植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)定義和過程

1、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)定義和過程一、 植物組織培養(yǎng)定義是指在無菌的條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷，長成新的完整植株的一種實驗術(shù)。1、探索階段（20世紀(jì)初至20世紀(jì)30年代）1902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭德（Haberlanclt）就預(yù)言，植物細(xì)胞具有全能性，即高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個細(xì)胞的觀點(diǎn)，并設(shè)想離體植物活細(xì)胞具有能夠發(fā)育成為完整植株的潛在能力。 而且進(jìn)行了相關(guān)實驗：培養(yǎng)植物葉片細(xì)胞。因此，被稱為 植物組織培養(yǎng)的father二 、發(fā)展歷史2、奠基階段（20世紀(jì)30年代中至50年代未）兩個重要

2、發(fā)現(xiàn)：1、認(rèn)識了B族維生素對植物生長的重要意義； 2、發(fā)現(xiàn)了生長素是一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。1933年我國的李繼侗和沈同研究銀杏的胚培養(yǎng)，將銀杏胚乳提取物加入培養(yǎng)基，獲得成功。1934年Went 發(fā)現(xiàn)了生長素。隨后相繼發(fā)現(xiàn)了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。B簇維生素。1934年，美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，使根的培養(yǎng)首次獲得了真正的成功。（培養(yǎng)基：無機(jī)鹽、酵母提取物和蔗糖，后來用3種B族維生素：吡哆醇、硫胺素和煙酸取代酵母浸提物獲得成功）1934年Gautheret在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加了B族維生素和IAA后，形成層的生長明顯增加，揭示了B族

3、維生素和IAA在植物組織培養(yǎng)中的作用，直接導(dǎo)致了1939連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。1939年Nobecourt的胡蘿卜也建立了連續(xù)生長的培養(yǎng)物。 故三人被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1943年,white 正式提出了植物細(xì)胞具有全能性的學(xué)說.1948年，Skoog和催澄在煙草莖段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除生長素（IAA）對芽形成的抑制作用，而誘導(dǎo)形成芽，從而確定了腺嘌呤/生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1956年，Miller發(fā)現(xiàn)了激動素后，用它代腺嘌呤的效果更好。1958年，在美國工作的英國人Stewward，從胡蘿卜愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中，誘導(dǎo)

4、分化產(chǎn)生了個體植株，給“全能性”理論以科學(xué)論證。3、迅速發(fā)展階段（20世紀(jì)60年代至現(xiàn)在）1960年，Cocking用真菌纖維素酶在番茄幼根分離得到大量活性原生質(zhì)體，開創(chuàng)了植物原生質(zhì)體和體細(xì)胞雜交研究工作。Kanta在植物試管受精研究中首次獲得成功。1960年，Morel用蘭花莖尖培養(yǎng)實現(xiàn)了脫去病毒和快速繁殖方面已獲成功，導(dǎo)致歐洲、美洲和東南亞等許多國家蘭花工業(yè)的興起。（莖尖-原球莖-小植株）1962年Murashige和Skoog發(fā)表了促進(jìn)煙草組織快速生長的培養(yǎng)基組成，這就是目前我們常用的MS培養(yǎng)基。1964-1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛葉曼佗羅花藥培養(yǎng)中由花粉

5、誘導(dǎo)得到了單倍體植株。1970年P(guān)ower首次成功實現(xiàn)原生質(zhì)體融合。1971年Takebe等首次由煙草原生質(zhì)體獲得再生植株，這一成功促進(jìn)了體細(xì)胞雜交技術(shù)發(fā)展，同時也為外源基因?qū)胩峁┝死硐氲氖荏w材料。1972年，Carlson等通過原生質(zhì)體事例首次獲得了兩個煙草物種的體細(xì)胞雜交種。1978年Murashige提出了人工種子的概念。20世紀(jì)80年代初，隨著土壤農(nóng)桿菌成功的用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，植物基因工程開始成為研究的熱點(diǎn)。1983年Zambryski首次用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。 三、特點(diǎn)1.培養(yǎng)條件可人為控制2.生長周期短繁殖率高3.管理方便，利于自動化4.遺傳品質(zhì)一致5.培養(yǎng)材料經(jīng)

6、濟(jì)6.誤差小、重復(fù)性強(qiáng)四、意義和應(yīng)用（1）能夠有效保持優(yōu)良品種特性（2）獲得無病毒植株（3）快速繁殖新品種，加速優(yōu)良品種推廣（4）節(jié)約耕地，提高農(nóng)民產(chǎn)品產(chǎn)出率（5）在遺傳、生理生化和病理等研究上的應(yīng)用（6）便于運(yùn)輸與種質(zhì)資源保存五 、 實驗室、設(shè)備要求和實驗室設(shè)計 植物組織培養(yǎng)是在無菌的條件下進(jìn)行離體植物材料培養(yǎng)的技術(shù)。要達(dá)到無菌操作和無菌培養(yǎng)，首先是要有一定的無菌環(huán)境，使用無菌的容器和用具（經(jīng)過滅菌處理的）進(jìn)行無菌操作，將無菌的植物材料接種在無菌的培養(yǎng)基上，然后把要培養(yǎng)的植物材料放在一定的溫度、濕度、光照、營養(yǎng)條件下，使其生長、發(fā)育和繁殖，這就必須要有一定的設(shè)備和條件。51 植物組織培養(yǎng)室的

7、基本結(jié)構(gòu) 選址： 在建造植物組織培養(yǎng)室時，應(yīng)選擇采光好、通風(fēng)好、環(huán)境干凈的地點(diǎn)，以利于組織培養(yǎng)的順利進(jìn)行和降低培養(yǎng)過程的污染率。 實驗室：植物組織培養(yǎng)工作的開展除需要培養(yǎng)室外，還應(yīng)該有與之配套的洗滌室、藥品室、稱量室、培養(yǎng)基配制室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實驗室、暗室和物品存放室等。 （1）洗滌室洗滌培養(yǎng)容器、小用具等，要求有工作臺面、上水和下水，水池、培養(yǎng)容器擺放支架、電源、電熱干燥箱等。洗滌室墻壁要有耐濕、防潮功能。新購進(jìn)的玻璃器皿首先要用1%左右濃度的稀鹽酸將可溶性無機(jī)物除去，再用中性洗滌劑洗滌，一般器皿的洗滌可用洗衣粉洗滌，或用洗衣粉加熱洗滌，用自來水沖洗干凈。對較難洗滌的培養(yǎng)容

8、器，如吸管等可在重鉻酸鉀洗液中浸泡后再洗，洗到玻璃表面上不沾水滴才算合乎要求。（2）藥品貯藏室 要求干燥、通風(fēng)，避免光照，有存放各種藥品試劑的藥品柜、冰箱等設(shè)備，化學(xué)試劑、玻璃器皿等物品分類存放于柜中，有毒物品（HgCl2）需要專人密封保存，需低溫保存的藥品和藥液放置于冰箱中貯藏，藥品貯藏室緊鄰化學(xué)稱量室較好，便于工作。（3）稱量室（天平室） 要求干燥、密閉，無直射光照，避免腐蝕性藥品和水氣直接接觸。有固定的水磨石平臺，安放普通天平和萬分之一分析天平（電子天平），要有電源插座，最好設(shè)計在陰面的房間，這樣對怕光藥品的保存和稱量有利，稱量室緊鄰培養(yǎng)基配制室較好，以方便配制母液和培養(yǎng)基。如房間較少時

