基因診斷和基因治療(2)

1、關(guān)于基因診斷與基因治療 (2)第一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的概念基因是遺傳學(xué)上的一個(gè)概念，是在染色體上占有一定的位置，表現(xiàn)一定功能的基本單位基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是脫氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA）基因診斷是指運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法檢查基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)產(chǎn)物，是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。 第二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)基因診斷操作的對(duì)象為基因或其片段運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，檢查特定基因的存在與否、基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能是否正常等，從而確定：是否患有某種遺傳?。撼赡耆诉z傳型分析，產(chǎn)前

2、診斷是否患有某些特定的微生物感染疾病是否患有某種腫瘤，對(duì)腫瘤病人的預(yù)后進(jìn)行分析基因配型，用于移植、輸血等法醫(yī)學(xué)上，分析犯罪現(xiàn)場的證實(shí)與嫌犯的鑒別第三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的途徑檢查是否存在特定的DNA或RNA，用于微生物感染的診斷基因突變的檢測限制性內(nèi)切酶酶譜分析等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法基因連鎖分析限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)基因的單堿基多態(tài)性分析(SNP)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA檢測基因型的鑒定與比較第四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的對(duì)象1、病原生物的侵入：一般侵入體內(nèi)的病原生物可通過顯微鏡檢查各免疫學(xué)方法進(jìn)行診斷。直接檢測病原生

3、物的遺傳物質(zhì)提高診斷的敏感性2、先天遺傳性疾患：已有多種傳統(tǒng)的遺傳性疾患的發(fā)病原因被確定為特定基因的突變。例如：苯丙氨酸羥化酶基因突變可引起苯丙酮尿癥：腺苷脫胺酶基因突變可引起重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID)；而淋巴細(xì)胞表面分子CD40或其配體（CD40L）基因突變則可引起無丙種球蛋白血癥。用基因診斷的方法檢測其基因突變利于確診和治療方案的建立3、后天基因突變引起的疾?。耗[瘤。腫瘤的發(fā)生是由于個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無限增殖。基因診斷可確定抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變4、其它：如DNA指紋、個(gè)體識(shí)別，親子關(guān)系識(shí)別，法醫(yī)物證等第五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的運(yùn)用一

4、是通過檢測特定基因或相關(guān)疾病基因的存在以判斷和評(píng)估某疾病在某一個(gè)體上發(fā)生某疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以導(dǎo)向預(yù)防這種疾病的發(fā)生二是通過基因診斷促使個(gè)性化藥物的誕生三是通過基因診斷更精確判斷某些傳染性疾病或腫瘤等疾病的存在，以有利于臨床醫(yī)生盡早確定病因基因診斷技術(shù)不僅在疾病檢測上具有重要意義，而且在婚前檢查，親子鑒定等人類生活方面具備廣闊運(yùn)用前景 第六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的方法PCR核酸雜交基因芯片(chip)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amp-FLP) 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法(ASO) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法 (SSCP)第七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)的

5、發(fā)明及特點(diǎn)1985年Saiki 首次用以擴(kuò)增珠蛋白基因標(biāo)志PCR技術(shù)的問世。PCR技術(shù)具有簡便、快速、特異和靈敏等特點(diǎn)，它用于基因診斷，使之發(fā)生了革命性的變化。PCR技術(shù)可使待測樣品中的目的基因片段在幾小時(shí)內(nèi)，甚至十幾秒內(nèi)擴(kuò)增百萬倍，如果標(biāo)本中原來的目的基因達(dá)到fg級(jí)水平，就可以通過簡單電泳和溴化乙啶(EB)顯示擴(kuò)增后的核酸片段區(qū)帶。從檢測區(qū)帶的電泳位置看它是否符合引物設(shè)計(jì)的擴(kuò)增長度。第八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)的進(jìn)展 PCR-Southern印跡 模板檢測靈敏度可達(dá)ag級(jí)水平(可查出幾個(gè)病毒的存在)則能看到雜交帶。特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，但操作費(fèi)時(shí)間，一次需3d，這使急于

6、根據(jù)檢測結(jié)果決定治療措施的臨床醫(yī)生迫不及待。套式PCR 是指在用第一對(duì)引物(外引物)擴(kuò)增之后，加入另一對(duì)位于外引物內(nèi)側(cè)的內(nèi)引物，再行擴(kuò)增數(shù)十個(gè)循環(huán)，這可將標(biāo)志檢測時(shí)間壓縮8-10h，第2日便可獲得高敏感性的檢查結(jié)果。其敏感性大致與PCR-Southern印跡相當(dāng)。第九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的微量化 反應(yīng)體積減少至10-20l，降低了PCR檢測的成本。在1次PCR中加入多對(duì)引物，可用于病毒、細(xì)菌等的分型和多種病原體基因的檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用專為檢測雙鏈DNA而設(shè)計(jì)的微量熒光計(jì)定量，就可從標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的量或拷貝數(shù)達(dá)到PCR定量的目的。取樣技術(shù)的改進(jìn) 對(duì)于產(chǎn)前診斷，初

