未熟抽薹、結(jié)球不緊實、裂球等問題，本課題將研究葉球形態(tài)建成相關(guān)基因的生物學功能，探討這些關(guān)鍵基因如何調(diào)節(jié)葉卷曲和葉球形成的遺傳機制，以及誘發(fā)環(huán)境因素如何調(diào)控這些關(guān)鍵基因的表達。重點開展以下研究： 主要研究內(nèi)容白菜和甘藍葉球形成的轉(zhuǎn)錄組分析：選擇已經(jīng)詳細鑒定過表型的白菜和甘藍自然和人工突變體以及轉(zhuǎn)基因材料，對葉球的不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件

25、下的轉(zhuǎn)錄組（包括小RNA）進行分析，從全基因組水平確定與關(guān)鍵基因共表達或者反向表達的基因集，構(gòu)建關(guān)鍵基因的表達網(wǎng)絡，研究其時空表達模式以及基因間的相互作用，闡明溫度和光周期等環(huán)境條件調(diào)控葉球商品性狀的分子機制。白菜葉球形成相關(guān)基因?qū)Y(jié)球性狀的調(diào)控作用：根據(jù)突變體和轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)表現(xiàn)，研究目的基因?qū)θ~球發(fā)生時間、成熟速度、緊實度、形狀、大小和整齊度等商品品質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。比較葉球形成相關(guān)基因在不結(jié)球、結(jié)球不緊實和易裂球基因型與正常植株上表達水平上的差異，分析不結(jié)球、結(jié)球不緊實和易裂球的原因。白菜葉球形態(tài)發(fā)生和發(fā)育過程中miRNA介導的基因調(diào)控：在基因調(diào)控的不同層次上，研究miRNA基因表達的激活

26、或失活、miRNA合成途徑改變、miRNA靶基因的突變等對白菜葉球形態(tài)的影響，闡明基因沉默對白菜葉卷曲的調(diào)控作用。白菜和甘藍未熟抽薹的基因調(diào)控機制：比較易抽薹與耐抽薹自交系葉球形成相關(guān)基因在表達水平上的差異，分析未熟抽薹和不結(jié)球的原因。構(gòu)建白菜控制抽薹關(guān)鍵基因的近等基因系，通過關(guān)鍵基因的不同組合，研究關(guān)鍵基因之間互做在抽薹調(diào)控中的作用。2. 預期研究目標闡明大白菜和甘藍葉球大小和形狀等商品品質(zhì)形成的遺傳機理，揭示小RNA在葉球形態(tài)建成中的作用機制，探明造成不結(jié)球、裂球和未熟抽薹的分子機制，為遺傳上改良葉球形成及其商品品質(zhì)提供科學依據(jù)。課題承擔單位：中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所

27、 南京農(nóng)業(yè)大學課題負責人：何玉科研究員學術(shù)骨干：侯喜林，倪迪安，孫傳寶，李英經(jīng)費比例：17.3%課題4黃瓜、番茄果實形成的的分子遺傳與調(diào)控機制果實形成是由復雜的分子遺傳調(diào)控網(wǎng)絡決定的，且受各類植物激素精細調(diào)控及環(huán)境的影響，深刻解析果實形成的分子遺傳基礎和調(diào)控機制是實現(xiàn)分子設計育種的關(guān)鍵。針對生產(chǎn)中出現(xiàn)的果實畸形發(fā)育（包括黃瓜瓜把過長）和裂果等問題，本課題以黃瓜和番茄為研究對象，系統(tǒng)研究單性結(jié)實、果實大小與形狀和外觀品質(zhì)等果實形成的重要性狀的分子遺傳與調(diào)控機制，重點開展如下研究：主要研究內(nèi)容黃瓜和番茄果實形成的轉(zhuǎn)錄組分析：選擇已經(jīng)詳細鑒定過表型的黃瓜和番茄自然和人工突變體以及轉(zhuǎn)基因材料，對果實的

28、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄組（包括小RNA）進行分析，從全基因組水平確定與關(guān)鍵基因共表達或者反向表達的基因集，構(gòu)建關(guān)鍵基因的表達網(wǎng)絡。黃瓜果實形成中單性結(jié)實果實發(fā)育的分子遺傳基礎：生產(chǎn)中黃瓜雌性系的應用越來越廣泛，要求品種有很好的單性結(jié)實能力才能避免畸形果的發(fā)生。以重組自交系、雜交F2:3為材料構(gòu)建黃瓜單性結(jié)實的遺傳圖譜并進行QTL精細定位。通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組學間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘控制單性結(jié)實黃瓜果實發(fā)育的關(guān)鍵基因；分析這些基因的時空表達情況和體外生化特征，確定控制黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育的關(guān)鍵基因。完成相關(guān)基因的克隆和功能研究，闡明黃瓜單性結(jié)實的分子遺傳與調(diào)控機制。黃瓜果實重要商品性狀的分

