7900型熒光定量PCR儀中文操作手冊

1、 # #美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀操作手冊 # # 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司技術(shù)服務(wù)部2003年ABIPrism7900HT中文操作手冊目錄ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊快速入門3ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊絕對定量4TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark20開機4 HYPERLINK l bookmark22新建文件4探針設(shè)置4 HYPERLINK l bookmark132參數(shù)設(shè)置5 HYPERLINK l bookmark50填樣品表6 HYPERLINK l book

2、mark62啟動循環(huán)7 HYPERLINK l bookmark64數(shù)據(jù)分析7 HYPERLINK l bookmark66查看結(jié)果7ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊相對定量9開機9 HYPERLINK l bookmark86新建文件9探針設(shè)置9參數(shù)設(shè)置10 HYPERLINK l bookmark100填樣品表11啟動循環(huán)12 HYPERLINK l bookmark32數(shù)據(jù)分析12設(shè)置STUDY12 HYPERLINK l bookmark116查看結(jié)果12ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊終點讀板.14開機14 HYPERLINK l book

3、mark122新建文件14 HYPERLINK l bookmark128設(shè)置DETECTOR和MARKER15參數(shù)設(shè)置16 HYPERLINK l bookmark134填樣品表16終點讀板16數(shù)據(jù)分析17 HYPERLINK l bookmark148查看結(jié)果17ABIPrism7900HT中文操作手冊ABIPrism7900HT中文操作手冊 ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊快速入門開機開電腦顯示屏電源，啟動電腦，進入WindowsNT操作系統(tǒng)，以用戶名Administrator登陸，密碼7900。待鼠標(biāo)沙漏消失，電腦完全啟動后，開7900HT電源，紅橙綠燈依次閃動2

4、次，然后綠燈點亮。雙擊桌而圖標(biāo)，打開SDS應(yīng)用軟件。新建文件菜單File-*New,新建一個空白文件。Assay代表試驗類型,實時定盤選AbsoluteQuantification；終點讀板選AllelicDiscrimination：Container指反應(yīng)板類型,根據(jù)需要選擇96孔板、384孔板或微雖反應(yīng)卡；Template項用丁調(diào)用事先設(shè)直好的模板文件:Barcode是反應(yīng)板的條形碼,可以用掃描儀掃入或者手工輸入。設(shè)置完畢，點OK確認(rèn)。填樣品表設(shè)定Detector：菜單Tools-*DetectorManager,點New新建探針，設(shè)定名稱、報告基團、淬火基團等相關(guān)參數(shù)：選定探針后點Co

5、pytoPlateDocument復(fù)制到板文件，指定各個孔所用探針、樣品名和樣品類型（未知樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對照，標(biāo)準(zhǔn)品并輸入拷貝數(shù)），掃描或輸入條形碼。循環(huán)參數(shù)切換到Instrument口，在Thermalprofile選單下設(shè)定、修改PCR循環(huán)的溫度、時間、反應(yīng)休枳等。其中AddADissociationStage指令儀器進彳了融解曲線試驗，只適用TSYBRGreenI熒光染料法：保存文件設(shè)世完畢，保存文件；也可以保存為模板文件，方便以后調(diào)用。啟動PCR在Instrument口點擊Open/Close按鈕，彈出樣品架（在主機的右側(cè)）。把樣品板置入托盤，再單擊Open/Close按鈕，樣品架動收

6、回并關(guān)閉上樣門。按Start開始實驗，開始時有樣品架到位、掃描頭到位、惣蓋丑溫等工作，籌待出現(xiàn)RemainTime若干時何后即開始U：式運行。數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)束，H動或F工設(shè)艸基線和閾俏，單擊Analyze分析結(jié)果,切換到Result窗口査看擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、腹始數(shù)據(jù)、實驗報告等試驗結(jié)果。保存數(shù)據(jù)，也可以Export各種數(shù)據(jù)。ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊絕對定量ABIPrism07900HT型熒光定雖PCR儀支持使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對核酸進行實時絕對定雖。請嚴(yán)格按照順序開機，以便儀器系統(tǒng)能夠正確地初始化，在乞個部分之間建立通訊聯(lián)絡(luò)。實驗開始前，主機和機械惰需預(yù)熱W分鐘以上。