9、，可以與藥品儲藏室合二為一。（4）培養(yǎng)基配制室主要進(jìn)行培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌前的暫時存放。配制的培養(yǎng)基需要實驗臺，上下水，電源，加熱設(shè)備等。配制培養(yǎng)基室要求備有各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、吸管等玻璃器皿，有安放藥品和器皿的各種櫥架、水浴鍋、過濾滅菌裝置和酸度計等。規(guī)模較小時， 可與洗滌室合并在一起。（5）培養(yǎng)基滅菌室器皿和培養(yǎng)基的消毒滅菌，最好在一個專用的滅菌室內(nèi)進(jìn)行。由于采用高溫高壓蒸汽滅菌方法，滅菌室最好有排除蒸汽的排風(fēng)扇等。建筑上要求其墻壁耐濕、耐高溫。有用于干熱滅菌的烘箱、濕熱滅菌的高壓蒸汽滅菌鍋、蒸餾水器、水源、水池，供、排水設(shè)施。有用于滅菌的兩相和三相電源或煤氣加熱裝置，擺放和

10、存放器皿和培養(yǎng)基的架子和櫥柜。規(guī)模小時，可與洗滌室和配培養(yǎng)基室合并。（6）培養(yǎng)基存放室滅菌的培養(yǎng)基最好存放一段時間后進(jìn)行接種工作，以防污染和損失苗木。規(guī)模小時，可與洗滌室、配培養(yǎng)基室和滅菌室合并。（7）過度室（緩沖室）為避免進(jìn)出時帶進(jìn)雜菌，無菌室外應(yīng)該設(shè)置預(yù)備室，作為緩沖間。預(yù)備室和無菌室之間最好用玻璃墻隔離，便于觀察和參觀。在預(yù)備室中可放置工作服、鞋、帽等，也需要安裝自來水、水池和紫外燈，用于接種前的洗手和紫外滅菌，電源開關(guān)最好安裝在預(yù)備室外邊，以免在開關(guān)燈時紫外線對眼睛和皮膚造成傷害。（8）接種室無菌室的好壞對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。無菌操作室主要進(jìn)行繁殖材料的表面滅菌和試管苗的繼代培

11、養(yǎng)和材料轉(zhuǎn)接，要求室內(nèi)干凈、密閉，光線好。一般安裝滑動門，以免造成空氣流動，引起污染。室內(nèi)墻壁光滑平整，地面平坦無縫，便于清潔工作。應(yīng)該安裝紫外燈，以便照射滅菌，還要有照明裝置及插座,以備臨時增加設(shè)備之用。室內(nèi)有超凈工作臺、接種用的小推車以及試管、三角瓶、塘瓷盤、酒精燈、接種工具等。平房易吸潮，容易引起污染，因此有條件的設(shè)計應(yīng)選擇樓房，最好在二層或二層以上，與其他區(qū)域隔離。為保證無菌室的良好條件，可預(yù)先用福爾馬林熏蒸，工作臺用70%酒精藥棉擦拭，在開紫外燈滅菌前應(yīng)該把所有需要的物品放入。不要造成死角，以免紫外燈無法照射到。此外還應(yīng)該設(shè)有消防設(shè)施。21 （9）培養(yǎng)室培養(yǎng)室是培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)和生長

12、的場所，培養(yǎng)室的大小應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)架的數(shù)量和生產(chǎn)規(guī)模而定。植物組織培養(yǎng)需要較長的培養(yǎng)時間，同時還須考慮溫度和光照的影響。通常培養(yǎng)室的溫度保持在適宜一般植物生長的范圍內(nèi)，多為2027 ，光照強(qiáng)度在1000 lx以上。一般光照強(qiáng)度1000-5000 Lx，每天光照時間816 h。 培養(yǎng)室應(yīng)設(shè)計成多個小培養(yǎng)間比一個大房間效果好，因為小的培養(yǎng)間容易控制溫度、光照等環(huán)境指標(biāo)，特別是培養(yǎng)材料較少時節(jié)能效果更為明顯。培養(yǎng)多種植物時的優(yōu)點(diǎn)更為突出，如不同植物所需的培養(yǎng)溫度、光周期不同，所設(shè)定的培養(yǎng)溫度和光周期不可能適合培養(yǎng)的每一種植物。小培養(yǎng)間也可以減少污染，培養(yǎng)室容易消毒和保持清潔。至少設(shè)計成一大一小兩間培養(yǎng)室

13、，這樣可以防止萬一環(huán)境污染，不至于全軍覆沒；也可以用大的培養(yǎng)間大量繁殖苗木，小的用來科研及少量珍稀品種試驗；當(dāng)不同培養(yǎng)材料需要不同的培養(yǎng)條件時，便于分別處理。（10）細(xì)胞學(xué)實驗室 為觀察、記錄培養(yǎng)材料的生長情況及實驗結(jié)果，需要有細(xì)胞學(xué)實驗室。細(xì)胞學(xué)實驗室應(yīng)有固定的水磨石臺面，放置顯微鏡、解剖鏡等儀器。室內(nèi)應(yīng)安靜、干凈、清潔、明亮，保證光學(xué)儀器不振動、不受潮、不污染。室內(nèi)還應(yīng)該有一套染色設(shè)備，因為有時為了觀察清楚需要染色或進(jìn)行制片觀察。（11）暗室 試驗材料的攝影記錄，一般可以用裝有照相裝置的顯微鏡、解剖鏡進(jìn)行，有時需要用照相機(jī)直接拍攝完整材料。進(jìn)行拍攝后需要沖卷和洗相，這就必須有配套的暗室，以

14、便及時看到結(jié)果。在暗室應(yīng)有沖洗、印相、放大、上光等設(shè)備。有固定的水泥工作臺面，還要有電源和自來水裝置。（12）物品存放室暫時不用的器皿、用具等貯存在物品存放室內(nèi)。物品存放室應(yīng)當(dāng)設(shè)計在背陽、通風(fēng)的房間，室溫較低，一般用樓房的低層的陰面房間較好，便于搬運(yùn)。（13）溫室（大棚） 試管苗移栽必須在溫室或塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。試管苗移栽時一般要求溫室最低溫度在15 以上，相對空氣濕度在70%以上。52組織培養(yǎng)常用儀器設(shè)備及要求（1）玻璃器皿植物組織培養(yǎng)工作對玻璃器皿的需要是靈活多樣的，多種器皿都可使用。玻璃器皿最好用硼硅酸鹽（即派熱克斯玻璃）材料制造，一般要求溶解度小，其形狀可根據(jù)研究工作的目的和要求而定。（

