010實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞融合及血紅細(xì)胞通透性

1、細(xì)胞融合紅細(xì)胞膜滲透性觀察細(xì)胞融合（cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指兩個或兩個以上的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的現(xiàn)象。此雜交細(xì)胞具有很強(qiáng)的生命力，增殖旺盛。細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆細(xì)胞株的重要技術(shù)。 細(xì)胞融合在誘導(dǎo)物（如仙臺病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的細(xì)胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙核或多核細(xì)胞（此時稱同核體或異核體）。一、實(shí)驗(yàn)原理病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹

2、病毒等，其中仙臺病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或-丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對各種動物細(xì)胞都適宜，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點(diǎn)：仙臺病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會對細(xì)胞的生命活動產(chǎn)生干擾。病毒誘導(dǎo)融合在不同種類的動物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細(xì)胞凝集作用；聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞)不適用。聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合20世紀(jì)80年代建立起來

3、的電融合技術(shù)，是將兩種細(xì)胞的混合液置于低壓交流電場中，使細(xì)胞聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，以促使細(xì)胞融合。緊密排列的細(xì)胞，當(dāng)受到電擊時，這個區(qū)域就會被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞融合。電融合技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，如誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率高，對細(xì)胞無毒害作用，操作簡便，可重復(fù)性好。 電融合電融合儀1. 器具: 顯微鏡 離心機(jī) 天平 離心管 細(xì)滴管 載片、蓋片2. 試劑: 50%聚乙二醇(PEG)：稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50時，加入等體積并預(yù)熱至50的GKN液混勻。Alsver液：葡萄糖2.05g 檸檬酸鈉0.

4、8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000ml重蒸水中。0.85%NaCl液二、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法1.用注射器取2ml Alsver液，再從翼下靜脈取鴨血2ml，注入管內(nèi)，再加6ml Alsver液，混勻后置4冰箱中可備作3-4用。2. 實(shí)驗(yàn)時取“1”液1ml于離心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混勻平衡后以1200rpm(revolution per minute) /min離心5分鐘。3. 去上清液。再重

5、復(fù)“2”兩次，最后一次離心10分鐘。4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混勻使之成為細(xì)胞懸液。5. 在“4”液中加入68滴（約0.5ml）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下23min滴片鏡檢。四、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的鴨血細(xì)胞膜融合在一起，形成一個異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的鴨血細(xì)胞。五、融合率的計(jì)算 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個或兩個以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。作業(yè)：描述顯微鏡下細(xì)胞融合的變化，計(jì)算融合率。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它

6、可選擇性地讓某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。而對于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細(xì)胞膜的通透性是大不一樣的。當(dāng)細(xì)胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴(kuò)散，以至于在高滲環(huán)境中，細(xì)胞會失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細(xì)胞會吸水膨脹直至破裂。紅細(xì)胞膜滲透性觀察一、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容兔紅細(xì)胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1mg/ml生理鹽水）濕潤， 然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細(xì) 胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5%NaCl液 5,3,2,1,0 ml,然后分別加入蒸餾水，使每管總體積 達(dá)到5ml，配成一濃度梯度的NaCl液。3.向每一試管加入0.5ml兔紅細(xì)胞懸浮液，混勻。試管編號實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1.5% NaCl（ml） 5 3 2 1