7、電源打開以后，主機即開始加熱熱蓋，直到105co如果熱蓋尚未達(dá)到105C就開始實驗，儀器將Il動暫停，等待熱蓋溫度達(dá)到后才開始PCR。打開電腦顯示屏的電源：啟動電腦：啟動機械臂，電源開關(guān)在背而；啟動7900HT主機，可以看到紅橙綠燈依次閃動2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、新建文件啟動軟件按照下述路徑啟動SDS軟件:Start-Programs-AppliedBiosystems-*SDS2.1-SDS2.1也可以雙擊桌而上的快捷方式圖標(biāo)啟動SDS軟件。如果使用的是SDSEnterpriseDatabase,登錄時輸入用名和密碼，點OK。新建文件選擇菜單File-New。在Assay下

8、拉菜單中選AbsoluteQuantification(StandardCurve)(實時定呈模式，用丁核酸的絕對定星研究)：在Container下拉菜單中根據(jù)需要選擇所用的反應(yīng)板類型：96孔板、384孔板或微量反應(yīng)卡；在Template下拉菜單中選BlankTemplate如果只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反應(yīng)板的條形碼。點OK,軟件打開一個空白的反應(yīng)板文件。三、探針設(shè)置新建探針在SDS軟件中，選擇菜單Tools-DetectorManager,打開DetectorManager窗口。如果是第一次使用軟件，或者探針(Detector)沒有設(shè)直好，在DetectorManager對

9、話框中點New,新建探針。在AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所研究的基因座的名稱，如GAPDH、RNaseP等。不同探針給以不同的名字。(可選)在Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。指定ReporterDye和QuencherDye。報告基團通常是FAM或者VIC：TaqMan探針的淬滅基團選TAMRA,MGB探針的淬滅基團選None。點Color,在彈出的調(diào)色板中任意選擇一種顏色，點OK。（可選）在Notes欄輸入200字以下說明。設(shè)代完成后，點擊OK保存探針并返回DetectorManager頁而。該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)設(shè)置更多

10、的探針。復(fù)制探針文件探針設(shè)捏好后，在DetectorManager頁而.從探針列表中選擇探針.或者按住Ctrl鍵點擊.選擇多個探針，這些探針即被選黑；再點擊CopytoPlateDocument按鈕，探針被復(fù)制到板文件的WellInspector中。點Done關(guān)閉DetectorManager樹口。應(yīng)用探針在樣品表中，選擇含有第一種探針的所有樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針，該探針即顯示在樣品表的相應(yīng)孔中。重復(fù)1-2,設(shè)籃其余樣品所用的探針。設(shè)置樣品類型使用Ctrl和Shift鍵，在樣品表中選擇同一類型的所有樣品孔。在Wel

11、lInspector對話框中探針列表的Task的下拉菜單中選擇樣品類型：空白對照選NTC：耒知樣品選Unknown：C知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品選Standard。對丁標(biāo)準(zhǔn)品，還要（Quantity欄中輸入DNA模板的拷貝數(shù)，輸入后按Enter。四、參數(shù)設(shè)置切換到SDS軟件的Instrument頁而。根據(jù)需要，選擇或者不選9600Emulation如果選擇9600Emulation.SDS軟件將降低7900HT的升降溫速率，使之與7700樣。根據(jù)需要，修改PCR參數(shù)。在7900HT系統(tǒng)默認(rèn)的參數(shù)中，50C2min是UNG酶起作用的步驟，UNG爾可以預(yù)防先前的PCR產(chǎn)物可能對木次定量PCR造成的污染；如果

12、所用試劑中沒有UNG酶，請去掉此步；95C10min的作用是激活金牌Taq酚，同時火活UNG爾：如果用的不是金牌Taq爾，請去掉此步：后而40個循環(huán)的95C15sec和60C1min是定戢PCR的循環(huán)步驟。調(diào)整溫度/時間：拖動臥標(biāo)，選中需要修改的溫度或時間，輸入新的數(shù)值，回車：增加保溫、循環(huán)或步驟：點擊需要插入步驟處的左邊，出現(xiàn)粗黑豎線后，點擊AddHold、AddCycle或者AddStep按鈕，分別插入保溫、循環(huán)或步驟：刪除步驟：選中想要刪除的步驟，點擊DeleteStep按鈕。融解曲線試驗：點AddADissociationStage按鈕。注意：融解曲線試驗只適用TSYBRGreenI熒