15、A） 培養(yǎng)容器培養(yǎng)用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高壓蒸汽滅菌。根據(jù)培養(yǎng)目的和要求不同，可采用不同種類和規(guī)格的玻璃器皿。試管 在需要少量培養(yǎng)基進(jìn)行研究、接種外植體或進(jìn)行幼胚培養(yǎng)（如桃幼胚等）的實驗中，可以選用試管進(jìn)行培養(yǎng)。要求試管口徑要大、長度稍短，便于操作，以2.0cm15cm、2.5cm15cm、3.0cm15cm為宜。三角瓶 又叫三角燒瓶和錐形瓶，具有瓶口小，瓶底大，培養(yǎng)面積大，受光好，易放置，培養(yǎng)效果好，在植物組織培養(yǎng)中最常用。接種外植體時多用容積為50mL的三角瓶，一般實驗用100mL的三角瓶，生產(chǎn)育苗多用150mL的三角瓶。近年來，三角瓶在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用愈來愈廣泛，無論是固體培養(yǎng)還

16、是液體培養(yǎng)，都可用三角瓶。一般用口徑2.5cm3cm的大口徑三角瓶較好。果醬瓶或罐頭瓶 成本低，瓶口大，操作方便，透光好，培養(yǎng)材料生長健壯，但培養(yǎng)污染率較高。生產(chǎn)中應(yīng)用較多的是200mL的果醬瓶，也有用較大的罐頭瓶。培養(yǎng)皿 在無菌材料分離、濾紙滅菌、種子發(fā)芽、病毒鑒定時較常用，其規(guī)格有直徑6cm、9cm、12cm的。固體平板培養(yǎng)一般采用直徑6cm的小型培養(yǎng)皿。此外，可以用培養(yǎng)皿室內(nèi)催芽，以供培養(yǎng)時取材之用。在無菌室還可以在培養(yǎng)皿中解剖莖尖、分離花粉、切割繼代培養(yǎng)物及其他外植體或培養(yǎng)材料。植物組織培養(yǎng)專用容器 這是一種新型組培專用容器，采用進(jìn)口高分子PC（俗稱太空玻璃）為主要材料生產(chǎn)，在高壓蒸汽

17、滅菌條件下反復(fù)使用不破裂、不變形，使用壽命長，透光率高于玻璃容器。最大的優(yōu)點(diǎn)是不易破碎，符合機(jī)械化洗瓶要求，利于降低損耗和工廠化生產(chǎn)。瓶口包扎，以達(dá)到防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染的目的?？捎枚喾N方法，通常以紗布包被棉花塞，外邊再包一層牛皮紙，用線繩或橡皮筋捆扎，也可用封口膜、鋁箔、雙層硫酸紙、耐高溫的塑料紙、耐高溫的塑料蓋。（B） 盛裝器皿盛裝容器主要是存放各種試劑和藥液。磨口瓶 包括無色和棕色兩類，細(xì)分為廣口瓶、細(xì)口瓶，規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL，廣口瓶用于存放試劑，細(xì)口瓶用來分裝配制好的各種母液。不易保存的母液存于冰箱中低溫保存，見光易分解的藥品可用棕色瓶安全保存。

18、 滴瓶 盛裝一定濃度的酸液或堿液，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。其中堿液用塑料滴瓶更好。搪瓷鍋（盆）或不銹鋼鍋（盆） 用于配制和熬制培養(yǎng)基，研究可用較小的規(guī)格，如1000mL規(guī)格的搪瓷缸，或4000mL規(guī)格的搪瓷鍋，生產(chǎn)上要選較大的規(guī)格，如8000mL或更大規(guī)格的不銹鋼鍋較好，可提高勞動效率。燒杯 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各種母液和培養(yǎng)基。（C） 計量器皿計量器皿要求有準(zhǔn)確的刻度，以便于在配制各種母液及培養(yǎng)基時能準(zhǔn)確定量，減少實驗誤差。容量瓶 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各種母液時定容?？潭任?又叫移液

19、管，規(guī)格有10mL、5mL、1mL、。用于吸取各種母液。量筒 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、25mL 、10mL、5mL，用于配制不同濃度的酒精和配制培養(yǎng)基時吸取大量元素母液等。（D）其他 除以上各種容器外，還應(yīng)具備一些其他玻璃器皿，如漏斗、稱量瓶、玻璃棒等，以便用于培養(yǎng)基的制備等工作。有條件時，還可以配備培養(yǎng)基分裝器，由大型滴管、漏斗、橡皮管及鐵夾等構(gòu)成。此外，還有量筒式分裝器，上有刻度，下有橡皮管及鐵夾控制。微量分裝可用注射器。（2）儀器與設(shè)備天平 可以根據(jù)實際需要配備選擇如下稱量儀器。天平應(yīng)放在干燥，避免震動，無腐蝕性藥品的地方，應(yīng)盡量避免移動，天平匣

20、內(nèi)應(yīng)放硅膠或其他中性干燥劑以保持干燥。（A） 藥物天平稱量精度為，用來稱取蔗糖和瓊脂等。（B） 扭力天平 既移動方便，又較為靈敏的稱量儀器，可彌補(bǔ)藥物天平和分析天平各自的不足，精度為，而且在1g 內(nèi)的物品不用加砝碼，故使用方便。（C） 分析天平 精度為，用來稱取微量元素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及微量附加物。選擇平穩(wěn)，干燥，沒有腐蝕性藥品和水氣的地方放置天平。（D） 電子天平 精度高、稱量快、但價格較高。冰箱 分普通冰箱和低溫冰箱。某些試劑、藥品和母液需低溫保存；有些材料需低溫處理。一般備有家庭用冰箱即可。烘箱和恒溫箱 洗凈后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱內(nèi)烘干，溫度以80100為宜。若需要干熱

21、滅菌，溫度升高至150180，持續(xù)13h即可。在進(jìn)行培養(yǎng)物的干重分析時，可在80條件下烘干。恒溫箱即可用于植物原生質(zhì)體和酶制劑的保溫，也可用于組織培養(yǎng)中暗培養(yǎng)。恒溫箱內(nèi)裝上日光燈可進(jìn)行溫度及光照方面的小型實驗。顯微鏡 一般用雙目體視顯微鏡較多，用于剝?nèi)∏o尖以及隔瓶觀察內(nèi)部植物組織生長情況。同時也還要有生物顯微鏡，用以觀察花粉發(fā)育時期及培養(yǎng)過程中細(xì)胞核的變化等。此外，倒置顯微鏡可以從培養(yǎng)器皿的底部觀察培養(yǎng)物，因此，在液體培養(yǎng)時，可用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。酸度計（pH試紙也可） 培養(yǎng)基中的pH值十分重要，因此，在配制培養(yǎng)基時，需要用酸度計測定和調(diào)整。一般用小型酸度測定儀，既可在配制培養(yǎng)基時使用，也可

22、測定培養(yǎng)過程中pH值的變化。若不做研究，僅用于生產(chǎn)，也可用精密pH47的試紙來代替。測定培養(yǎng)基pH值時，應(yīng)注意攪拌均勻后再測。蒸餾水器 水中常含有無機(jī)和有機(jī)雜質(zhì)，如不除去，勢必影響培養(yǎng)效果。植物組織培養(yǎng)中常使用蒸餾水或去離子水，蒸餾水可用金屬蒸餾水器大批制備，要求更高的用硬質(zhì)玻璃蒸餾水器制備。去離子水是用離子交換器制備的，成本低，但不能除去水中有機(jī)成分。一般生產(chǎn)性的組培育苗，對水要求不太高，除配制各種母液用蒸餾水或去離子水外，配制培養(yǎng)基所用水可以用自來水代替，如果當(dāng)?shù)厮|(zhì)較硬，可以用煮沸過并沉淀去雜質(zhì)后的白開水，以降低生產(chǎn)成本?？照{(diào)器（空氣調(diào)節(jié)器） 夏季高溫不利于試管苗生長繁殖，常常造成組培苗