29、子遺傳與調(diào)控機制：利用重組自交系、雜交F2、回交BC1、近等基因系等群體材料鑒定控制黃瓜果瘤大小和果實形狀的主效QTL位點或關(guān)鍵基因，克隆相關(guān)候選基因，分析這些基因的時空表達特性。并結(jié)合雙突變體的構(gòu)建、酵母雙雜交等手段，解析果形調(diào)控關(guān)鍵基因之間在遺傳、體外生化功能方面的互作關(guān)系。分析這些基因的時空表達特征；闡明這些重要功能基因的作用模式及調(diào)控機制。利用新泰密刺黃瓜（長瓜把）與印度野生黃瓜（無瓜把）的重組自交系群體，以及華北類型黃瓜II25A0337（長瓜把）和美國類型黃瓜CGN20898（短瓜把）的雜交群體，精細定位和克隆調(diào)控瓜把長度的主效和微效基因。在不同環(huán)境條件下（如低溫，弱光），對所獲得

30、的瓜把長度主效基因的時空表達特性進行分析。并通過突變庫（TILLING）的篩選，研究分析環(huán)境因素對瓜把長度主效基因突變體的表現(xiàn)型、RNA和蛋白水平的影響，探索瓜把長度主效基因與環(huán)境因素之間的的分子影響機制。番茄畸形果和裂果形成的基因調(diào)控機制：通過數(shù)量遺傳學、分子遺傳學的方法手段來鑒定和分離控制番茄果實大小和形狀的新功能基因或QTL位點RG和PST，重點分析引起畸形果、裂果等不正常果形成的突變位點，解析其分子遺傳基礎及基因的時空表達特征；借助轉(zhuǎn)基因方法對所獲得的調(diào)控基因進行植物體內(nèi)功能確證，闡明RG和PST控制果實大小和形狀的細胞學基礎；通過細胞生物學、生物化學和組學等技術(shù)手段來解析重要果實生長

31、發(fā)育調(diào)控基因RG和PST的調(diào)控網(wǎng)絡。研究目標闡明黃瓜單性結(jié)實性狀、果瘤大小、果實形狀和番茄果實大小、形狀的分子遺傳和調(diào)控機制，獲得調(diào)控黃瓜單性結(jié)實形成、果瘤大小、果實形狀和番茄果實大小、形狀的重要功能基因，并明確它們的生物學功能；獲得調(diào)控番茄果實生長發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建番茄果實生長發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡，探明相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控番茄果實形成的機理；揭示小RNA在果實形態(tài)建成中的作用機制。課題承擔單位：南京農(nóng)業(yè)大學 中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所 中國農(nóng)業(yè)大學 上海交通大學課題負責人：陳勁楓教授學術(shù)骨干：肖晗，張小蘭，婁群峰，潘俊松經(jīng)費比例：16.0%課題5黃瓜風味性狀形成的分子遺傳

32、與代謝調(diào)控機制蔬菜風味品質(zhì)是復雜次生代謝物的綜合體現(xiàn)，代謝網(wǎng)絡中涉及眾多的控制以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，而且種類繁多的次生代謝物與植物抗病性也關(guān)系密切。針對生產(chǎn)中黃瓜清香味淡且偶有苦味發(fā)生的問題，本項目以黃瓜風味物質(zhì)的化學物質(zhì)定性與定量分析為起始點，針對黃瓜清香味和苦味物質(zhì)等風味品質(zhì)性狀形成的分子遺傳及代謝調(diào)控，重點開展如下研究。1 主要研究內(nèi)容風味性狀評價體系和化學數(shù)據(jù)庫建立：利用以質(zhì)譜為基礎的代謝組學分析平臺對不同黃瓜種質(zhì)資源、不同的分離群體和近等基因系，在不同的生長條件下和不同的發(fā)育階段的風味物質(zhì)或其前體進行定性和定量的分析；建立風味評價的標準體系及其與次生代謝物之間的關(guān)聯(lián)信息；研究將積累代謝