13、光染料法，不適用丁熒光探針法。AutoIncrement：每循環(huán)1次，溫度和時間増加或減少一定幅度，一般不需設(shè)定。指定信號收集點：切換到DataCollection頁而，點擊每一個PCR循環(huán)步驟的平臺線或升降溫線,即出現(xiàn)信號收集標(biāo)志；再點擊一次，即消去信號收集標(biāo)志。最好每一步都收集信號。有關(guān)信號收集可以使用默認(rèn)設(shè)進，一般不需要改動。ABIPrism7900HT中文操作手冊ABIPrism7900HT中文操作手冊 # /BiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 設(shè)世反應(yīng)體枳：定戢PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)休枳是：96孔板50pL,384孔板10jjL,微呈反應(yīng)卡2pL：如果想修改的話，建議9

14、6孔板大T25pL,384孔板大T5jjL另外，同一塊板上所有孔的反應(yīng)體積必須一樣大小。設(shè)理參比熒光：如果使用的是ABI公司的定ffiPCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix.參比熒光(PassiveReference)選ROX：如果所用試劑中沒有參比熒光，請選None。五、填樣品表(可選)保存為模板菜單FileSaveAs：對丁企業(yè)版軟件，選擇File-*SaveTemplatetoDatabase給文件另外取一個名稱。在文件類型下拉菜單中，選SDSTemplates(.sdt)oOK。設(shè)置樣品名在反應(yīng)板上選中含有第一個

15、樣品的所有反應(yīng)孔。在SampleName欄輸入樣品名，回車。重復(fù)1和2,命名其余樣品。增加或編輯條形碼、備注在SDS軟件中.選擇ToolsDocumentInformation。在對話框中編輯條形碼或者備注。完成后，點OK。保存到數(shù)據(jù)庫在File下拉菜單選擇SaveDocumenttoDatabasec在UniqueName欄輸入文件名，Barcode欄掃描或者輸入條形碼。在Comment欄，輸入簡短的文件說明，點OK。在SaveDocument對話框，點OK。保存到文件系統(tǒng)在SDS軟件的File下拉菜單中選擇SaveAs。選好路徑，在FileName欄輸入文件名，也可以掃描或者輸入條形碼。點

16、Save。六、啟動循環(huán)準(zhǔn)備好反應(yīng)板。切換到SDS軟件的Instrument頁而。在Real-Time或者Plate-Read子頁面，點Open/Close,彈出樣品架(在主機的右側(cè))。把樣品板放在托盤上，再單擊Open/Close按鈕，樣品架H動收回進入儀器里面，并關(guān)閉上樣門。點擊Start按鈕開始實驗。開始時有樣品架到位、掃描頭到位、熱蓋升溫等工作，等待屏幕上顯示PCR進程和剩余時間后即開始正式運行。程序結(jié)束后點FileSave保存實驗結(jié)果。七、數(shù)據(jù)分析設(shè)代基線和闕值：在SDS軟件中，選擇AnalysisAnalysisSettings；在Detector下拉菜單中選擇探針：在Analysi

17、sSettings對話框中選擇|動或者手T確定6值，如果選擇手工方式，先輸入閾值，然后選擇H動或FT設(shè)代基線?；€（Baseline）的起點和終點確定脈則為：起點要避開前而幾個循壞dll-Stage2的95C高溫所導(dǎo)致的熒光信號增高（特別是國產(chǎn)試劑，升高比較明顯），設(shè)在信號開始達(dá)到本底的地方，一般在第3到第6個循環(huán)之間：肉為基線是指PCR開始時信號很低、處丁本底水平的那個階段：終點要設(shè)定在熒光信號有明顯增高處的詢而，一般選在本組實驗中最小的Ct值前再3個循環(huán)處：另外起點到終點之間的距離應(yīng)該大丁8個循環(huán)。菜單Analysis-Analyze,SDS軟件即開始分析數(shù)據(jù)，并在Results頁面顯示計

18、算結(jié)果。選擇FileSaveResultstoDatabase.保存實驗結(jié)果。八、查看結(jié)果擴增曲線切換到Result頁面，在AmplificationPlot口査看擴增llll線。在默認(rèn)的情況下，擴增Illi線的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對熒光信號強度，橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)（從1到40）；縱坐標(biāo)以對數(shù)表示，橫坐標(biāo)以線性表示。如果要看完全線性的S形圖譜，請雙擊縱坐標(biāo)軸線，打開坐標(biāo)設(shè)代謝口，將縱坐標(biāo)改成線性形式。原始數(shù)據(jù)切換到Component口，査看原始數(shù)據(jù)。正常惜況下，報告基團FAM的信號強度基線時約為4000-5000點，擴增完成后達(dá)到約25000-30000點，中間呈S形増長