7、期是取羊水細(xì)胞，需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。從1982年起采取妊娠8-12周的絨毛DNA作產(chǎn)前診斷使產(chǎn)前基因診斷的時(shí)間提前。由于PCR技術(shù)的應(yīng)用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可作產(chǎn)前診斷。第十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 過去尋找致病基因是從經(jīng)典遺傳學(xué)思路出發(fā)，先發(fā)現(xiàn)疾病的表現(xiàn)改變，再經(jīng)過不同方法由表型追溯到基因。近幾年來發(fā)展起來的“反向遺傳學(xué)”(reverse genetics)在策略上解決了經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解決的這個(gè)難題。在不知道和不必知道基因產(chǎn)物或表型的情況下分離和定位致病基因，并由它的一級(jí)結(jié)構(gòu)推出產(chǎn)物的氨基酸序列。方法：須先采用細(xì)胞遺傳學(xué)方式或RFLP連鎖分析確定致病

8、基因在染色體上的大概位置，然后采用染色體步移（chromosome walking）或染色體跳躍（chromosome hopping）技術(shù)逐漸接近，最后找到的基因的準(zhǔn)確位置。成功例子：如Duchenne肌營養(yǎng)不良和囊性纖維變等致病基因的發(fā)現(xiàn)；預(yù)計(jì)亨廷頓舞蹈病、神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性腸息肉和成人型多囊腎等疾病的致病基因，不久可望用此策略得以確定。 第十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸雜交概念不同來源的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補(bǔ)，就可以經(jīng)退火處理復(fù)性現(xiàn)象，形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種依據(jù)相應(yīng)堿基配對(duì)而使不完全互補(bǔ)的兩條鏈相互結(jié)合稱為分子雜交。 第

9、十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸雜交分類基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類DNA探針還有單鏈和雙鏈之分 第十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸探針的標(biāo)記和檢測 核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)缺口平移DNA快速末端標(biāo)記用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNA 5末端，隨引物延伸聚合酶鏈反應(yīng)核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)光促生物素標(biāo)記核酸酶促生物素標(biāo)記核酸寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記酶標(biāo)DNA酶標(biāo)寡核苷酸DNA半抗原標(biāo)記 第十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年

10、6月核酸分子雜交方法 核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 第十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因芯片概念也叫DNA芯片，是在90年代中期發(fā)展出來的高科技產(chǎn)物?；蛐酒笮∪缰讣咨w一般，其基質(zhì)一般是經(jīng)過處理后的玻璃片。每個(gè)芯片的基面上都可劃分出數(shù)萬至數(shù)百萬個(gè)小區(qū)。在指定的小區(qū)內(nèi)，可固定大量具有特定功能、長約20個(gè)堿基序列的分子探針。 第十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于20

11、22年6月基因芯片的原理及用途原理：由于被固定的分子探針在基質(zhì)上形成不同的探針陣列，利用分子雜交及平行處理原理，基因芯片可對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行分子檢測可用于進(jìn)行基因研究、法醫(yī)鑒定、疾病檢測和藥物篩選等特點(diǎn)：基因芯片技術(shù)具有無可比擬的高效、快速和多參量特點(diǎn)，是在傳統(tǒng)的生物技術(shù)如檢測、雜交、分型和DNA測序技術(shù)等方面的一次重大創(chuàng)新和飛躍 第十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因芯片應(yīng)用基因破譯 ：基因功能；提高測序速度基因診斷 ：癌癥、糖尿病等，借助一小滴測試液，醫(yī)生們能預(yù)測藥物對(duì)病人的功效，可診斷出藥物在治療過程中的不良反應(yīng)，還能當(dāng)場鑒別出病人受到了何種細(xì)菌、病毒或其他微生物的感染。第十八

12、張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月擴(kuò)增片段長度多態(tài)性概念：小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）連鎖分析法。方法：PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時(shí)只有幾個(gè)核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。第十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allel

13、e-specific oligonucleotide, ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點(diǎn)突變時(shí)一般需要合成兩種探針，一種與正常基因序列完全一致，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。PCR可結(jié)合ASO，即PCRASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時(shí)間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。 第二十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022

14、年6月單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或突變的檢測。用SSCP法檢查基因突變時(shí)，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)此作出診斷。PCRSSCP法具有能快速、靈敏地檢測有無點(diǎn)突變或多態(tài)性的優(yōu)點(diǎn)，但如欲闡明突變的堿基性質(zhì)，則