23、生長不良，或引起玻璃化等不良反應(yīng)，需要購置空調(diào)器降溫，空調(diào)器功率應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)室大小來定。超凈工作臺 如有條件購置先進(jìn)設(shè)備超凈工作臺，既方便，又舒適，無菌效果又好，它可代替無菌室和接種箱。超凈工作臺原系工業(yè)用于半導(dǎo)體元件與精密儀器儀表的裝置，現(xiàn)已成為植物組織培養(yǎng)上最常用、最普及的無菌操作裝置。它有單人、雙人、及三人式的，也有開放和密封式的。超凈工作臺一般較寬，購置和設(shè)計房屋時應(yīng)注意，以防房門太窄而搬不進(jìn)去。超凈工作臺主要是通過風(fēng)機(jī)，將送入的空氣經(jīng)過細(xì)菌過濾裝置，再流過工作臺面。因此超凈工作臺應(yīng)放置在空氣干凈、地面無灰塵的地方，以延長使用期。使用過久，引起堵塞，需要清洗和更換過濾器。培養(yǎng)架 進(jìn)行固體

24、培養(yǎng)和試管苗大量繁殖時，需要有放置培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)架。制作培養(yǎng)架時應(yīng)考慮使用方便、節(jié)能、充分利用空間以及安全可靠。架子可用金屬、木材制作，隔板可用玻璃、木板、纖維板、金屬板等，最好用平板玻璃或鐵絲網(wǎng)，既透光，上層培養(yǎng)物又不受熱。這里介紹一種效果好、容量大、使用較安全、較適用的培養(yǎng)架，立柱用直徑30 mm左右的鋼管，橫架用25 mm角鋼焊制而成，燈座裝于每層兩側(cè)的橫架上，其上有槽，用于固定燈座。每層裝40 W日光燈23個，鎮(zhèn)流器最好裝于室外以利于散熱。也可在兩端橫架下方68 cm另裝一橫檔，其上裝燈座和啟動器。還有一種叫為萬能角鐵的配件，其長度為3 m，可切割成不同長度的配件，用于組裝培養(yǎng)架。此種培

25、養(yǎng)架可以任意組裝，并且造價較低。1根萬能角鐵原料售價一般在20元人民幣，1個培養(yǎng)架用10 根，加上螺絲等小型配件，1個培養(yǎng)架造價在300元以內(nèi)，較由其他的原料制成的培養(yǎng)架成本低。木制和鋁制造價和鐵制的造價均在500元以上，并且顯得笨重，特別是木制的容易發(fā)生火災(zāi)。滅菌裝置 高壓蒸汽滅菌鍋是最基本的設(shè)備，用于培養(yǎng)基、器械等的滅菌。有大型臥式、中型立式和小型手提式等多種，可按生產(chǎn)規(guī)模來選用，大型效率高、小型方便靈活。小型手提式有內(nèi)熱式和外熱式兩種，內(nèi)熱式加熱管在鍋內(nèi)，省時省電，但不能用火爐加熱；外熱式可用電爐、煤爐、煤氣等加熱。手提式內(nèi)熱小型高壓滅菌鍋配一個3 kw調(diào)壓變壓器和定時鐘，可實現(xiàn)半自動滅

26、菌，并省電40%。此外，應(yīng)有紫外線燈、水浴鍋、室內(nèi)小推車、振蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)及其他培養(yǎng)裝置。（3）用具和器械 組織培養(yǎng)所需要的用具和器械，可選用醫(yī)療器械和微生物實驗所用的器具。常用的用具和設(shè)備如下。鑷子 小型尖頭鑷子，適用于攝取植物組織和分離莖尖、葉片表皮等。長1625cm的槍形鑷子，腰部彎曲，使用方便，可用于接種和轉(zhuǎn)移植物材料。剪刀 常用的有解剖剪和彎頭手術(shù)剪，一般用于試管內(nèi)剪取莖段，進(jìn)行繼代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)接。在剪取外植體時，特別是木質(zhì)化程度較高的枝條常用剪枝剪（修枝剪），在果樹組織培養(yǎng)中，枝條修整時也需要修枝剪。解剖刀和芽接刀 常用的解剖刀，有長柄和短柄兩種。刀頭也有雙面和單面之分，可以經(jīng)常

27、更換。對大型材料如塊莖、塊根等需用大型解剖刀。果樹的枝芽常需要芽接刀。接種工具 包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成，用來接種花藥或轉(zhuǎn)移植物組織。鉆孔器 取肉質(zhì)莖、塊莖、肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時使用。鉆孔器一般做成T形，口徑有各種規(guī)格。細(xì)菌過濾器 溶液中有些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以及有機(jī)附加物質(zhì)，如吲哚乙酸等，在高溫條件下易被分解破壞，可用細(xì)菌過濾器來除菌?？刹捎媒饘僦频牟淌下┒?，以石棉微孔濾膜（孔徑為m）除去細(xì)菌。在過濾較少量的液體時，宜用醋酸纖維素或硝酸纖維素物質(zhì)制成的微孔濾膜，其孔徑為m。這種濾膜在氧氣存在下，能經(jīng)受125高溫滅菌。在過濾滅菌時需要一套加壓（注射器）或減壓吸濾設(shè)備，漏斗下接吸濾

28、瓶，吸嘴處接上一只內(nèi)裝脫脂棉的濾氣玻璃管。 注射器 普通的皮下注射器頭上安裝濾板夾，其上有m濾板，構(gòu)成一個微孔濾板微量注射器。可用來過濾滅菌，也可以用于微量懸滴培養(yǎng)中的營養(yǎng)液的分裝。其他 灼燒工具用的酒精燈、用于溶解培養(yǎng)基的帶有磁攪拌器的電爐、用于加速溶解大量瓊脂培養(yǎng)基的微波爐、用于貯備無離子水和重蒸餾水的大型塑料桶、試管架以及轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶、試管架的搪瓷盤或小鐵籃等。另外，可以根據(jù)培養(yǎng)效果的好壞和成本的高低選用適當(dāng)?shù)钠咳屯庹?。一般試管和燒瓶可用未?jīng)脫脂的棉花塞（有時包上紗布或粗布），亦可用泡沫塞子或鋁箔塞。鋁箔也用以包裹棉塞和泡沫塞，也可以用能經(jīng)受高壓滅菌的塑料蓋。近年來，有一種透明的、可進(jìn)行

29、高壓消毒的封口薄膜，既防止污染，又可使空氣透過，并有良好的透光作用。預(yù)先滅菌的或經(jīng)過高溫滅菌的培養(yǎng)器皿也可用帕拉膠片（parafilm）密封，該膠片是一種蠟制的、不能進(jìn)行高溫滅菌、可伸展的黏性薄片或膠帶。也有只用兩三張羊皮紙或其他紙來包扎瓶口。六 培養(yǎng)基的配制、滅菌及操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)成功與否，一方面取決于培養(yǎng)材料本身的性質(zhì),另一方面取決于培養(yǎng)基的種類和成分，所以組織培養(yǎng)的發(fā)展與培養(yǎng)基的改進(jìn)是分不開的。不同的植物材料對培養(yǎng)基的要求不同，因而必須根據(jù)不同的植物材料以及不同的培養(yǎng)目的選擇合適的培養(yǎng)基，并按照不同的培養(yǎng)階段加入適當(dāng)?shù)奶砑游?。作為主要碳源的蔗糖、支撐物瓊脂的濃度及培養(yǎng)基的pH值都會影