19、；VIC的信號強度基線時約為4000-5000點,擴增完成后達(dá)到約15000-20000點,中間也呈S形增長;淬滅基團TAMRA的信號強度基線時比FAM稍低一點,到報告基團開始指數(shù)增長時它反而會向下降低：ROX信號比FAM的基線水平稍低一點，而且是水平穩(wěn)定的，不隨PCR進程而改變，肉為ROX是以固定的濃度加入到PCR試劑中的，并不參與PCR反應(yīng)。原始數(shù)據(jù)切換到Spectra子頁面，可以査看另一種脈始數(shù)據(jù)。與Component的區(qū)別是：Component顯示的是信號強度隨時間也就是PCR循環(huán)次數(shù)的變化，是縱向的；Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點上信號強度在不同波長上的分布，是橫向的。標(biāo)準(zhǔn)曲

20、線切換到StandardCurve口，査看標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：只有在Setup時輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后，軟件才能H動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗報告切換到Report窗口，査看實驗報告。確認(rèn)無誤后，保存結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export.再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出不同的數(shù)據(jù)，包括信號強度、療始數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開，并可在Excel中垂新生成擴増曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜。ABIPrism7900HT中文操作手冊ABIPrism7900HT中文操作手冊 /BiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 #ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊相對定量ABIPri

21、sm07900HT型熒光定雖PCR儀支持使用6值比較法對核酸進行實時相對定雖。請嚴(yán)格按照順序開機，以便儀器系統(tǒng)能夠正確地初始化，在乞個部分之間建立通訊聯(lián)絡(luò)。實驗開始前，主機和機械惰需預(yù)熱10分鐘以上。電源打開以后，主機即開始加熱熱蓋，直到105co如果熱蓋尚未達(dá)到105C就開始實驗，儀器將H動暫停，等待熱蓋溫度達(dá)到后才開始PCR。打開電腦顯示屏的電源：啟動電腦：啟動機械臂，電源開關(guān)在背而；啟動7900HT主機，可以看到紅橙綠燈依次閃動2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、新建文件啟動SDS軟件按照下述路徑啟動SDS軟件：Start-Programs-AppliedBiosystems-*S

22、DS2.1-SDS2.1也可以雙擊桌而上的快捷方式圖標(biāo)啟動SDS軟件。如果使用的是SDSEnterpriseDatabase,登錄時輸入用名和密碼，點OK。新建文件選擇菜單File-New。在Assay下拉菜單中選RelativeQuantificationDDCT（實時定呈模式，用丁核酸的相對定戢研究）:在Container下拉菜單中根據(jù)需要選擇所用的反應(yīng)板類型：96孔板、384孔板或微雖反應(yīng)卡：在Template下拉菜單中選BlankTemplate。如果只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反應(yīng)板的條形碼。點OK,軟件打開一個空白的反應(yīng)板文件。三、探針設(shè)置新建探針在SDS軟件中，選擇

23、菜單Tools-DetectorManager,打開DetectorManager窗口。如果是第一次使用軟件，或者探針（Detector）沒有設(shè)直好，在DetectorManager對話框中點New,新建探針。在AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所研究的基岡座的名稱，如GAPDH、RNaseP等。不同探針給以不同的名字。（可選）在Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。指定ReporterDye和QuencherDye。報告基團通常是FAM或者VIC：TaqMan探針的淬滅基團選TAMRA,MGB探針的淬滅基團選None。點Color,在彈出的調(diào)

24、色板中任意選擇一種顏色，點OK。（可選）在Notes欄輸入200字以下說明。設(shè)代完成后，點擊OK保存探針并返回DetectorManager頁而。該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)步驟設(shè)且更多的探針。復(fù)制探針文件探針設(shè)咒好后，在DetectorManager頁而.從探針列表中選擇探針.或者按住Ctrl鍵點擊.選擇多個探針，這些探針即被選黑；再點擊CopytoPlateDocument按鈕，探針被復(fù)制到板文件的WellInspector中。點Done關(guān)閉DetectorManager樹口。應(yīng)用探針在樣品表中，選擇含有第一種探針的所有樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Use項下的方