15、需作序列分析。 第二十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的質(zhì)量控制特異性：雜交技術(shù)是通過基因克隆制備探針來完成，PCR是通過引物來完成，RFLP是利用限制內(nèi)切酶來完成等。即探針、引物、限制性內(nèi)切酶在反應(yīng)中都具有特異性。靈敏度：雜交技術(shù)用同位素或酶標(biāo)記探針，PCR反復(fù)擴(kuò)增20-30次都是提高靈敏度的手段。二次PCR、PCR與Southern blot合用都是典型的例子。操作簡單：雜交技術(shù)因操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)（需1-2天以上出結(jié)果），在臨床實(shí)驗(yàn)室難以推廣。而PCR方法相對(duì)簡單、快速，故推廣迅速。實(shí)驗(yàn)成本：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)因試劑多數(shù)依賴進(jìn)口，成本高，給臨床推廣造成一定困難。試劑國產(chǎn)化是今

16、后的努力方向。重復(fù)性和穩(wěn)定性第二十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的應(yīng)用感染性疾病病毒性疾病的診斷：HBV、HCV、HIV和HPV細(xì)菌性疾病的診斷：TB、瘧原蟲遺傳性疾病鐮刀狀細(xì)胞貧血癥：beta-珠蛋白基因AT變換甲型血友病：凝血因子VIII腫瘤 ras癌基因突變、c-myc癌基因 p53抑癌基因、p16抑癌基因產(chǎn)前診斷、移植配型法醫(yī)鑒定第二十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因診斷的意義一是可以解決遺傳性疾病難以診斷的黑洞，由于遺傳性疾病主要是由特定的DNA序列即基因決定的，通過基因診斷能夠在遺傳病患者還未發(fā)現(xiàn)出任何癥狀之前就能確診二是肝炎、癌癥、艾滋病都與

17、病毒有關(guān)，而通過基因診斷技術(shù)就可以順利檢查出隱藏在人體細(xì)胞基因中的病毒從而在造成危害之前消滅它們。 第二十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療 (Gene Therapy)的概念人類疾病的發(fā)生，是人體細(xì)胞中自身基因的改變，是由外源病原體的基因產(chǎn)物與人體基因相互作用的結(jié)果。因此，長期以來，科學(xué)家設(shè)想人類能否最終運(yùn)用遺傳物質(zhì)，無論是人類自身的或是外源遺傳物質(zhì)來治療疾病，糾正人體本身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，阻止病菌的 ，殺滅病變的細(xì)胞或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，保證人體健康?；蛑委?gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因較正或置換致病基因的一種治

18、療方法。目的基因被導(dǎo)入到靶細(xì)胞（target cells）內(nèi)，他們或與宿主細(xì)胞（host cell）染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細(xì)胞中得到表達(dá)，起到治療疾病的作用。目前基因治療的概念有了較大的擴(kuò)展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可稱為基因治療。隨著對(duì)疾病本質(zhì)的深入了解和新的分子生物學(xué)方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的發(fā)展。第二十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的潛力 基因治療的歷史沿革 1990年，科學(xué)家第一次用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把腺苷脫氨酶基因（ADA）導(dǎo)入來自病人自身的T淋巴細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)

19、增后輸回患者體內(nèi)，獲得可成功。標(biāo)志著基因治療時(shí)代的開始。 1995年美國FDA批準(zhǔn)AdP53腫瘤基因治療等臨床試驗(yàn)的實(shí)施，標(biāo)志著基因治療已逐步進(jìn)入一個(gè)正常的、目標(biāo)明確的理性化發(fā)展階段。第二十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月18歲的格爾辛基（Jesse Gelsinger）因臨床試驗(yàn)的某些失誤而于1999年9月17日死亡。格爾辛基是世界上首位由基因治療導(dǎo)致喪生的患者。他患先天性鳥氨酸甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥（X連鎖性遺傳?。┎“Y，在男性身上較嚴(yán)重，往往引起新生男嬰患者的死亡。2006年7月24日,來自伊利諾斯州的一名36歲女患者，為了治療自己的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎而采用基因治療的方法,

20、在一條腿的膝蓋部位注射了藥劑結(jié)果死亡,該公司也被迫關(guān)閉。 第二十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的前景分析基因治療是將具有治療價(jià)值的基因，即“治療基因”裝配于帶有在人體細(xì)胞中表達(dá)所必備元件的載體中，導(dǎo)入人體細(xì)胞，直接進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)行基因治療時(shí)毋須對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，因?yàn)槿思?xì)胞本身可以完成這個(gè)過程。第二十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月可大大降低治療成本。因?yàn)榛蛑委煵恍枰蚬こ讨泻馁Y最大的器材與材料費(fèi)用，顯著降低了工業(yè)化的成本?；蚬こ痰摹澳康幕颉?往往不能有效地進(jìn)入細(xì)胞而不能備應(yīng)用于基因工程。但基因治療不受上述限制。具有治療作用，理論上均可應(yīng)用于基因治療