30、響外植體和培養(yǎng)材料的生長和發(fā)育。培養(yǎng)基通常有兩個水平（或兩個組成部分）一、是基本培養(yǎng)基，包括大量元素和微量元素（無機(jī)鹽類），維生素和氨基酸，還有糖和水等。迄今為止，基本培養(yǎng)基已有幾百種，但較常用的僅一二十種，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等基本培養(yǎng)基。二、是完全培養(yǎng)基，即在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)各種不同試驗要求，附加一些物質(zhì)，如添加各種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（BA、ZT、KT、2IP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等）以及其他的復(fù)雜有機(jī)附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽膏等。61 培養(yǎng)基的營養(yǎng)及成分（2）無機(jī)鹽無

31、機(jī)鹽是植物生長發(fā)育所必需的化學(xué)元素。在植物組織培養(yǎng)時，各種營養(yǎng)物質(zhì)主要從培養(yǎng)基中獲得，如氧、氫元素從水中得到，礦質(zhì)元素要靠加入適宜的無機(jī)鹽類物質(zhì)提供。培養(yǎng)基中除了氧、氫、碳有機(jī)物外，剩下的為礦質(zhì)元素，包括N、P、K、S、Ca、Mg等大量元素和Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等微量元素。 （1）水大量元素 大量元素常占植物體干重的百分之幾至萬分之幾氮是最重要的。一般用硝態(tài)氮或氨態(tài)氮。即無機(jī)氮在培養(yǎng)基中有兩種供應(yīng)形式，一種是硝酸鹽；另一種是氨鹽。當(dāng)作為唯一的氮源時，硝酸鹽的作用要比氨鹽好得多，但在單獨(dú)使用硝酸鹽時，培養(yǎng)基的pH值會向堿性方向漂移。若在硝酸鹽中加入少量氨鹽，則會阻止這種漂移。因此，培

32、養(yǎng)基既含有硝酸鹽又含有氨鹽為好。磷對植物的生命活動具有十分重要的作用，缺磷時蛋白質(zhì)合成降低。鉀、鈣、鎂、硫等元素能影響植物組織中酶的活性，決定著新陳代謝的過程。微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Co多種微量元素，用量10-510-7mol/L，植物對這些元素的需要量甚微，稍多即會發(fā)生外植體變性、酶失活、代謝障礙等毒害。微量元素對植物組織的生命活動都有重要作用。如硼促進(jìn)生殖器官的發(fā)育,影響蛋白質(zhì)的合成和授粉受精；銅有促進(jìn)離體根生長的作用；錳與呼吸作用和光合作用有關(guān)。鋅是各種酶的構(gòu)成要素，增強(qiáng)光合作用效率，參與生長素代謝。Fe鹽 對葉綠素的合成與延長生長起重要作用。鐵元素不易被植

33、物直接利用和吸收，通常以硫酸亞鐵和Na2-EDTA(螯合劑)配制成螯合物用于培養(yǎng)基中。早期配方中曾采用過硫酸鐵Fe2(SO4)3，后又用氯化鐵（FeCl2）代替硫酸鐵，但它們都不是理想的鐵供應(yīng)源。在根培養(yǎng)時，接種后一周，采用氯化鐵的培養(yǎng)基的pH值就由偏移到，根開始表現(xiàn)出缺鐵癥。與根不同，愈傷組織由于能分泌與鐵離子相結(jié)合的天然螯合物，可以在一定程度上利用鐵鹽。（3）有機(jī)化合物 主要包括碳源（也是能源）、維生素類、氨基酸及其他有機(jī)附加物。碳源 植物組織在離體之后，由于沒有葉綠體或只有發(fā)育不好的葉綠體，基本上不能制造需要的碳水化合物，難以依靠自養(yǎng)作用維持其生存，必須在培養(yǎng)基中另外加入碳水化合物，它所

34、需要的碳素是以各種糖的形式提供于培養(yǎng)基中。糖除了在培養(yǎng)基提供培養(yǎng)物所需的碳骨架和能源外，還可在一定程度上調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最為重要。一般來說，蔗糖是最好的糖源，它具有熱易變（heat-liable）的性質(zhì)，經(jīng)高壓滅菌后，大部分分解為D-葡萄糖、D-果糖，只剩下部分的蔗糖，這更有利于吸收和利用。此外也可以直接利用果糖、葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖等。也有利用多糖類的可溶性淀粉和糊精以及果膠的報道。 常用的糖濃度為15%。糖的濃度不只是對細(xì)胞增殖有作用，同時也是影響細(xì)胞分化的因素之一。 維生素類 主要以各種輔酶的形式多項代謝活動，對生長分化有一定的作

35、用。完整植株是能夠制造維生素的，但是離體組織卻不能合成足夠的維生素。常用的維生素濃度約之間。其中鹽酸硫胺素（維生素B1）是絕對需要的（全面促進(jìn)植物生長），一般加煙酸（維生素B3）、鹽酸吡哆醇（維生素B6）對根的生長好處。維生素?zé)嵋鬃冃裕自诟邷叵陆到?，可進(jìn)行過濾滅菌，添加肌醇能改善培養(yǎng)植物的生長狀況，在培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L的肌醇就足以影響維生素B1的效應(yīng)。加泛酸鈣（維生素B5）、生物素（維生素H）以及抗壞血酸（維生素C），但它們并不是普遍的限制因子。氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機(jī)氮源，除構(gòu)成生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶等）的基本組成外，還具有緩沖作用和調(diào)節(jié)培養(yǎng)物體內(nèi)平衡的功能，對外

36、植體的芽、根、胚狀體的生長、分化有良好的促進(jìn)作用。常用的氨基酸有甘氨酸、酰胺類物質(zhì)（如谷酰胺、天門冬酰胺）和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。此外還有谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。 天然復(fù)合物 天然復(fù)合物的成分比較復(fù)雜，大多數(shù)含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。由于其對一些難培養(yǎng)的培養(yǎng)材料有特殊作用，所以在一些試驗中還常常應(yīng)用它。常用的天然復(fù)合物有椰乳（CM，100-200mL/L）、玉米胚乳、香蕉汁（150-200mL/L）、馬鈴薯汁（100-200mL/L）、 、水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白（LH）、酵母提取液（YE，0.5%）、麥芽浸出物（ME）、蘋果汁

37、等。由于它們是天然有機(jī)物，其成分往往不一，這些差異將會影響實驗的重復(fù)性。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，雖然用量少，但對外植體愈傷組織誘導(dǎo)和根芽等器官分化，起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用。影響最顯著的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是生長素類和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。生長素類：促進(jìn)細(xì)胞的伸長生長和細(xì)胞分裂，被用于誘導(dǎo)愈傷形成，促進(jìn)生根。生長素類中的吲哚乙酸（IAA）由于比較容易被氧化而很少使用，常用的是二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚-3-丁酸（IBA）。誘導(dǎo)愈傷組織用2,4-D、NAA，用量：細(xì)胞分裂素類:可促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和不定芽形成，打破頂端優(yōu)勢形成叢生芽，有利于芽的增殖，常