33、物的高分辨質(zhì)譜、同位素模式，多級質(zhì)譜及含量分布等方面的信息，構(gòu)建和完善黃瓜特異的化合物數(shù)據(jù)庫。黃瓜清香味物質(zhì)形成關(guān)鍵基因的功能分析：通過不同親本間的轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘控制黃瓜風味物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因；分析這些基因的時空表達和體外生化特征，確定參與清香味風味物質(zhì)形成及轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵基因；利用所獲得結(jié)構(gòu)基因的啟動子序列和酵母單雜交等生化手段，結(jié)合基因-代謝物相關(guān)性信息確定參與相關(guān)代謝途徑的調(diào)控基因；通過轉(zhuǎn)基因的方法對所獲得的調(diào)控基因的體內(nèi)功能進行確證，解析它們與清香風味物質(zhì)合成的關(guān)系。 黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素合成和轉(zhuǎn)運關(guān)鍵基因的功能分析：克隆相關(guān)候選基因，分析基因表達的時空特異性，在酵母等體

34、外表達系統(tǒng)中驗證其生化功能，并在酵母體系中重組葫蘆素的代謝合成途徑；確定葫蘆素合成代謝途徑的調(diào)控和轉(zhuǎn)運基因，通過分析相關(guān)突變體驗證其體內(nèi)功能。 野生種抗病砧木嫁接對黃瓜果實風味品質(zhì)性狀的影響及分子調(diào)控機制：研究葫蘆科野生種抗病砧木對黃瓜果實次生代謝物質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運及積累過程的影響效應，克隆、驗證相關(guān)候選基因，探討果實風味品質(zhì)性狀與抗病性表達或信號調(diào)控的相互關(guān)系，以及病理感應、傳遞或抗病分子的調(diào)控機理。2研究目標闡明黃瓜苦味、清香味生成的關(guān)鍵步驟和調(diào)控機理，獲得與葫蘆素形成和轉(zhuǎn)運相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因，明確其生物學功能。獲得調(diào)控代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子，并在轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學水平系統(tǒng)闡明這些轉(zhuǎn)錄因子在

35、整個代謝網(wǎng)絡中的位置和作用，探明抗病砧木嫁接對接穗風味品質(zhì)的影響機制。課題承擔單位：中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所、首都師范大學課題負責人：王國棟研究員學術(shù)骨干：謝丙炎、李樂攻、金治平經(jīng)費比例：13.5%課題6 主要蔬菜品質(zhì)改良的全基因組分子設計充分利用上述各研究課題的成果，開發(fā)可用于對蔬菜商品品質(zhì)和風味品質(zhì)進行綜合改良的分子標記輔助選擇工具和育種程序，是實現(xiàn)本項目基礎研究成果轉(zhuǎn)化為實用技術(shù)的關(guān)鍵。本課題以白菜、甘藍、黃瓜和番茄為對象，進行分子育種工具與技術(shù)的開發(fā)。重點開展如下研究：1主要研究內(nèi)容高密度分子標記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)研發(fā)：根據(jù)白菜、甘藍、黃瓜和番

36、茄等蔬菜作物重測序數(shù)據(jù)庫和功能基因組分析信息，篩選一批穩(wěn)定可靠的分子標記，使用Illumina芯片系統(tǒng)或其它先進標記檢測系統(tǒng)開發(fā)一套穩(wěn)定、高效的高密度分子標記檢測體系。以此為基礎，通過對核心育種材料的分析，篩選出多態(tài)性豐富、檢測穩(wěn)定、在基因組中分布均勻的SNP、InDel或SSR等標記，用于追蹤優(yōu)良親本背景。前景選擇標記系統(tǒng)開發(fā)：針對白菜/甘藍、黃瓜和番茄等蔬菜作物，應用高密度分子標記檢測方法，進行重要品種資源和特定遺傳群體分析，篩選出適于如下三個方面性狀篩選的前景選擇標記：1）白菜/甘藍耐抽薹性、富含有益硫甙、早熟性和根腫病抗性；2）黃瓜果實刺瘤的有無、果皮的薄厚、果把長短、種子腔直徑、苦澀