21、。因此，基因治療具有更大的潛力。第二十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療則必須將基因直接導(dǎo)入人體細(xì)胞，不僅在技術(shù)上具有很大難度，而且在有效性于安全性方面提出了風(fēng)為苛刻的要求?；蛑委焹H有10年的歷史，不少技術(shù)還不夠成熟。所以，它所遇到的風(fēng)險(xiǎn)性更大。 第三十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的策略基因置換（gene replacement）：基因置換就是用正常的基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)原因尚難達(dá)到。基因修復(fù)（gene correction）：基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列糾正，

22、而正常部分予以保留。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復(fù)，操作上要求高，實(shí)踐中有一定難度。第三十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因修飾（gene augmentation）又稱基因增補(bǔ)，將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能修飾缺陷細(xì)胞的功能或使原有的某些功能得以加強(qiáng)。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙軆?nèi)皮細(xì)胞并得以表達(dá)后，防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)誘發(fā)的血檢形成基因失活（gene inactivation）：利用反義技術(shù)能特異地封閉基因表達(dá)特性，抑制一些有害基因的表達(dá)，已達(dá)到治療疾

23、病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。用此技術(shù)還可封閉腫瘤細(xì)胞的耐藥基因的表達(dá)，增加化療效果。第三十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫調(diào)節(jié)（immune adjustment）：將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)爰踩梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如將白細(xì)胞介素-2導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達(dá)到防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。其它：增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害。如向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給

24、予病人無毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細(xì)胞才能將CGV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因而腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞無影響。耐藥基因治療：將產(chǎn)生抗藥物毒性基因如MDR-1導(dǎo)入干細(xì)胞中，使機(jī)體耐受更大劑量的化療或放療第三十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳性疾病基因治療策略隱性遺傳病 用正?；蛑脫Q致病基因而達(dá)到完全校正導(dǎo)入正常基因序列以達(dá)到暫時(shí)性校正顯性遺傳病用正?；蛑脫Q致病基因而達(dá)到完全校正使有害基因失活而達(dá)到暫時(shí)性校正（如用反義技術(shù)、核酶等）在某些情況下可導(dǎo)入正?；蚣右孕Ｕㄈ鏛DL受體）低密度脂蛋白受體 第三十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月疾病基因治療策

25、略腫瘤殺傷腫瘤細(xì)胞：利用自殺基因，激活免疫系統(tǒng)及保護(hù)正常細(xì)胞免受化療藥物的損傷等使癌基因失活（反義技術(shù)、核酶）增加抑癌基因的表達(dá)傳染病殺傷傳染源（免疫法、自殺基因） 使傳染源失活（反義技術(shù)、核酶、核酸陷井）其它疾病導(dǎo)入藥物基因（藥物釋放）如激素、細(xì)胞因子失活、有害基因產(chǎn)物（反義技術(shù)、核酶、核酸陷阱）殺傷策略如減少特異細(xì)胞群第三十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy)的途徑Ex vivo cells removed from body, incubated with vector and gene-engineered c

26、ells returned to body.In situ vector is placed directly into the affected tissues.In vivo vector injected directly into the blood stream.第三十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月咨詢 體細(xì)胞 第三十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月半乳糖血癥 飲食的 苯丙酮尿癥 抗瘧疾藥物 甲狀腺素 甲狀腺低能癥 苯甲酸酯 降膽固醇藥 第三十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月吡哆醇 高胱氨酸尿 脫氨酶 戈謝病 葡萄糖腦苷脂病 第三十九張，PPT共

27、九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月炎癥或肉芽腫性 地中海貧血 第四十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的障礙1. 基因治療載體的建立2. 治療基因的構(gòu)建3. 受體細(xì)胞的增殖與維持有效的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使DNA進(jìn)入受體細(xì)胞核內(nèi)并整合到染色體基因組中4. 經(jīng)基因轉(zhuǎn)移后的治療用細(xì)胞的增殖和向病人的移植治療基因在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)第四十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室基因治療研究疾病的遺傳背景及機(jī)制的揭示可選治療基因的篩選及評(píng)價(jià)基因治療藥物的制備治療用目的基因基因轉(zhuǎn)移及表達(dá)載體接受基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的方法途徑的選擇基因治療效果的

28、評(píng)估基因治療藥物的安全性評(píng)估第四十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床人體基因治療的基本程序疾病的評(píng)估目的基因的選擇和制備基因的轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因治療藥物的制備受體靶細(xì)胞的選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)染(transfection)或感染(Infection)外源基因的表達(dá)及檢測基因治療的療效評(píng)價(jià)基因治療的安全性及倫理學(xué)第四十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療所應(yīng)用的治療基因 Gene TypeProtocols%Patients%Antibody30.850.2Antigen6315.988226.9Antigen + 2 HIV inhibitors10.300Antigen + cy

29、tokine10.390.3Antigen + Marker10.300Antisense4130.1Antisense + drug resistance10.300Antisense + Negative transdominant61.5170.5Antisense + Tumor suppressor10.390.3Antitumoral(EIA)20.5160.5Cytokine7619.272422.1Cytokine + marker71.8662Cytokine + receptor20.500Cytokine / Chemokine20.500Decoy10.300Decoy