38、用于繼代和增殖培養(yǎng)。激動素(KT)、異戊烯基腺嘌呤（2iP）、6-芐基腺嘌呤（BAP）、玉米素（Zt）、噻重氮苯基脲（TDZ），強(qiáng)弱依次為： TDZ Zt 2iP BAP KT 。其它類:赤霉素GA3、脫落酸ABA、多效唑PP333（4）培養(yǎng)材料的支持物為使培養(yǎng)材料在培養(yǎng)基上固定和生長，要外加一些支持物。瓊脂（agar）是使用最為普遍的凝固劑，本身并不提供營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從海藻中提取，僅溶于95左右的熱水，成為溶膠。通常的用量為0.5-1.0%。加的太多，則培養(yǎng)基過硬；用量太少，則培養(yǎng)基太軟，培養(yǎng)基酸度大或滅菌時間過長時，培養(yǎng)基也發(fā)軟。瓊脂的質(zhì)量和純度不僅對培養(yǎng)基的硬度有影響

39、，而且還會影響培養(yǎng)結(jié)果，固體培養(yǎng)基所需要設(shè)備簡單，使用方便，只須可供調(diào)控溫度及光照的培養(yǎng)室。但固體培養(yǎng)基只有部分材料表面與培養(yǎng)基接觸，不能充分利用培養(yǎng)容器中的養(yǎng)分，而且培養(yǎng)物生長過程中，排出的有害物質(zhì)的積累，而造成自我毒害，必須及時轉(zhuǎn)移。液體培養(yǎng)基需要轉(zhuǎn)床、搖床之類的設(shè)備，通過振蕩培養(yǎng)，給培養(yǎng)物提供良好的通氣條件，有利于外植體的生長，避免上述固體培養(yǎng)基的缺點(diǎn)。 （5） 培養(yǎng)基的pH值培養(yǎng)基的pH值因培養(yǎng)材料不同而異。大多數(shù)園藝植物都要求在的條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值的變化會影響到一些離子的溶解度，會使一些溶解度變小的鹽類沉淀，影響到植物對各元素的吸收比例，甚至?xí)霈F(xiàn)缺素癥。瓊脂培養(yǎng)基的

40、pH值還會影響培養(yǎng)基的凝固情況，一般培養(yǎng)基偏酸時（低于），培養(yǎng)基凝固較差，需要較多的瓊脂才能凝固，反之，培養(yǎng)基偏堿時（高于），凝固效果好。經(jīng)高壓滅菌后pH值會稍有下降,一般用1mol/L HCl調(diào)低.用1mol/L NaOH調(diào)高.（6） 其它成分在培養(yǎng)基中往往因培養(yǎng)目的不同、植物材料不同，而加入一些其它成分。目前較常見的有活性炭，另外還有抗生素物質(zhì)、抗氧化劑、誘變劑、生長抑制劑等。63 培養(yǎng)基母液的配制每種培養(yǎng)基往往需要十多種化合物，配制起來很不方便，也很難達(dá)到準(zhǔn)確和精確，特別是微量元素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)用量極少，很難準(zhǔn)確秤量，為了簡便起見，將配方中的藥品一次稱量供一段時間使用，即配成一些濃縮

41、液，用時稀釋，這種濃縮液就是濃縮貯備液（簡稱母液）。如果采用配制母液的方法，不僅可以解決上述問題，而且還可以減少工作量和便于母液的低溫貯藏。母液濃縮液是根據(jù)培養(yǎng)基配方加大若干倍（一般多為10200倍），一般按試劑種類和性質(zhì)將其分別秤量，分別溶解，分別配制，單獨(dú)保存或幾種混合保存。幾種試劑混合配制時要按一定順序?qū)⒏鞣N溶液混合成一定倍數(shù)的母液，母液濃度為實際應(yīng)用時濃度的10200倍，配制培養(yǎng)基時再按比例吸取即可。這樣配制一次母液，可多次使用，并在配制較多數(shù)量的培養(yǎng)基時，降低工作強(qiáng)度，提高工作效率，也提高試驗精度。常用的配制母液的方法是將大量元素分別稱量后，分別溶解后配成大量元素母液，微量元素按統(tǒng)一

42、的擴(kuò)大倍數(shù)分別稱量和溶解在一起配制成微量元素母液，鐵鹽、有機(jī)物均需單獨(dú)配制，在配制母液時應(yīng)注意防止產(chǎn)生沉淀。藥品應(yīng)采用純度等級較高的分析純AR（二級）或化學(xué)純（三級），以免帶入雜質(zhì)和有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料有不利影響。配制母液要用純度較高的蒸餾水或去離子水，藥品稱量、定容都要準(zhǔn)確。配好后，在容器上貼上標(biāo)簽，注明配制日期、母液倍數(shù)和名稱。應(yīng)置于24冰箱中保存，尤其是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與有機(jī)物更應(yīng)如此?；九囵B(yǎng)基的四種母液有：大量元素（濃縮20倍）；微量元素（濃縮200倍）；鐵鹽（濃縮200倍）；除蔗糖之外的有機(jī)物質(zhì)（濃縮200倍）。在制備這四種貯備液時，應(yīng)使每一種成分分別溶解，然后再把它們彼此混合。現(xiàn)以MS

43、培養(yǎng)基為例進(jìn)行母液的配制。 （1）大量元素母液在配制大量元素母液時一定要分別稱量，分別溶解，在定容時按表中的序號依次加入容量瓶中，以防出現(xiàn)沉淀。倒入貯液瓶中，貼好標(biāo)簽和標(biāo)好記錄后，可常溫保存或放入冰箱內(nèi)保存。 大量元素母液（配1升20倍的母液） 序號 成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg） 1 NH4NO3 1650 33000 2 KNO3 1900 38000 3 KH2PO4 170 3400 4 MgSO47H2O 370 7400 5 CaCl22H2O 440 8800配1升培養(yǎng)基吸取量50mL（2）微量元素母液在配制微量元素母液時也應(yīng)分別稱量和分別溶解，可用蒸餾水，也可用去離

44、子水，定容時不分先后次序，可隨意加入容量瓶中定容，一般不會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。倒入貯液瓶中，貼好標(biāo)簽和標(biāo)好記錄后，可常溫保存或放入冰箱內(nèi)保存。微量元素母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 稱取量 （mg） MnSO44H2O 22.3 4460 ZnSO47H2O 8.6 1720H3BO3 6.2 1240KI 0.83 166 Na2MoO42H2O 0.25 50 CoCl26H2O 0.025 5 CuSO45H2O 0.025 5 配1升培養(yǎng)基吸取量5(mL)（3）鐵鹽母液由于鐵鹽無機(jī)化合物不易被植物吸收利用，只有其螯合物才容易被植物吸收和利用，因此需要單獨(dú)配成螯合物母