37、、清香味、抗霜霉病、抗白粉病選擇的前景標記；3）番茄果實大小、皮薄厚、固形物多少。品質(zhì)改良全基因組分子育種策略研究：根據(jù)白菜、甘藍、黃瓜和番茄等蔬菜品質(zhì)性狀在自交、回交、雜交和復交等不同分離群體中分離規(guī)律。建立通過分子標記進行前景和背景選擇高效聚合分散在不同親本材料中的大量目標基因的育種策略與技術(shù)方案。優(yōu)質(zhì)新材料創(chuàng)制和優(yōu)質(zhì)新品種培育：在實際育種過程根據(jù)全基因組分子設計，針對白菜、甘藍、黃瓜和番茄商品品質(zhì)和風味品質(zhì)進行綜合改良，獲得一批耐抽薹和抗裂球的、高產(chǎn)抗病的白菜和甘藍新材料和新品種，獲得一批果形好、清香味濃、無苦味的、高產(chǎn)抗病的黃瓜新材料和新品種，獲得一批抗裂果、畸形果率低、高產(chǎn)抗病的番茄

38、新材料和新品種。2預期研究目標構(gòu)建高效的前景與背景篩選系統(tǒng)，建立品質(zhì)改良的全基因組分子設計理論和方法體系；對現(xiàn)有主要親本的品質(zhì)性狀缺陷進行改良，創(chuàng)制40份優(yōu)質(zhì)新材料，培育出58個優(yōu)質(zhì)新品種或組合。課題承擔單位：中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心課題負責人：王曉武研究員學術(shù)骨干：方智遠院士，杜永臣，孫日飛，顧興芳，張鳳蘭經(jīng)費比例：18.6%（五）課題間相互關(guān)系本項目的各項研究是在研究對象白菜、甘藍、黃瓜和番茄基因組框架圖已經(jīng)構(gòu)建完成的基礎上進行，將充分利用基因組資源對兩個科學問題（遺傳構(gòu)成和調(diào)控機制）進行深入研究，并構(gòu)建品質(zhì)性狀分子改良的技術(shù)基礎（圖2）。由于蔬菜作物不同

39、品質(zhì)性狀的遺傳構(gòu)成研究具有共性，設置全基因組關(guān)聯(lián)分析（課題1）和關(guān)鍵基因分離鑒定（課題2）兩個課題，關(guān)聯(lián)分析所確定的關(guān)鍵遺傳位點是關(guān)鍵基因克隆的基礎；在基因調(diào)控機制的研究上，葉球形成屬于營養(yǎng)器官的發(fā)育過程（課題3），果實形成屬于生殖器官的發(fā)育過程（課題4），而風味形成屬于次生代謝過程（課題5），各俱特色，因此各設定一個課題深入研究；兩個科學問題的研究之間也有很多信息的交互。承接前5個課題的科學發(fā)現(xiàn)，開發(fā)前景選擇和背景選擇技術(shù)平臺，建立品質(zhì)改良的全基因組分子設計的理論和方法體系，預期將產(chǎn)出新育種技術(shù)、新育種材料和新優(yōu)質(zhì)品種（組合）。圖2. 課題設置及其關(guān)系四、年度計劃研究內(nèi)容預期目標第一年種質(zhì)資

40、源品質(zhì)性狀調(diào)查和測定，構(gòu)建品質(zhì)性狀表型數(shù)據(jù)庫。篩選種質(zhì)資源材料和親本材料，準備重測序。白菜和甘藍葉球形成不同時期的基因表達譜分析；甘藍葉球形成相關(guān)基因的篩選；白菜和甘藍抽薹開花關(guān)鍵基因的克隆與MIKC結(jié)構(gòu)域等生物信息學分析。分離與大白菜葉球形態(tài)發(fā)生和未熟抽薹有關(guān)的基因和表觀遺傳因子。生長素和細胞分裂素等內(nèi)源激素對葉卷曲和葉球形態(tài)發(fā)生進程的影響。大白菜中過表達或沉默幾個重要的miRNA或靶基因。大白菜葉卷曲和葉球形成的純合突變體基因芯片分析和轉(zhuǎn)錄組分析。 利用黃瓜遺傳群體，對黃瓜瓜把長短和果肉厚度進行精細定位。在黃瓜上對 HAN，CLV1， CLV3，YODA，ANT進行同源克隆；利用RT-PC

41、R和RNA原位雜交等技術(shù)，分析果形相關(guān)基因的時空表達特性。通過比較初步確定黃瓜果瘤Tu候選基因，開發(fā)共分離標記，并進行Tu候選基因的功能分析。黃瓜單性結(jié)實遺傳群體構(gòu)建及遺傳規(guī)律分析。黃瓜苦味形成基因的精細定位?？寺↑S瓜LOX，ADH，HPL等清香味物質(zhì)合成相關(guān)基因。構(gòu)建分離群體，對番茄黃果形成基因r進行精細定位，對紫果形成基因（未知基因）和高番茄紅素含量基因（未知基因）進行初步定位。在番茄上精細定位番茄RG和PST基因，確定PST候選基因及其突變位點；完善RG和PST基因的NILs構(gòu)建。對具有不同代表性的黃瓜品種進行全面的化學物質(zhì)分析；克隆和分析黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子序列

