醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、到顯微鏡室借顯微鏡，每人一臺(tái)。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室：3029130 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)辦：3029945主講：鄧保國(guó) 實(shí)驗(yàn)成績(jī)安排本實(shí)驗(yàn)成績(jī)共30分：考試10分（第五次實(shí)驗(yàn)課上測(cè)試）。實(shí)驗(yàn)報(bào)告10分。課堂表現(xiàn)、考勤、值日共10分。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)室生物安全二、無菌接種技術(shù)三、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察 一、實(shí)驗(yàn)室生物安全 實(shí)驗(yàn)室的危害源 生物因素：Biological hazard：指有害或有潛在危害的 生物因子對(duì)人、環(huán)境、生態(tài)和社會(huì)造成的危害 或潛在危害。 物理因素 化學(xué)因素 后兩者的特性： 1.可感知，易避免 2.危害范圍有限 3.危害持續(xù)時(shí)間短 實(shí)驗(yàn)室生物安全事件 2004年4月

2、，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心科研人員，采用未經(jīng)論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。實(shí)驗(yàn)室生物安全事件 2010年12月，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生因做實(shí)驗(yàn)而被感染布魯氏菌病。動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院院長(zhǎng)、黨總支書記被免職。實(shí)驗(yàn)室生物安全事件2014年6月美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心設(shè)在亞特蘭大的一間高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室，在對(duì)活炭疽菌進(jìn)行滅活時(shí)，沒有遵循正確的程序。隨后，他們將可能帶有活炭疽菌的樣本轉(zhuǎn)移到三個(gè)低級(jí)別實(shí)驗(yàn)室，而后者并不具備處理活炭疽的設(shè)施。6月6日至13日，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室可能讓芽胞成煙霧狀散開。由于相信樣本已經(jīng)滅活，低安全級(jí)別實(shí)驗(yàn)室的工作人員沒有穿上

3、適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)設(shè)備。最初報(bào)告稱，75名員工無意中接觸到炭疽菌，19日這個(gè)數(shù)字上升到86人。P4實(shí)驗(yàn)室P2實(shí)驗(yàn)室P1實(shí)驗(yàn)室操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，尚無有效預(yù)防或治療方法P3實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則學(xué)生進(jìn)微生物實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折， 要經(jīng)常清洗消毒。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指 定的儲(chǔ)物柜內(nèi)。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩

4、打鬧。手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡 手；避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料 要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。二、細(xì)菌接種技術(shù) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.掌握細(xì)菌的平板接種方法 2.熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法 接種用器材1.接種環(huán)和接種針2.生物安全柜 接種用器材 接種用器材3.滅菌器材4.培養(yǎng)基 概念:是人工配制的專供微生物生長(zhǎng)繁殖的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。 成分：充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽）；合適的pH；適宜的溫度；適宜的氣體環(huán)境。 接種用器材 各種培養(yǎng)基5

5、.恒溫培養(yǎng)箱 接種用器材細(xì)菌的接種技術(shù)接種環(huán)及其無菌操作方法普通瓊脂培養(yǎng)基接種法 1.平板分區(qū)劃線接種法：分離培養(yǎng)細(xì)菌，通過此法可以獲得純培養(yǎng)為進(jìn)一步鑒定細(xì)菌提供條件。 分區(qū)劃線（劃、轉(zhuǎn)、燒）劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸，以腕力在瓊脂表面輕快滑動(dòng)，不能劃破瓊脂。第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10，以后每次劃線約占面積的1/41/5。劃線為連續(xù)劃線,不能間斷，應(yīng)占滿平皿，劃線不能交叉重復(fù)，每次劃完后應(yīng)滅菌。2.斜面接種法：用于純菌的移種，可短時(shí)間保存 菌種。3.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動(dòng)力和生化反應(yīng)4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種生長(zhǎng)現(xiàn)

