基因定位克隆

1、關(guān)于基因的定位克隆第一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月千奇百怪的突變體這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？突變體:是某個(gè)性狀發(fā)生可遺傳變異的材料，或某個(gè)基因發(fā)生突變的材料。水稻第二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因定位（mapping）：是用一定的方法將基因確定到染色體上的實(shí)際位置。第三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、連鎖分析（Linkage analysis）1）概念： 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。第四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年

2、6月2）重組值（recombination fraction） 是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）交換值(RF)(%)=重組型的配子數(shù)/總配子數(shù)100% 重組值越大，說明兩基因間的距離越遠(yuǎn)，基因間的連鎖強(qiáng)度越小；重組值越小，說明基因間的距離越近，基因間的連鎖強(qiáng)度越大。第五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 3）遺傳標(biāo)記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的DNA序列作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。 4）遺傳多態(tài)性：是指

3、在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。第六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、三點(diǎn)測交(three-point testcross)與染色體作圖 為了進(jìn)行基因定位，摩爾根和他的學(xué)生Sturtevant創(chuàng)造了三點(diǎn)測交方法，即將3個(gè)基因包括在同一次交配中。進(jìn)行這種測交，一次實(shí)驗(yàn)就等于3次兩點(diǎn)試驗(yàn)。 已知在果蠅中棘眼(ec)、截翅(ct)和橫脈缺失(cv)這3個(gè)隱性突變基因都是X連鎖的。把棘眼、截翅個(gè)體與橫脈缺失個(gè)體交配,得到3個(gè)基因的雜合體ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它們在X染色體的真實(shí)順序)，取其中3雜合體雌

4、蠅再與3隱性體ec ct cv/Y雄蠅測交，測交后代如下表。第七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月ec ct +/ + + cv ec ct cv/Y測交后代數(shù)據(jù)第八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果分析1、歸類2、確定正確的基因順序 用雙交換型與親本類型相比較，發(fā)現(xiàn)改變了位置的那個(gè)基因一定是處于中央的位置，因?yàn)殡p交換的特點(diǎn)是旁側(cè)基因的相對位置不變，僅中間的基因發(fā)生變動(dòng)。于是可以斷定這3 個(gè)基因正確排列順序是ec cv ct。親本型ec ct + + cv雙交換型+ + +ec ct cv第九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月ec ct + + cvec + ct+

5、 cv +ct ec + + cvec + + ct cvec cv ct+ + +ct + + ec cv第十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、計(jì)算重組值，確定圖距(1)、計(jì)算ctcv的重組值 忽視表中第一列(ec/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第二、三列：ctcv間重組率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cM第十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)、計(jì)算ecct的重組值 忽視表中第三列(+/cv)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、二列：ecct間重組率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cM第

6、十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)、計(jì)算eccv的重組值 忽視表中第二列(ct/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、三列：eccv間重組率=(273+265+5+3)/5318=10.2%=10.2cM第十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4、繪染色體圖eccvct10.28.418.418.6在計(jì)算eccv和cvct的重組值時(shí)都利用了雙交換值，可是計(jì)算ecct時(shí)沒把它計(jì)在內(nèi)，因?yàn)樗鼈冮g雙交換的結(jié)果并不出現(xiàn)重組。所以ecct之間的實(shí)際雙交換值應(yīng)當(dāng)是重組值加2倍雙交換值。即18.4%+20.1%=18.6%。當(dāng)三點(diǎn)測交后代出現(xiàn)8種表型時(shí),表明有雙交換發(fā)生,此時(shí)需用

7、2倍雙交換值來作校正。若3個(gè)基因相距較近，往往不出現(xiàn)雙交換類型,后代只有6種表型,無需校正。標(biāo)記1標(biāo)記2目標(biāo)基因第十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、圖位克隆 圖位克隆（map-based cloning）又稱定位克隆，該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行（chromosome walking）逼近目的基因或通過染色體登陸（chromoso

8、me landing）（Tanksley et al.，1995）的方法最終找到包含目的基因的克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿基序列。第十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 圖位克隆的特點(diǎn)是無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面的基本情況。 一是有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,即定位群體，如：F2、DH、BC、RI等。第十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 二是開展以下幾項(xiàng)工作：（1）首先找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；（2）用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體上的特定位置；（3）構(gòu)

9、建含有大插入片段的基因組文庫；（BAC或YAC）；（4）以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫；（5）用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；（6）通過染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目的基因的大片段克?。唬?）通過亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??；（8）通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列第十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月M1M2構(gòu)建遺傳圖譜構(gòu)建物理圖譜染色體步移： Chromosome Walking 篩選基因組文庫序列分析與功能鑒定對于基因組還未測序的物種可通過染色體步移的方法進(jìn)行定位，但是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而對于水稻、擬南芥等基因組測序工作已經(jīng)完成的物

10、種，則不在利用染色體步移的方法進(jìn)行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標(biāo)基因的候選基因，再通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。第十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四、分子標(biāo)記分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。 第十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分子標(biāo)記的種類 一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：限制性片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorp

11、hism，RFLP)二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)三、基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記 ：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP ) 四、基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù) ：核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 第二十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（多為

12、1-5個(gè)）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標(biāo)記。 SSR第二十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五、基因初步定位 目的基因的初步定位(mapping the tar

13、get gene)是利用分子標(biāo)記技術(shù)在一個(gè)目標(biāo)性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區(qū)域內(nèi)。 初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群組分離分析法(bulk segregant analysis, BSA)。第二十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月近等基因系是指只有目標(biāo)性狀基因有差異，其它性狀基因相同的2個(gè)群體，可以通過連續(xù)回交的途徑獲得。由于近等基因系需要連續(xù)的回交，所需的時(shí)間較長，因此Michelmore等(1991)提出了群組分離分析法（BSA法），將分離群體中研究的目標(biāo)性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組，將每組內(nèi)一定數(shù)量的

14、植株DNA 等量混合，形成兩個(gè)池，這兩個(gè)池僅在目標(biāo)性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找兩個(gè)池的擴(kuò)增譜帶的差異，這種多態(tài)性極可能與目標(biāo)基因連鎖。再用所有的分離后代單株，驗(yàn)證該多態(tài)性是否真正與目標(biāo)基因連鎖及連鎖距離的確定。第二十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月六、精細(xì)定位 在初步定位基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并篩選離親本更近且在兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物，然后利用F2群體中的突變體檢測篩選到的親本間多態(tài)性引物，逐步縮小范圍，將目的基因定位到染色體上一個(gè)很小的物理區(qū)間內(nèi)。第二十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 舉例說明：利用SSR標(biāo)記進(jìn)行水稻drawf1基因的定位第二十五張，PP

15、T共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基本實(shí)驗(yàn)方法F2定位群體構(gòu)建植物總DNA的提取PCR反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳引物設(shè)計(jì)第二十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月F2群體構(gòu)建第二十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計(jì)常用軟件及網(wǎng)站設(shè)計(jì)軟件： primer3.0/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiprimer5.0（尋找酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物）Webprimer/cgi-bin/web-primer序列分析軟件：DNAstar（分析序列特征，引物質(zhì)量，編輯序列）第二十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基因的初步定位（BSA法）篩選親本間多態(tài)性

16、引物篩選池間多態(tài)性引物 小群體驗(yàn)證第二十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月初步定位帶型分析正常親本突變親本突變池正常池RM1（親本之間有多態(tài)，池間無多態(tài)）第三十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RM2(親本和池之間均有多態(tài)）正常親本突變親本突變池正常池第三十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 總結(jié)：如果親本與池之間同時(shí)存在多態(tài)性的引物很有可能和目標(biāo)基因連鎖，因此再通過小群體進(jìn)行驗(yàn)證（重組交換值應(yīng)該小于50%），則可將目標(biāo)基因定位到與其連鎖的標(biāo)記所在的染色體上。我們初步定位的結(jié)果是否準(zhǔn)確呢？接下來就要用一些突變體進(jìn)行驗(yàn)證，看一下我們所選定的標(biāo)記與目標(biāo)基因是否真正連鎖第

17、三十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳距離=（單交換+雙交換2）/（突變體總數(shù) 2） 100怎樣判斷目標(biāo)基因與這些標(biāo)記之間的位置關(guān)系及距離遠(yuǎn)近呢？第三十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 A P + - 5 10 18A P + - 6 11 12 16RM2RM3第三十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 交換率越高的標(biāo)記離目標(biāo)基因越遠(yuǎn)，反之離目標(biāo)基因越近，即對應(yīng)的交換株越多的標(biāo)記離目標(biāo)基因遠(yuǎn)，交換株越少的標(biāo)記離目標(biāo)基因越近。第三十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RM1RM2drawf1RM3RM43.8cM2.4cM2.4cM2.0cMCHR.6

18、MarkerDist.(cM)目標(biāo)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)記連鎖圖第三十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月精細(xì)定位擴(kuò)大定位群體設(shè)計(jì)離目標(biāo)基因更近的分子標(biāo)記，并篩選在兩親本之間存在多態(tài)性的分子標(biāo)記用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記引物檢測定位群體，最終將目標(biāo)基因鎖定在一個(gè)較小的物理區(qū)間內(nèi)第三十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月目標(biāo)基因所在染色體上相應(yīng)區(qū)段的跨疊BAC克隆群第三十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月七、候選基因的確定 方法（1）查閱相關(guān)資料，比較分析定位區(qū)間內(nèi)基因的同源基因的功能，在其它物種是否引起相同或相似的表型，找到最有可能的候選基因；（2）進(jìn)行mRNA水平的分析，看其表達(dá)在正常植株與突變體中是否發(fā)生了改變，如長度變化，表達(dá)量變化等；（3）進(jìn)行序列測定，比較該基因在正常植株內(nèi)與突變體內(nèi)核酸序列和氨基酸序列是否發(fā)生了改變；（4）進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證候選基因是否為目標(biāo)基因。第三十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RT-PCR（1）提取正常植株與突變體的總RNA（2）RT-PCR（3）瓊脂糖凝膠電泳分析，