25、框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針，該探針即顯示在樣品表的相應(yīng)孔中。重復(fù)1-2,設(shè)習(xí)其余樣品所用的探針。設(shè)置樣品類型使用Ctrl和Shift鍵，在樣品表中選擇同一類型的所有樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Task的下拉菜單中選擇樣品類型：未知樣品選Target：內(nèi)對照（即管家基因）選EndogenousControL四、參數(shù)設(shè)置切換到SDS軟件的Instrument頁而。根據(jù)需要，選擇或者不選9600Emulation如果選擇9600Emulation.SDS軟件將降低7900HT的升降溫速率，使之與7700樣。根據(jù)需要，修改PCR參數(shù)。在7900HT系統(tǒng)默認(rèn)的參數(shù)中，5

26、0C2min是UNG酶起作用的步驟，UNG爾可以預(yù)防先前的PCR產(chǎn)物可能對木次定量PCR造成的污染；如果所用試劑中沒有UNG酶，請去掉此步；95C10min的作用是激活金牌Taq酚，同時火活UNG爾：如果用的不是金牌Taq爾，請去掉此步：后而40個循環(huán)的95C15sec和60C1min是定戢PCR的循環(huán)步驟。調(diào)整溫度/時間：拖動就標(biāo)，選中需要修改的溫度或時間，輸入新的數(shù)值，回車：增加保溫、循環(huán)或步驟：點擊需要插入步驟處的左邊，出現(xiàn)粗黑豎線后，點擊AddHold、AddCycle或者AddStep按鈕，分別插入保溫、循環(huán)或步驟：刪除步驟：選中想要刪除的步驟，點擊DeleteStep按鈕。融解曲線

27、試驗：點AddADissociationStage按鈕。注意：融解曲線試驗只適用TSYBRGreenI熒光染料法，不適用丁熒光探針法。AutoIncrement：每循環(huán)1次，溫度和時間増加或減少一定幅度，一般不需設(shè)定。指定信號收集點：切換到DataCollection頁而，點擊每一個PCR循環(huán)步驟的平臺線或升降溫線,即出現(xiàn)信號收集標(biāo)志；再點擊一次，即消去信號收集標(biāo)志。最好每一步都收集信號。有關(guān)信號收集可以使用默認(rèn)設(shè)直，一般不需要改動。設(shè)代反應(yīng)體積：定雖PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)休枳是：96孔板50|JL.384孔板10pL,微呈反應(yīng)卡2pL；如果想修改的話,建議96孔板大T25pL,384孔板大丁5pL

28、。另外,同一塊板上所有孔的反應(yīng)體積必須一樣大小。設(shè)理參比熒光：如果使用的是ABI公司的定MPCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix.參比熒光(PassiveReference)選ROX：如果所用試劑中沒有參比熒光，請選None。五、填樣品表(可選)保存為模板菜單FileSaveAs：對丁企業(yè)版軟件，選擇File-*SaveTemplatetoDatabase給文件另外取一個名稱。在文件類型下拉菜單中，選SDSTemplates(.sdt)oOK。設(shè)置樣品名在反應(yīng)板上選中含有第一個樣品的所有反應(yīng)孔。在SampleName欄輸

29、入樣品名，回車。重復(fù)1和2,命名其余樣品。編輯條形碼、備注在SDS軟件中.選擇ToolsDocumentInformation。在對話框中編輯條形碼或者備注。完成后，點0K。保存到數(shù)據(jù)庫在File下拉菜單選擇SaveDocumenttoDatabasec在UniqueName欄輸入文件名，Barcode欄掃描或者輸入條形碼。在Comment欄，輸入255字以下的文件說明，點0K。在SaveDocument對話框，點OK。保存到文件系統(tǒng)在SDS軟件的File下拉菜單中選擇SaveAs。選好路徑，在FileName欄輸入文件名，也可以掃描或者輸入條形碼。點Save。啟動循環(huán)準(zhǔn)備好反應(yīng)板。切換到SD