6、象的觀察固體培養(yǎng)基-菌落 一個(gè)細(xì)菌不斷分裂而成的細(xì)菌群體稱之為菌落。觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、邊緣、濕度、透明度；在血平板上還要觀察溶血情況和色素等。 斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基-鞭毛 觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)液體培養(yǎng)基混濁生長(zhǎng)（大多數(shù)細(xì)菌）沉淀生長(zhǎng)（鏈球菌）膜樣生長(zhǎng)（專性需氧菌，如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌） 操作內(nèi)容1.練習(xí)平板分區(qū)劃線法，液體，半固體，斜面培養(yǎng)基接種。2. 液體、半固體、斜面和平板培養(yǎng)基每人一個(gè)。三、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 一、不染色標(biāo)本檢查(活體） 懸滴法 壓滴法 二、染色標(biāo)本檢查 單染法：簡(jiǎn)單染色，一種染料 （美蘭染色） 復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色）革蘭染色(Gra

7、m stain) 1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。 革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義。目的： 掌握細(xì)菌涂片的制備及革蘭染色的方法 G+ 菌 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，經(jīng)革蘭氏染色后能夠?qū)埬懽吓c碘的復(fù)合物牢固留在壁內(nèi)。脂質(zhì)含量少，不容易被脫色液脫色而呈現(xiàn)紫藍(lán)色。G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄且交聯(lián)度低，含大量脂質(zhì)，易被脫除染料。原理：革蘭陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較 器材和試劑： 1.菌種 白色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)物 2.試劑 革蘭染色液 及其成分 龍膽紫液 龍膽紫、乙醇 碘溶液 碘、碘化鉀 脫色液

8、丙酮、乙醇 沙黃溶液 沙黃、乙醇 3.其它材料 接種環(huán) 載玻片 染色盤 洗液瓶 酒精燈等 沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果方法與步驟 1.細(xì)菌涂片的制備 涂片 干燥 固定 2.染色 龍膽紫液 碘液 脫色液 沙黃溶液復(fù)染 吸水紙吸干10s10s1020s10s沖洗，甩干沖洗，甩干沖洗，甩干10s 10s 10-20s 10sG+菌G-菌龍膽紫碘液丙酮、乙醇沙黃溶液 復(fù)染結(jié)果大腸桿菌（1000倍）革蘭陰性白色葡萄球菌（1000倍）革蘭陽性無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時(shí)間控制沖洗的方法，不要對(duì)著涂片區(qū)沖洗觀察后將玻片放入玻片缸中注意事項(xiàng) 意 義1.鑒別細(xì)

9、菌2.研究與致病性的關(guān)系3.指導(dǎo)臨床用藥G+G-G+ 致病 外毒素G- 致病 內(nèi)毒素G+ 青霉素、頭孢菌素等G- 鏈霉素、慶大霉素等 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）從細(xì)胞質(zhì)的基礎(chǔ)顆粒長(zhǎng)出，伸到細(xì)胞外面的細(xì)長(zhǎng)呈波狀彎曲的絲狀物。功能：鞭毛運(yùn)動(dòng)可鑒定、與致病性有關(guān)、具有抗原性（H抗原） 鞭 毛莢膜細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，厚度0.2m邊界明顯者稱為莢膜，厚度0.2m者稱為微莢膜功能：莢膜護(hù)菌強(qiáng)致病-抗吞噬作用、抗有害物質(zhì)損傷、抗干燥作用、黏附作用菌體內(nèi)部物質(zhì)縮水（60）形成圓或卵圓形小體。功能：芽胞形態(tài)辨細(xì)菌，滅菌標(biāo)準(zhǔn)抗力強(qiáng)。 芽 胞1.尋找視野：在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)

10、一步放大的部分移到視野的中心。2.增大光照強(qiáng)度：將聚光器上升到最高位置，光圈開到最大。3.轉(zhuǎn)高倍鏡頭、滴加鏡油、換油鏡頭：轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。油鏡的使用方法4.調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重新尋找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍高倍油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。5.清洗鏡頭：油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯（或乙醚）擦去殘余的香