30、 + marker20.550.2Deficiency5112.92898.8第四十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Deficiency + marker20.590.3Drug resistance112.8551.7Drug resistance + marker10.3100.3Marker4010.12156.6Marker + other20.5180.5Marker / suicide10.360.2Multiple30.8160.5N/C30.800Negative transdominant10.300Oncogene Regulator10.300Other112

31、.8481.5Receptor174.31023.1Receptor + antigen10.300Ribozyme51.3190.6Suicide5012.654316.6Suicide + marker41290.9Tumor suppressor194.81835.6Total3961003278100第四十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的載體系統(tǒng) RNA病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒)RNA viruses (Retroviruses)1. 鼠白血病病毒 Murine leukemia virus (MuLV)2. 人免疫缺陷病毒 Human immunodeficienc

32、y viruses (HIV)3. 人T淋巴細(xì)胞病毒 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) 4. 慢病毒 Lentinovirus第四十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA病毒載體 DNA viruses1. 腺病毒Adenoviruses2. 腺相關(guān)病毒Adeno-associated viruses (AAV)3. 單純胞疹病毒Herpes simplex virus (HSV)4. 痘病毒Pox viruses5. 濾泡病毒Foamy viruses第四十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月非病毒載體Non-viral v

33、ectors1. 脂質(zhì)體Liposomes2. 裸DNA Naked DNA3. 脂質(zhì)體-聚陽離子復(fù)合物L(fēng)iposome-polycation complexes4. 多肽傳遞系統(tǒng)Peptide delivery systems 第四十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月病毒載體的類型重組型病毒載體(Recombinant virus vectors)以完整的病毒基因組為改造對(duì)象。一般的步驟是選擇性地刪除病毒的某些必需基因尤其是早期基因，或控制其表達(dá)；缺失的必需基因的功能由互補(bǔ)細(xì)胞反式提供；用外源基因表達(dá)單位替代病毒非必需基因區(qū)；病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件不變。通過同源重組方法將

34、外源基因表達(dá)單位插入病毒基因組中。如在傳統(tǒng)的重組腺病毒構(gòu)建方法中，將外源基因表達(dá)盒（Exogenous gene expression cassette）插入穿梭質(zhì)粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，與輔助質(zhì)粒（含有腺病毒基因組的質(zhì)粒如JM17或pBHG）共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)的同源重組獲得含有外源基因的重組腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。第五十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月無病毒基因的病毒載體（Gutless vectors）在不同的病毒載體系統(tǒng)中的稱謂不同。對(duì)于腺病毒，一般稱為mini-Ad；在HSV載體系統(tǒng)，一般稱為擴(kuò)增

35、子（Amplicon）載體或質(zhì)粒型載體。重組AAV載體也屬于無病毒基因的病毒載體。由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。重組載體質(zhì)粒主要由外源基因表達(dá)盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件。在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體質(zhì)粒（包含或不包含質(zhì)粒骨架）以特定形式（單鏈或雙鏈，DNA或RNA）被包裝到病毒殼粒中，其中不含有任何病毒基因。優(yōu)點(diǎn)在于載體病毒本身安全性好，容量大。缺點(diǎn)在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，而輔助病毒又難以同載體病毒分離開來，造成最終產(chǎn)品中輔助病毒污染，從而影響其應(yīng)用。第五十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基

36、因治療臨床試驗(yàn)采用的載體系統(tǒng) 臨床方案病 例No.%No.%腺相關(guān)病毒41.1361.1腺病毒7117.943713.3電穿孔20.5200.6基因槍41.0351.1皰疹病毒10.300脂質(zhì)體7318.473522.4脂質(zhì)體腺相關(guān)病毒20.500脂質(zhì)體腺病毒10.330.1裸DNA164.0692.1Poxvirus266.61304.0反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞205.140812.4反轉(zhuǎn)錄病毒15839.9121737.1反轉(zhuǎn)錄病毒基因槍10.360.2RNA轉(zhuǎn)移10.3300.9其它轉(zhuǎn)染71.81013.1總數(shù)3871003227100第五十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月病毒載體

37、的順式作用元件和經(jīng)典包裝方式 載體順式作用元件經(jīng)典包裝方式反轉(zhuǎn)錄病毒載體11)兩個(gè)長末端重復(fù)序列（LTR）：含有整合和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的必需序列；含有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；2）tRNA 引物結(jié)合位點(diǎn)p；3）包裝信號(hào)序列。載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合了所有必需基因（gag,pol,env）的包裝細(xì)胞系如PA317，經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得產(chǎn)病毒細(xì)胞系（VPC）；細(xì)胞不裂解，病毒不斷分泌至培養(yǎng)上清中。腺病毒載體兩個(gè)末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR）；包裝信號(hào)序列。載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得重組腺病毒。重組腺病毒感染293細(xì)胞而擴(kuò)增；細(xì)胞每次被感染后發(fā)生裂解。腺病毒伴隨病毒載體兩個(gè)末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR）；其中包括了病毒復(fù)制