42、。高密度分子標記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)研發(fā)：根據(jù)白菜、甘藍、黃瓜和番茄等蔬菜作物重測序數(shù)據(jù)庫和功能基因組分析信息，篩選出多態(tài)性豐富、在基因組中分布均勻的SNP、InDel或SSR等標記。前景選擇標記系統(tǒng)開發(fā)：1）白菜耐抽薹性；2）甘藍葉球顏色；3）黃瓜果實苦味和果實光澤；4）番茄果實大小。構(gòu)建完成白菜、甘藍、黃瓜和番茄的種質(zhì)資源品質(zhì)性狀表型數(shù)據(jù)庫。進一步的重測序準備工作完成。獲取葉球形成和展開不同時期甘藍基因表達譜；分析差異表達基因，篩選出葉球形成相關(guān)基因。獲得白菜和甘藍抽薹關(guān)鍵基因序列及其結(jié)構(gòu)域等生物信息。篩選10個以上控制葉卷曲和葉球形成相關(guān)基因的候選基因，確定不結(jié)球、裂球、未熟抽薹的純合

43、基因型，建立2-3個基因芯片和轉(zhuǎn)錄組分析的數(shù)據(jù)庫。初步完成黃瓜的瓜把長短和果肉厚度等性狀的精細定位。得到黃瓜瓜形調(diào)控關(guān)鍵基因的關(guān)聯(lián)分析、分離與鑒定的初步結(jié)果。篩選獲取黃瓜Tu候選基因，共分離標記驗證。明確黃瓜單性結(jié)實性狀的遺傳特征.完成黃瓜苦味形成基因的精細定位。獲得黃瓜清香味物質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵基因序列。完成對番茄r基因精細定位及控制紫果、提高番茄紅素含量基因的初步定位工作。確定番茄rg位點的精確染色體區(qū)域；獲得pst候選基因及其突變位點。摸索建立適合黃瓜化學物質(zhì)分析的方法體系，初步完成黃瓜特異化合物數(shù)據(jù)庫的建立（包括定性定量的信息），獲得3-5個黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因并進行體外

44、生化分析。高密度分子標記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)研發(fā)：針對白菜、甘藍、黃瓜和番茄，每種作物篩選不少于1536個SNP、InDel或SRR標記，標記分布均勻。前景選擇標記系統(tǒng)開發(fā)：1）白菜：開發(fā)3個耐抽薹主效關(guān)鍵基因選擇標記；2）甘藍：開發(fā)葉球顏色的選擇標記，遺傳距離小于5cM；3）黃瓜：開發(fā)果實無苦味和有光澤選擇標記，遺傳距離小于5cM；4）番茄：開發(fā)番茄果實大小，與目標基因連鎖距離小于2cM。第二年完成篩選材料的重測序，挖掘SNP和SV等遺傳變異位點，連鎖不平衡分析確定連鎖遺傳區(qū)域，并構(gòu)建全基因組遺傳變異圖譜。利用表型數(shù)據(jù)和遺傳變異圖譜進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，確定控制品質(zhì)性狀的關(guān)鍵遺傳位點和候選

45、基因。甘藍和白菜葉球形成相關(guān)基因的克隆及其與葉球形成相關(guān)性分析；控制抽薹開花關(guān)鍵基因的相互作用原核驗證。分離大白菜中與葉球形成相關(guān)的miRNA，并進行過表達或沉默研究。黃瓜瓜把長短和果肉厚度的精細定位，結(jié)合課題1的基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選和預測目標基因的候選基因。分析黃瓜瓜形調(diào)控關(guān)鍵基因的時空表達特性，對這2-4個關(guān)鍵基因進行TILLING突變體庫的篩選，構(gòu)建這2-4個關(guān)鍵基因的過量表達和RNAi誘導缺失突變的載體。黃瓜果瘤Tu候選基因的轉(zhuǎn)基因功能驗證。黃瓜單性結(jié)實性狀的主效QTL定位，并進行黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學研究。黃瓜苦味形成基因的候選基因分析，進一步縮小黃瓜清香味物質(zhì)合成基因的候選