45、液。目前常用的鐵鹽為硫酸亞鐵（FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物。此螯合物使用方便，又比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。配制方法為：稱取克硫酸亞鐵和克乙二胺四乙酸二鈉，分別用450mL的離子水（或蒸餾水）溶解，分別適當(dāng)加熱并不停攪拌，待分別溶解后，再將兩種溶液混合在一起，調(diào)整pH值到，最后加蒸餾水或去離子水定容于1000mL的容量瓶中，倒入棕色貯液瓶中，貼好標(biāo)簽和標(biāo)好記錄后放入冰箱內(nèi)保存。鐵鹽母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg） FeSO47H2O 27.8 5560 Na2-EDTA 37.3 7460 配1升培養(yǎng)基吸取量5(mL)（4）有機(jī)物母液按表

46、中用量分別稱取各種有機(jī)物，分別溶解后，用蒸餾水或去離子水定容于1000 mL的容量瓶中，放入細(xì)口瓶中備用，貼好標(biāo)簽和標(biāo)好記錄后置于冰箱中低溫保存。瓊脂、蔗糖等用量較大的有機(jī)物質(zhì)，不用配成母液，在配制培養(yǎng)基時按量直接稱取，隨取隨用。 有機(jī)物母液（配1升200倍的母液）成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg）肌醇 100.0 20 000 煙酸（VB5） 0.5 100 煙酸硫胺素（VB1） 0.1 20 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.5 100 甘氨酸 2.0 400 配1升培養(yǎng)基吸取量5 (mL)（5）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液絕大多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不溶于水，可以加熱并不斷攪拌促使溶解，必要時加入稀酸或稀堿

47、等物質(zhì)促溶。各類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的用量極微，通常使用的濃度單位是mg/L，一般也要配制成母液，母液配制成1mg/mL的濃度，即稱取100mg生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后用容量瓶定容至100mL。有些藥品配制母液時不溶于水，需要用稀酸、稀堿或酒精溶解。常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)物的溶解方法如下：（A） 生長素類 溶于95%的乙醇或的NaOH中，用去離子水或蒸餾水定容，貯于棕色液瓶中，貼好標(biāo)簽后放入冰箱內(nèi)低溫保存。NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸）、2,4-D（苯氧乙酸）般多用少量95%乙醇溶解，然后加熱的蒸餾水定容。（B） 細(xì)胞分裂素類 溶于或1mol/L的HCL或濃度小的NaOH中

48、，然后用去離子水或蒸餾水定容，貯于棕色液瓶中，貼好標(biāo)簽后放入冰箱內(nèi)低溫保存。KT（激動素）、BA（6-芐基嘌呤）可先用少量1N鹽酸溶解，然后加熱的蒸餾水定容。ZT（玉米素） 先用少量95%乙醇溶解，再用熱的蒸餾水定容。（C） 赤霉素類 赤霉素易溶于冷水，但溶于水后不穩(wěn)定，易分解，最好用95%的乙醇配成母液存于冰箱。用時用去離子水或蒸餾水稀釋到需要的濃度。（6）其他（A）三十烷醇 取溶于5mL二氯甲烷中，再加入10mL吐溫80，攪拌至溶解后加蒸餾水至100mL，繼續(xù)高速攪拌至乳白色，即成0.1%乳液，存于冰箱中備用。若儲存時間過長發(fā)生乳析現(xiàn)象，應(yīng)先猛烈震蕩再使用。（B）葉酸 葉酸需先用少量氨水溶

49、解，用去離子水或蒸餾水定容。貯備母液都應(yīng)貯存于適當(dāng)?shù)牟Ａ恐校謩e貼上標(biāo)簽，標(biāo)注母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配制一升培養(yǎng)基時應(yīng)取的量，母液最好放置于冰箱中低溫（24）保存，特別是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與有機(jī)物類物質(zhì)，貯存時間不要太長。在貯備椰子汁（液體胚乳）的時候，要先把從果實中采集到的汁液加熱煮沸，以除去其中的蛋白質(zhì)，過濾，然后置塑料瓶中貯存于-20的低溫冰箱內(nèi)。在使用這些貯備液之前必須輕輕搖動瓶子，如果發(fā)現(xiàn)沉淀懸浮物或微生物污染，必須重新配制。應(yīng)當(dāng)注意的是某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如生長素、玉米素、脫落酸、赤霉素等以及某些維生素遇熱不穩(wěn)定，不能和其他營養(yǎng)物質(zhì)一起高溫滅菌，而要進(jìn)行過濾滅菌。每次配制培養(yǎng)基時，吸取

50、母液量（mL）=所配培養(yǎng)基的毫升數(shù)/母液濃度倍數(shù)。如果配制1000mL培養(yǎng)基，并且母液濃度倍數(shù)為200倍，則吸取母液量（mL）=1000mL/200倍=5mL培養(yǎng)基無機(jī)營養(yǎng)研究規(guī)律：成分 配方(mg/L) 分子量 摩爾濃度NH4NO3 1650 80 20mmolKNO3 1900 101 19mmol KH2PO4 170 MgSO47H2CaCl22H2O 440 147 3mmolFeSO47H2O 27.8 278 0.1mmol Na2成分 配方(mg/L) 分子量 摩爾濃度MnSO44H2ZnSO47H2H3BO3 6.2 62 KI 0.83 166 0.005mM Na2MoO

51、42H2CoCl26H2CuSO45H264 培養(yǎng)基的配制（1）培養(yǎng)基配制步驟 配好各種母液后，就可以準(zhǔn)備配制培養(yǎng)基了。配制培養(yǎng)基時可按如下步驟進(jìn)行，如圖。 大量 微量 鐵鹽 有機(jī)物 生長調(diào)節(jié)劑 蔗糖 瓊脂 加水混合 調(diào)節(jié)pH值（用1N HCl或1N NaOH） 加熱溶解 玻璃器皿水洗、干燥 分裝 封口 高壓蒸汽滅菌 培養(yǎng)基冷卻凝固 培養(yǎng)基存放 準(zhǔn)備接種（C） 培養(yǎng)基的分裝 將調(diào)整好pH值的瓊脂培養(yǎng)基要趁熱分裝到培養(yǎng)容器中，瓊脂在大約40時凝固。一般每瓶約40mL左右，塞上棉塞或用封口膜等封瓶口材料封口，再用線繩或橡皮筋捆扎。及時做好標(biāo)記。七 外植體（1）外植體種類從理認(rèn)上講，植物細(xì)胞多具有全

52、能性，若條件適宜，都能再生成完整植株，任何組織或器官多能作為外植體。但實際上，植物種類不同，同一植物不同器官、同一器官不同生理狀態(tài)，對外界誘導(dǎo)反應(yīng)的能力及再生能力是不同的。A、植物基因型 草本比木本易于組織培養(yǎng)，雙子葉植物比單子葉植物易于培養(yǎng)。 B、外植體來源 從田間或溫室中生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作為外植體，離體培養(yǎng)易于成功。對于大多數(shù)植物來說，莖尖是較好的外植體，由于莖尖形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳穩(wěn)定，也是獲得無病毒苗的重要途徑。也可以用葉片、莖段、根等。 C、外植體大小 外植體大小應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定，如是胚胎或脫毒培養(yǎng)，易小。如進(jìn)行快繁易大。但過大不易滅菌