38、起點(diǎn)、包裝信號(hào)及整合和拯救所必需的順式元件。AAV載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并加輔助病毒（腺病毒或單純皰疹病毒）感染。單純皰疹病毒載體HSV 病毒復(fù)制起點(diǎn)ori； 病毒包裝信號(hào)pac 。重組病毒在互補(bǔ)細(xì)胞上傳代；擴(kuò)增子病毒在輔助病毒存在下傳代。第五十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月常用病毒載體的特性和適用范圍 病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中；表達(dá)時(shí)間較長；有致癌的危險(xiǎn)；Ex vivo基因治療；腫瘤基因治療。腺病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞；不整合到染色體中；外源基因表達(dá)水平高；表達(dá)時(shí)間較短；免疫原性強(qiáng)；In vivo基因治療；腫瘤基

39、因治療；疫苗。AAV病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達(dá)外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；In vivo 基因治療；Ex vivo基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的基因治療。HSV病毒載體具有嗜神經(jīng)性；可逆軸突傳遞；可潛伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療；腫瘤的基因治療。第五十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Advantages:Randomly integrates into genomeWide host rangeLong term expression of transge

40、neDisadvantages:Capacity to carry therapeutic genes is smallInfectivity limited to dividing cellsInactivated by complement cascadeSafety第五十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Life cycle of a retrovirusGene therapy constructs maintained at this stage.第五十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月AdenovirusAdvantages:Efficiency of tran

41、sduction is highHigh level gene expressionSlightly increased capacity for exogenous DNADisadvantages:Expression may be transientCell-specific targeting difficult to achieveVirus uptake is ubiquitousSafety第五十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Other viral vectorsAdeno-associated virus infects wide range of cells (

42、both dividing and non-dividing), able to integrate into host genome, not associated with any human disease, high efficiency of transduction.Herpes simplex virus, vaccinia virus, syndbis virus, foamy viruses not yet widely studiedOnyx virus limited replicating adenovirus that replicates mainly in tum

43、or cells. 第五十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1. Liposome2. Cationic polymersNon-viral vectorsMay overcome limitations with viruses including small capacity for therapeutic DNA, difficulty in cell-type targeting and safety concerns.4. Peptide-mediated gene delivery3. Naked DNA第五十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Steps in

44、synthesis of a therapeutic gene therapy gene construct第六十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Arrangement of native retrovirus genome第六十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Synthesis of a retroviral gene therapy vectorSite of insertion of therapeutic geneSelectable marker for transduced cells第六十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因轉(zhuǎn)移方法系統(tǒng)轉(zhuǎn)染法 磷

45、酸鈣質(zhì)粒體外 較高 體外轉(zhuǎn)移，操作簡便 電穿孔質(zhì)粒體外 較高 體外基因轉(zhuǎn)移融合法 原生質(zhì)體質(zhì)粒細(xì)菌染色體體外 中等 體外基因轉(zhuǎn)移 脂質(zhì)體質(zhì)粒DNA體外、體內(nèi) 高 基因治療顯微注射法質(zhì)粒DNA體外 高 復(fù)雜，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重組DNA病毒病毒體外、體內(nèi) 較低 同源重組，基因治療重組RNA病毒病毒體外、體內(nèi) 高，可達(dá) 100 基因治療基因轉(zhuǎn)移方法DNA性質(zhì)轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)移效率 應(yīng)用（優(yōu)缺點(diǎn)）直接體內(nèi)注射法DNA、脂質(zhì)體DNADNA聚合物體內(nèi)低、不確定性基因治療第六十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因轉(zhuǎn)移的篩選系統(tǒng)陽性選擇系統(tǒng)隱性基因互補(bǔ)作用基因胸腺嘧啶激酶基因(thymidine kinase

46、 gene, tk) 二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolic reductase gene, dhft) 次黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移基因(hypoxanthine guanine phoshporibosyl-transferase gene, hgpt)氨基甲酰磷酸合成酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶二氫乳清酸酶(CAD) 鳥氨酸脫羧酶(GDC) 第六十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月顯性抗性基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin phoshpotransferase gene, neo) 黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(xanthine guanine phosphori

47、bosyl-transferase gene, xgprt) 腺嘌呤核苷脫氨酶(adenosine deaminase, ada) 天冬酰胺合成酶(asparagines synthetase gene, as) 多藥物抗性基因(human multidrug resistance gene, mdr) 第六十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月濕霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin resistant gene, hph) 突變的二氫葉酸還原酶(mDHFR)金屬硫蛋白基因(MT) 腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(adenine phosphoribosyl-transferase g