30、S軟件的Instrument頁而。在Real-Time或者Plate-Read子頁面，點Open/Close,彈出樣品架(在主機的右側(cè))。把樣品板放在托盤上，再單擊Open/Close按鈕，樣品架|動收回進入儀器里面，并關(guān)閉上樣門。點擊Start按鈕開始實驗。開始時有樣品架到位、掃描頭到位、熱蓋升溫等工作，等待屏幕上顯示PCR進程和剩余時間后即開始正式運彳亍。程序結(jié)束后點File-Save保存實驗結(jié)果。七、數(shù)據(jù)分析/SSBiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊/SSBiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 /BiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 #

31、在SDS軟件中，菜單Analysis-Analyze,SDS軟件即開始分析數(shù)據(jù),并在Results頁面顯示計算結(jié)果。八、設(shè)置Study(EnterpriseSoftwareonly)在SDS軟件中，確保板文件是打開的。選擇File-SaveResultstoDatabaseo點擊Study按鈕。在SelectStudy對話框，點New。在Name欄輸入名字，可以長達(dá)128個字母：Creator欄顯示操作者的賬號名稱，不可編輯：在Description欄輸入說明，可以長達(dá)255個字。點0K。選中新Study,點OK。在下而3種情況下，實驗數(shù)據(jù)被作為Sessiondata附加到Study中：每塊板

32、在定蚩PCR完成后立即被附加到Study中：如果使用機械臂，AutomationController軟件在操作過程中|動完成附加：SDSManager或RQManager軟件在分析數(shù)據(jù)的過程中|動完成附加。九、查看結(jié)果擴增曲線切換到Result頁面，在AmphficationPlot窗口査看擴增llll線。在默認(rèn)的惜況下，擴增曲線的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對熒光信號強度，橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)(從1到40)；縱坐標(biāo)以對數(shù)表示，橫坐標(biāo)以線性表示。如果要看完全線性的S形圖譜，請雙擊縱坐標(biāo)軸線，打開坐標(biāo)設(shè)代窗口，將縱坐標(biāo)改成線性形式。原始數(shù)據(jù)切換到Component口，査看原始數(shù)據(jù)。正

33、常惜況下，報告基團FAM的信號強度基線時約為4000-5000點，擴增完成后達(dá)到約25000-30000點，中間呈S形增長；VIC的信號強度基線時約為4000-5000點,擴增完成后達(dá)到約15000-20000點，中間也呈S形增長;淬滅基團TAMRA的信號強度基線時比FAM稍低一點,到報告基團開始指數(shù)增長時它反而會向下降低:ROX信號比FAM的基線水平稍低一點，而且是水平穩(wěn)定的，不隨PCR進程而改變，肉為ROX是以固定的濃度加入到PCR試劑中的，并不參與PCR反應(yīng)。原始數(shù)據(jù)切換到Spectra子頁面，可以査看另一種脈始數(shù)據(jù)。與Component的區(qū)別是：Component顯示的是信號強度隨時間

34、也就是PCR循環(huán)次數(shù)的變化，是縱向的；Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點上信號強度在不同波長上的分布，是橫向的。標(biāo)準(zhǔn)曲線切換到StandardCurve口，査看標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：只有在Setup時輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后，軟件才能M動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗報告切換到Report窗口，査看實驗報告。確認(rèn)無誤后，保存結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export.再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出不同的數(shù)據(jù)，包括信號強度、療始數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開，并可在Excel中垂新生成擴増曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜。ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊終點讀板ABIPrism7900HT型熒

35、光定量PCR儀支持各種使用TaqMan探針的等位基肉鑒定實驗.包括SNP篩査、基因突變檢測、物種鑒定、+/-檢測、等位基因鑒定等。所有等位基因鑒定實驗都可以分為兩個階段：1、PCR擴增：2、PCR后的熒光信號讀取(Post-read)和數(shù)據(jù)處理。第一步既可以在9700、9600等普通的PCR儀上進彳亍，也可以在7000、7900等定呈PCR儀上進行：第一步則必須在定雖PCR儀上進行。以下只敘述第二步Post-Read和數(shù)據(jù)處理的操作方法。如果第一步也在定量PCR儀上進行，請按實時定嵐的實驗方法設(shè)代軟件和運彳?。淮齈CR完成、數(shù)據(jù)保存好后，再按以下步驟操作。、開機請嚴(yán)格按照順序開機，以便儀器系統(tǒng)