46、區(qū)域。對番茄紫果形成基因和高番茄紅素含量基因進行精細定位，確定候選基因區(qū)域。精細定位番茄RG位點，確定其候選基因及其突變位點。構(gòu)建番茄NILs，轉(zhuǎn)基因功能驗證PST候選基因。繼續(xù)克隆和分析黃瓜苦味物質(zhì)和清香味物質(zhì)形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子序列，對上一年度克隆的關(guān)鍵基因在不同黃瓜品種進行時空表達分析和化學表型相關(guān)分析，進一步完善黃瓜特異化合物數(shù)據(jù)庫地建設。建立SNP（或InDel）標記芯片檢測、高通量電泳檢測等高效標記分析系統(tǒng)，篩選一批穩(wěn)定可靠的分子標記。前景選擇標記系統(tǒng)繼續(xù)開發(fā)：1）白菜耐抽薹性、高胡蘿卜素含量；2）甘藍葉球顏色、中心柱長；3）黃瓜果實光澤；4）番茄果實硬度、固形物含量。構(gòu)建全

47、基因組遺傳變異圖譜，SNP和SV標記數(shù)目分別大于100萬和5萬個。為每個性狀確定3-5個關(guān)鍵遺傳位點，并為每個位點確定30個以下候選基因。檢測結(jié)球、不結(jié)球和結(jié)球不緊實甘藍突變體內(nèi)基因表達情況，分析基因表達的差異，結(jié)合上述分析確定葉球形成關(guān)鍵基因的目標基因。獲得抽薹開花關(guān)鍵因子的原核表達蛋白相互作用體系。鑒定35個控制葉球商品品質(zhì)的關(guān)鍵基因，搞清楚2-3個調(diào)控葉球發(fā)育相關(guān)基因的生物學功能，揭示不結(jié)球、未熟抽薹的遺傳基礎。精細定位黃瓜瓜把長短和果肉厚度QTL。完成黃瓜Tu候選基因的表達模式分析，初步完成其遺傳轉(zhuǎn)化。解析黃瓜瓜形調(diào)控關(guān)鍵基因的時空表達特性, 挑選出2-4個對黃瓜瓜形起關(guān)鍵調(diào)控作用的候

48、選基因。對候選的關(guān)鍵基因進行TILLING突變體庫的篩選;構(gòu)建關(guān)于候選關(guān)鍵基因的過量表達和RNAi誘導缺失突變的載體。明確黃瓜單性結(jié)實性狀的QTL位點數(shù)，實現(xiàn)初步定位。獲得果實發(fā)育過程中相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組信息。確定黃瓜苦味形成基因的候選基因。精細定位黃瓜芳香物質(zhì)合成的基因。獲得番茄r基因的序列及其可變剪切序列；完成對控制紫果、提高番茄紅素含量的基因精細定位工作。獲得番茄RG候選基因及其突變位點；獲得RG和PST的NILs。獲得10-15個黃瓜苦味物質(zhì)和清香味物質(zhì)形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因并進行體外生化分析，15-20個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達譜，30-40個黃瓜品種的化合物代謝譜，完善代謝化合物信息庫。高密度分子標

49、記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)研發(fā)：針對白菜、甘藍、黃瓜和番茄，每種作物篩選不少于768個SNP、InDel或SRR標記。并達到適于高通量背景選擇的預期指標。前景選擇標記系統(tǒng)開發(fā)：1）白菜：開發(fā)2個耐抽薹主效關(guān)鍵基因選擇標記，開發(fā)富含胡蘿卜素選擇標記；2）甘藍：開發(fā)葉球顏色的選擇標記，遺傳距離小于2cM，開發(fā)中心柱長選擇標記；3）黃瓜：開發(fā)果實光澤緊密連鎖標記，遺傳距離小于2cM；4）番茄：開發(fā)果實硬度相關(guān)基因分子標記，要求通過分子標記選擇可使果實硬度提高1倍以上；開發(fā)高固形物含量選擇分子標記，要求通過分子標記選擇可使固形物含量提高20%以上。第三年繼續(xù)完善全基因組遺傳變異圖譜。表型、遺傳變異等數(shù)據(jù)