48、ene, aprt) 色氨酸合成酶基因(trytophane synthase gene) 組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene, hisD) 烏本苷抗性基因(ouabain resistant gene, ouar) 第六十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月陰性選擇系統(tǒng)在負(fù)性選擇系統(tǒng)中，攜帶某個(gè)活性基因的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中被殺死，而不帶有該基因，或該基因因?yàn)楦鞣N原因被滅活的細(xì)胞則存活下來，其作用機(jī)理是某基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性或者能將培養(yǎng)液中的一些成分轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)。有時(shí)此類基因也稱為“自殺性基因”，被用于腫瘤的基因治療中。胞嘧啶脫氨酶

49、基因(cytosine deaminase gene, CD) 胸苷激酶基因(thymidine kinase gene, tk ) 白喉毒素A鏈基因(diphtheria toxin A chain gene, DT-A) 第六十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)治療基因的表達(dá)水平治療基因的持續(xù)時(shí)間治療基因的可調(diào)控表達(dá)治療基因的組織特異性表達(dá)基因表達(dá)的檢測第六十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng) 誘導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)劑應(yīng) 用誘導(dǎo)效率熱休克熱細(xì)胞培養(yǎng)(Wurm et al 1986)低甲基硫蛋白重金屬組織培養(yǎng)(Mayo et al 1982)低甾體受體

50、雌激素及糖皮質(zhì)激素組織培養(yǎng)(Hunes et al 1981; Lee et al 1991; Braselmann et al 1993; Hu and Davidson, 1987)高Lac repressor操縱子IPTG組織培養(yǎng)(Hu and Davidson, 1987; Brown et al 1987; Deuschle et al 1989; Labow et al, 1990; Baim et al, 1991)高四環(huán)素四環(huán)素及衍生物組織培養(yǎng)(Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al, 1994,1995; Shockett et al. 1

51、995)、轉(zhuǎn)基因小鼠(Shockett et al, 1995)植物(Weinmann et al, 1995; Roder et al, 1994)很高EcdysoneMuristerone組織培養(yǎng)(Christopherson et al, 1992)很高GaL4 DNA結(jié)合區(qū)VP16孕酮受體配體結(jié)合區(qū)(突變)融合蛋白R(shí)U486 (孕酮拮抗劑)S.Y. Tsai等(Chua S.S. Burch, M.M. Y Wang等) 組織培養(yǎng) 、轉(zhuǎn)基因小鼠很高多種用途第六十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月靶向基因治療基因治療的理想：修復(fù)突變基因，恢復(fù)正常的基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制現(xiàn)行基因治

52、療：附加基因或其表達(dá)產(chǎn)物的治療，故又稱基因替代療法靶向基因治療的意義：選擇性針對(duì)患病組織細(xì)胞選擇性針對(duì)突變基因：突變基因的原位修復(fù)減少不必要的副作用，提高安全性第七十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)移基因的同源重組 轉(zhuǎn)移DNA 細(xì)胞核 染色體整合 附加體形式隨機(jī)整合(常見) 同源重組(稀有) 第七十一張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因修復(fù)：鑒定并修復(fù)錯(cuò)誤基因第七十二張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因靶向治療的策略第七十三張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向基因轉(zhuǎn)移一、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型的選擇調(diào)節(jié)1、改變Mo-HLV感染譜 按宿

53、主范圍可將Mo-HLV分為三類：單向性：只能感染嚙齒類細(xì)胞；異向性：可感染除嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞以外的其它的細(xì)胞；雙向性：可感染人及嚙齒類動(dòng)物等大多數(shù)細(xì)胞。感染細(xì)胞的類型是由病毒的外殼蛋白env確定的。（1）病毒與抗體的偶聯(lián)：為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒定向感染所需要的靶細(xì)胞，可將病毒與抗體偶聯(lián)，該抗體則針對(duì)所需感染細(xì)胞上特有的抗原。如使單向感染病毒與抗人MHC-1。MHC-II的抗體偶聯(lián)或與抗人表皮生長因子的抗體偶聯(lián)后，可以感染人類細(xì)胞。Goud等使用此法使單向病毒感染人的肝細(xì)胞，可惜病毒未能整合入肝細(xì)胞基因組，可能其中還有其它原因。第七十四張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）病毒外殼蛋白與配體

54、偶聯(lián)： 如將env蛋白與乳糖偶聯(lián)成去延酸糖蛋白，用此法改造的單向逆轉(zhuǎn)錄病毒將不再感染原先的宿主而只感染人的肝細(xì)胞，因?yàn)橹挥懈渭?xì)胞表面上含有去延酸糖蛋白的受體。 （3）改變病毒外殼蛋白的識(shí)別序列：已發(fā)現(xiàn)env蛋白與被感染細(xì)胞受體相識(shí)別部位的化學(xué)組成，如果改變核表位的基因序列，就可能改變感染細(xì)胞的類型，但Etienne等認(rèn)為有一個(gè)潛在的、非病毒原有的表位與細(xì)胞受體識(shí)別之后不能使病毒內(nèi)化。一種可行的方法是同時(shí)表達(dá)原有的env蛋白，就能解決內(nèi)化問題。第七十五張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、使用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體： 牛白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺腫瘤病毒有組織專一性感染的特點(diǎn)，