36、能夠正確地初始化，在乞個部分之間建立必要的通訊聯(lián)絡(luò)。實驗開始前，主機和機械惰需預(yù)熱10分鐘以上。電源打開以后，主機即開始加熱熱蓋，直到105Co如果熱蓋尚未達(dá)到105C就開始實驗，儀器將暫停等待熱蓋溫度達(dá)到后才開始運轉(zhuǎn)。打開電腦顯示屏的電源：啟動電腦：啟動機械臂，電源開關(guān)在背而；啟動7900HT主機，可以看到紅橙綠燈依次閃動2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、新建文件啟動SDS軟件按照下述路徑啟動SDS軟件:Start-Programs-AppliedBiosystems-*SDS2.1-SDS2.1。也可以雙擊桌而上的快捷方式圖標(biāo)啟動SDS軟件。如果使用的是SDSEnterpriseD

37、atabase,登錄時輸入用名和密碼，點OK。新建文件選擇菜單File-New-在Assay下拉菜單中選AllelicDiscrimination；在Container下拉菜單中根據(jù)需要選擇所用的反應(yīng)板類型：96孔板、384孔板或384孔微雖反應(yīng)卡:在Template下拉菜單中選BlankTemplateo如果只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反應(yīng)板的條形碼。點OK,軟件打開一個空白的反應(yīng)板文件。三、設(shè)置Detector和Marker新建Detector在SDS軟件中，選擇菜單Tools-DetectorManager,打開DetectorManager窗口。如果是第一次使用軟件，或者

38、探針(Detector)沒有設(shè)直好，在DetectorManager對話框中點New,新建探針。在AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所研究基因位點的等位基因名稱，如AlleleRAllele2等。（可選）在Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。指定ReporterDye和QuencherDye。報告基團通常是FAM或者VIC：TaqMan探針的淬火基團選TAMRA,MGB探針的淬火基團選None。點Color,在彈出的調(diào)色板中任意選擇一種顏色，點OK。（可選）在Notes欄輸入200字以下說明。設(shè)代完成后，點擊OK保存探針并返回Detector

39、Manager頁而。該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)1-8,設(shè)置更多的探針。新建Marker在SDS軟件中，選擇菜單Tools-MarkerManager,打開MarkerManager口。如果Marker沒有設(shè)代好，在MarkerManager對話框中點New,新建Marker。在MarkerEditor對話框的Name欄輸入Marker的名字，建議使用所研究的基因位點的名稱，如D3S1169等。設(shè)雄完成后點OK,該名稱即出現(xiàn)在位點列表中。在左邊的位點列表中選中該名稱，然后在右邊的探針列表中Use項下方框中打鉤，選擇該Marker所用的Detector。一般每個Marker選兩個Detecto

40、r,FAM、VIC各一。如果需要，重復(fù)步驟3-4,設(shè)置更多的Marker。注意：實時定呈PCR只耍求設(shè)置Detector即可，而SNP實驗必須進一步設(shè)ftMarker,二者有區(qū)別。應(yīng)用Marker在SDS軟件的MarkerManager頁而，在左邊的位點列表中選擇所需Marker,點擊CopytoPlateDocument按鈕，該Marker的信息即分3行出現(xiàn)在WellInspector窗口中。根據(jù)需要繼續(xù)選擇其他所需Marker。點擊Done關(guān)閉MarkerManager窗口。在樣品表中，選擇含有第一種Marker的所有樣品孔。在MarkerInspector對話框中Marker列表的Use

41、項下的方框中，打鉤選擇要用的Marker,該Marker即顯示在相應(yīng)的樣品孔中。根據(jù)需要，重復(fù)步驟3-4,設(shè)置其余Marker。設(shè)置樣品類型使用Ctrl和Shift鍵，在樣品表中選擇同一類型的所有樣品孔。在WellInspector對話框中Marker列表的Task下拉菜單中選擇樣品類型：空白對照選NTC：所有樣品選Unknown。設(shè)捏參比熒光：如果使用的是ABI公司的定MPCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix.參比熒光（PassiveReference）選ROX：如果所用試劑中沒有參比熒光，請選None。點擊右上角的X按鈕關(guān)閉WellInspector窗口。四、參數(shù)設(shè)置切換到SDS軟件的Instrument頁而。PCR熱循環(huán)程序只有60C一個步驟，不需要修改。ABIPrism7900HT中文操作手冊/SSBiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 /BiosymsABIPrism7900HT中文操作手冊 #設(shè)世反應(yīng)休枳：終點讀板的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)休枳是：96孔板25pL,384孔板5pL.微雖反應(yīng)卡2pL