50、的數(shù)據(jù)庫整合。白菜和甘藍葉球形成相關(guān)目標基因反義轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及甘藍遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化植株的篩選；抽薹開花關(guān)鍵因子相互作用的酵母雙雜驗證。鑒定和篩選與葉卷曲和葉球形成有關(guān)的基因。葉球相關(guān)基因與環(huán)境因素互作的分子基礎。miRNA和靶基因在葉卷曲和葉球形成中的作用。篩選和預測黃瓜瓜把長短和果肉厚度性狀關(guān)鍵基因的候選基因，開發(fā)共分離標記。黃瓜Tu候選基因的遺傳轉(zhuǎn)化驗證；并利用TuYFP融合表達轉(zhuǎn)化株進行Tu的功能分析：通過激光共聚焦顯微鏡分析Tu在細胞中行使功能的位置，以及在黃瓜植株各部位的表達情況。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把黃瓜上的這2-4個基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥的突變體，對他們在果實形態(tài)方面的功能進行互補測試。

51、分離純化候選關(guān)鍵基因的TILLING突變體培育候選關(guān)鍵基因的過量表達和RNAi誘導缺失突變的轉(zhuǎn)基因黃瓜。黃瓜單性結(jié)實性狀的主效QTL的精細定位研究；進一步分析黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學信息。構(gòu)建EMS突變體文庫，轉(zhuǎn)化驗證黃瓜苦味形成基因的候選基因。利用圖位克隆結(jié)合候選基因分析，確定控制黃瓜清香味物質(zhì)含量最有可能的候選基因；通過RACE方法獲得該基因的全長，結(jié)合父母本候選基因的差異序列，設計候選基因特異的分子標記（如STS、CAPs等）。篩選番茄紫果基因和高番茄紅素基因所在的BAC克隆，對其序列進行分析。對r基因不同轉(zhuǎn)錄本進行過表達和RNA干擾分析轉(zhuǎn)基因功能驗證番茄RG候選基因；利用NILs

52、解析RG和PST基因的表達特征、基因作用模式。測定番茄坐果和果實形成關(guān)鍵時期的轉(zhuǎn)錄組（mRNA-seq或芯片）。利用前兩年建立的化學分析平臺研究野生種抗病砧木對黃瓜果實次生代謝物質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運及積累過程的影響效應，克隆、驗證相關(guān)候選基因，探討果實風味品質(zhì)性狀與抗病性表達或信號調(diào)控的相互關(guān)系。高密度分子標記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)繼續(xù)研發(fā)：建立SNP（或InDel）標記芯片檢測、高通量電泳檢測等高效標記分析系統(tǒng)，篩選一批穩(wěn)定可靠的分子標記。 前景選擇標記系統(tǒng)繼續(xù)開發(fā)：1）白菜高花青素含量；2）甘藍中心柱長；3）黃瓜果實苦味、清香味； 品質(zhì)改良全基因組分子育種策略研究，初步建立如下品質(zhì)性狀的分子育種策

53、略：白菜耐抽薹性；甘藍短中心柱；黃瓜無苦味；番茄果實高固形物含量。優(yōu)質(zhì)新材料創(chuàng)制：根據(jù)目標性狀選定親本材料，完成有關(guān)雜交或回交組合及分離群體的配制。完善全基因遺傳變異圖譜。初步構(gòu)建完成表型和遺傳變異整合數(shù)據(jù)庫。構(gòu)建葉球形成相關(guān)目標基因的反義轉(zhuǎn)化載體，獲取甘藍轉(zhuǎn)基因植株；獲得建立抽薹開花關(guān)鍵因子酵母雙雜體系。闡明大白菜葉球形成的分子基礎和遺傳機制，提出葉球商品品質(zhì)遺傳改良的新途徑。初步確認黃瓜瓜把長短和果肉厚度性狀關(guān)鍵基因的候選基因。在擬南芥上，對候選關(guān)鍵基因在瓜形方面進行功能驗證；獲得候選關(guān)鍵基因的TILLING突變體；獲得候選關(guān)鍵基因的過量表達和RNAi誘導缺失突變的轉(zhuǎn)基因黃瓜。遺傳轉(zhuǎn)化互補

54、確認獲得黃瓜Tu基因，初步完成Tu基因功能分析。將黃瓜單性結(jié)實性狀的主效QTL位點在遺傳譜上進行定位；初步明確與黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因并進行功能研究。構(gòu)建黃瓜EMS突變體庫。確定控制黃瓜清香味物質(zhì)含量的候選基因，并進行基因克隆。明確番茄r基因功能，獲得其調(diào)控因子；獲得控制紫果、提高番茄紅素含量的基因序列。明確番茄RG和PST基因的作用模式、表達特征；獲得番茄果實形成關(guān)鍵時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。初步明確與黃瓜抗病性狀直接相關(guān)的代謝途徑和特定化學物質(zhì)，確定5-8個參與這些代謝物合成和轉(zhuǎn)運的候選基因及其相關(guān)表達譜分析。高密度分子標記檢測與背景選擇標記系統(tǒng)繼續(xù)研發(fā)：針對白菜、甘藍、黃瓜和番茄，每