55、有些研究組利用其作為載體。Page等采用HIV作為病毒載體，Rizvi等用BLV作載體，Morris等采用MMTV作載體，并構(gòu)建了MMTV獨(dú)特的包裝細(xì)胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。第七十六張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、以嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染譜是由病毒顆粒決定的，改變病毒顆粒蛋白，即env基因改變感染宿主范圍。Laudau等用鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因，Miller等用長臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多種細(xì)胞，并取得較高的滴度Gong等用流感病毒的血凝素取代RS

56、V的env基因蛋白，將血凝素成功地嵌入病毒外殼，并能有效感染人和鳥類細(xì)胞Jane等用泡狀口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使該病毒顆粒能成功地感染非哺乳動(dòng)物如Zebra fish細(xì)胞，更重要的是這種病毒外殼可耐受超離心而不影響感染效率，因此有利于濃縮病毒，提高滴度。第七十七張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因組織專一性表達(dá)的調(diào)節(jié)1、肝專一性表達(dá)肝專一性表達(dá)多采用磷酸烯醇式酮酸羧激酶的啟動(dòng)子。McGrane 等用了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)使該啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，證明該啟動(dòng)子專一性地在肝和腎等中表達(dá)；Hatzoglau等用PEPCK啟動(dòng)子與neo基因或牛生長因子重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。克

57、隆后經(jīng)腹腔注射入子宮感染鼠胎肝或注入門靜脈并切除部分肝，證實(shí)前病毒可整合肝細(xì)胞基因組，并持續(xù)表達(dá)了八個(gè)月之久，而且牛生長因子表達(dá)量受食物刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)。第七十八張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月另一個(gè)肝專一性表達(dá)的片段是A-胰蛋白酶基因的順式作用因子。Simon等的研究表明，-AT基因上游是決定肝專一性表達(dá)的片段，（-13737）為最短的肝專一性表達(dá)的片段。Peng等用-AT的（-730-30）片段與SV40啟動(dòng)子融合驅(qū)動(dòng)人苯丙氨酸羥化酶基因，使其在肝臟專一性表達(dá)，為苯丙酮尿癥基因治療奠定了基礎(chǔ)。第七十九張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月-FP為肝癌細(xì)胞特有的高效表達(dá)產(chǎn)物，Wa

58、tanabe等發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)控區(qū)（-37003300）決定了-FP在肝癌中的專一性表達(dá)。Huber等將片段與你腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒后轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，然后給予無毒性原藥-阿拉伯糖核苷，只有肝癌細(xì)胞才專一性地合成TK，Pro-ara-MF轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性ara-ATP，造成肝癌細(xì)胞的死亡，而其它感染了-EF-TK的細(xì)胞不受影響。第八十張，PPT共九十二頁，創(chuàng)作于2022年6月受體介導(dǎo)靶向基因治療受體配體多聚陽離子靶細(xì)胞內(nèi)吞小泡溶解劑文獻(xiàn)去唾液酸醣蛋白(ASGP)受體ASGP* PLHepG2, HUH-7 原代肝細(xì)胞無，腺病毒，白喉毒素片段Wu, 1987,1988,1994;Chowdh

59、ury, 1996; Christiano, 1993；Fisher. 1994去唾液酸醣蛋白(ASGP)受體合成半乳糖配體 PL,OL, BisacridineHep G2, BNL Cl.2,HUH-7無，氯喹，腺病毒Plank 1992; Haensler, 1993； Midoux, 1993；Merwin 1994; Wadhwa 1995; Perales, 1994轉(zhuǎn)鐵蛋白受體轉(zhuǎn)鐵蛋白PL，Protamine,*PEI, Ethidium dimerK562, F-MEL, Hela, CFT-1，MRC-5, NIH/3T3, 黑色素瘤, 神經(jīng)母細(xì)胞瘤，纖維母 細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,

60、上皮細(xì)胞無，氯喹腺病毒，CELO病毒Rhinovirus,肽，甘油Cotten, 1990; Wagner, 1990; Zenke, 1990; Taxman, 1993; Kircheis, 1997胰島素受體胰島素陽離子修飾的白蛋白，PL，肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5，無Huckett, 1990; Rosenkranz, 1992纖維母細(xì)胞生長 因子(FGF)2受體FGF2 (堿性FGF)PLCos-1, 3T3, BNK，B16無，氯喹，Sosnowski, 1996葉酸受體葉酸PLKB，HeLa，Caco-2, SW620, SKOV氯喹腺病毒Mislick, 1995;Gottsc