53、，過小難以成活。一般在為宜。葉片、花瓣5mm2，莖約，莖尖分生組織帶一兩個葉原基(2)植物材料的表面滅菌 A 外植體的滅菌方法植物生長在大自然中，而在大自然中無時無刻不存在各種微生物，處處都有雜菌滋生，因此，從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。采來用于培養(yǎng)的植物材料，不能直接進(jìn)行培養(yǎng)，必須經(jīng)過仔細(xì)的表面滅菌處理后，獲得無菌材料后才能進(jìn)行培養(yǎng)。把處理好的材料經(jīng)無菌操作手續(xù)放置到培養(yǎng)基上，即接種，接種的植物材料叫做外植體。實踐表明，外植體材料來源于不同環(huán)境條件下，其帶菌程度不同，滅菌難易程度和滅菌效果有明顯差別，采自田間的試材較溫室的材料難，新生嫩芽比老枝梢的芽容易，夏季生長旺

54、盛季節(jié)抽出的新芽滅菌效果好，污染率低。外植體取材自來水沖冼-70%酒精表面消毒（20-60S）-無菌水沖冼消毒劑處理無菌水充分沖冼-備用。第一步是刷洗、沖洗材料。采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分用適當(dāng)?shù)能浢?、毛筆等在流水下刷洗干凈，也可以用毛筆沾少量洗衣粉刷洗。然后把材料切割到適當(dāng)大小，根據(jù)清潔程度的差異，置于燒杯中，用流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，細(xì)小或易漂浮的材料可用紗布、塑料紗窗或銅絲網(wǎng)籠扎住。第二步是用洗衣粉或肥皂水浸洗并攪動，洗衣粉可按每100 mL水加12角匙的量配制，即濃度較高為好。大約浸攪15min，然后再用自來水沖凈洗衣粉，進(jìn)一步減少污染。此過程可視外植體具體情況而定，

55、較干凈的或容易處理的可以省略此步驟第三步是材料的表面滅菌，要在超凈臺或接種箱內(nèi)操作。將一干凈燒杯(大小視材料多少而定)或廣口瓶內(nèi)、外表面用70%或80%酒精棉球擦拭作表面滅菌，置于超凈臺(已開機(jī)10min以上)，再把處理好的植物材料置入，同時已準(zhǔn)備好了滅菌溶液、無菌水、待用培養(yǎng)基等。工作人員換上潔凈的工作服，戴上帽子。用肥皂洗手至肘部，用潔凈毛巾擦干，用70%酒精棉球擦手。在超凈工作臺前，附近應(yīng)放有座鐘或表，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到滅菌過的燒杯或廣口瓶中，看好時間，倒入滅菌溶液，加表面活性劑吐溫-80數(shù)滴，在持續(xù)滅菌的時間內(nèi)輕輕搖動廣口瓶，以促進(jìn)植物材料各部分與滅菌溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌

56、徹底。在快到預(yù)定時間之前12min，即開始把滅菌溶液倒入另一準(zhǔn)備好的大燒杯中，要注意勿使材料倒出。傾凈后立即倒入無菌水，輕輕搖動。表面滅菌的時間是從倒入滅菌溶液開始，到倒入無菌水時為止，加以記錄，為今后比較滅菌效果，積累經(jīng)驗。無菌水沖洗每次3min左右，視采用的滅菌溶液種類不同，一般沖洗310次。沖洗完畢后，這時的材料就可以接種了。另外，要選擇適當(dāng)?shù)臏缇鷦?。目前市場上供?yīng)的一些化學(xué)滅菌劑都具有表面滅菌的作用，而在試劑的選擇上與時間長短的處理上則應(yīng)根據(jù)材料對它的敏感性來決定。表4-3為常用表面滅均劑使用濃度及效果比較。 B 滅菌劑及其效果滅菌劑要求既要有良好的滅菌作用，又要不會損傷外植體材料，或

57、較少損傷材料，還要易被無菌水沖洗掉或能自行分解，不會遺留在培養(yǎng)材料上而影響生長。常用的滅菌劑有漂白粉（1%10%的濾液）、次氯酸鈉液（0.5%10%）、升汞（氯化汞，0.1%1%）、酒精（70%）、雙氧水（3%10%）。其中次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氯氣而揮發(fā)。過氧化氫液會分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氧氣而成無害的化合物。升汞有劇毒，對材料的表面滅菌效果好，只是滅菌后難易除去殘留的汞，為此滅菌后要多次沖洗，升汞的毒害作用不象漂白粉那樣可以很快表現(xiàn)出來，一般要經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后才會表現(xiàn)。漂白粉是一種有效的殺菌劑，但應(yīng)避光、干燥保存。70%酒精比其他濃度的酒精有更強(qiáng)的殺菌能力和穿透力，而且有濕潤作

58、用，可排除掉材料表面的空氣，利于其他滅菌劑的滲入，由于酒精穿透力強(qiáng)，故應(yīng)嚴(yán)格掌握好處理時間。為了使殺菌劑潤濕整個組織表面，還需在藥液中加入潤濕劑。常用的潤濕劑有吐溫（Tueen）80，或吐溫20，可加入數(shù)滴或用0.1%的濃度，對組織的濕潤有良好的效果。 常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較滅菌劑, 濃度（%）, 去除, 時間, 效果次氯酸鈣, 910, 易, 530, 很好次氯酸鈉, 2, 易, 530, 很好漂白粉, 飽和溶液, 易, 530, 很好溴水, 12, 易, 210, 很好過氧化氫, 1012, 最易, 515, 好氯化汞, 0.11, 較難, 215, 最好酒精, 7075, 易,

59、 0.22, 好抗生素, 450mg/L, 中, 3060, 較好硝酸銀, 1, 較難, 530, 好八、外植體接種與培養(yǎng)九、 繼代培養(yǎng)組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)物（細(xì)胞、愈傷組織、器官、試管苗等）培養(yǎng)一段時間后，為了防止培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)老化，或培養(yǎng)基成分利用完而造成的營養(yǎng)不良及過多代謝產(chǎn)物積累毒害等影響，要及時將其轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使培養(yǎng)物能順利的增殖分化及生長。繼代培養(yǎng)時間的長短因植物材料不同、培養(yǎng)方法與目的不同而不同。一般液體培養(yǎng)1周繼代一次，固體培養(yǎng)2-4周。十 植物組織 器官培養(yǎng)技術(shù)一、植物組織培養(yǎng)一般步驟闡述植物組織培養(yǎng)的基本過程：（1）準(zhǔn)備工作（2）培養(yǎng)基制備（3）外植體制備（4

60、）接種（5）培養(yǎng)（6）定期檢查（7）移栽、煉苗誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實驗材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。 最常用的生長素是IAA，NAA和2，4D，使用濃度范圍約在。最常用的細(xì)胞分裂素是KT和6-BA，使用濃度范圍在10mg/L。二、愈傷組織培養(yǎng)過程（1）愈傷組織的形成起動期：外值體（explant）中已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，通過脫 分化的起動期而進(jìn)入分裂，并開始形成愈傷組織。特征：外觀上雖然未見明顯變化，但實際上細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動態(tài)已發(fā)生明顯的改變。 脫分化起始期的實質(zhì)是在外源生長素的誘導(dǎo)下，首先激活了這些細(xì)胞中特定基因表達(dá)，為細(xì)胞分裂期的DNA