55、種作物篩選不少于768個SNP、InDel或SRR標記。并達到適于高通量背景選擇的預期指標。前景選擇標記系統(tǒng)繼續(xù)開發(fā)：1）白菜：開發(fā)富含花青素選擇標記，遺傳距離小于2cM；2）甘藍：開發(fā)中心柱長選擇標記，標記選擇可使中心柱長小于葉球縱徑的1/2；3）黃瓜：開發(fā)2個果實苦味主效基因緊密連鎖標記，遺傳距離小于2cM，初步篩選清香味基因選擇標記； 品質(zhì)改良全基因組分子育種策略研究： 使用前景選擇標記，確定各方案需要使用的育種材料；確定親本組配方案、育種流程；篩選適于開展背景選擇的分子標記集，要求背景選擇標記間最大距離不超過15cM，平均間距不超過10cM。優(yōu)質(zhì)新材料創(chuàng)制： 配制耐抽薹、富含胡蘿卜素或

56、花青素的白菜分離群體34個；甘藍中心柱短、葉球亮綠分離群體34個；配制瓜把短、無苦味、有光澤或清香味濃的黃瓜分離群體34；配制耐裂果、畸形果率低、果實固形物含量高的番茄分離群體34個。第四年表型數(shù)據(jù)庫、全基因組遺傳變異數(shù)據(jù)庫、基因表達、同源基因和重要性狀相關(guān)信息等進行數(shù)據(jù)庫整合甘藍轉(zhuǎn)基因植株結(jié)球情況觀察分析；利用定量PCR檢測目標基因在轉(zhuǎn)基因甘藍和非轉(zhuǎn)基因甘藍植株中的表達情況，分析目標基因?qū)θ~球形成的調(diào)控作用；構(gòu)建抽薹開花關(guān)鍵因子若干個截短體及其突變體的表達載體。葉球形態(tài)發(fā)生和發(fā)育過程中基因調(diào)控的機制。基因突變對葉球發(fā)育相關(guān)基因生物學功能的影響。葉卷曲和葉球形成的環(huán)境條件及其遺傳機制。通過植物

57、病毒介導的RNA干擾分析，以及過表達遺傳轉(zhuǎn)化驗證，確認黃瓜瓜把長短和果肉厚度性狀的關(guān)鍵基因或主效QTL。對TILLING突變體、過量表達和RNAi誘導缺失突變的轉(zhuǎn)基因黃瓜進行表現(xiàn)型分析；研究低溫弱光環(huán)境條件對TILLING突變體和轉(zhuǎn)基因黃瓜的影響；構(gòu)建候選關(guān)鍵基因的雙突變體。利用TuYFP融合表達轉(zhuǎn)化株，通過激光共聚焦顯微鏡繼續(xù)分析黃瓜Tu的作用部位與功能上的對應關(guān)系；并進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出差異表達基因。深入分析黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育的轉(zhuǎn)錄學信息；進行黃瓜單性結(jié)實果實發(fā)育的蛋白組學研究。突變體庫和遺傳轉(zhuǎn)化確認克隆的黃瓜苦味形成關(guān)鍵基因。確定控制黃瓜清香味物質(zhì)合成的候選基因的序列，完成基因的

58、功能注釋后，利用RNA干擾技術(shù)結(jié)合瞬時表達進行功能驗證；轉(zhuǎn)基因功能驗證。對控制番茄紫果基因和高番茄紅素基因進行過表達和RNA干擾分析。將高番茄紅素材料與紫果材料雜交，并加代獲得分離群體。分析番茄RG/PST與植物激素協(xié)調(diào)控制果實品質(zhì)的形成及闡明RG、PST突變或轉(zhuǎn)基因?qū)D(zhuǎn)錄組的廣泛影響。番茄果實生長發(fā)育關(guān)鍵時期特異表達基因的驗證（qRT-PCR等）、構(gòu)建全基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將所功能鑒定的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子導入不同遺傳背景的黃瓜品種，通過代謝組學分析研究它們對苦味物質(zhì)和清香味物質(zhì)形成的影響。品質(zhì)改良全基因組分子育種策略研究：繼續(xù)完成品質(zhì)性狀的分子育種策略研制，結(jié)合常規(guī)育種程序，全面開展前景和