植物組織與細胞培養(yǎng)定義和過程

1、植物組織與細胞培養(yǎng)定義和過程一、 植物組織培養(yǎng)定義是指在無菌的條件下，將離體的植物器官、組織、細胞、胚胎、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷，長成新的完整植株的一種實驗術(shù)。1、探索階段（20世紀初至20世紀30年代）1902年，德國植物學家哈伯蘭德（Haberlanclt）就預言，植物細胞具有全能性，即高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個細胞的觀點，并設(shè)想離體植物活細胞具有能夠發(fā)育成為完整植株的潛在能力。 而且進行了相關(guān)實驗：培養(yǎng)植物葉片細胞。因此，被稱為 植物組織培養(yǎng)的father二 、發(fā)展歷史2、奠基階段（20世紀30年代中至50年代未）兩個重要

2、發(fā)現(xiàn)：1、認識了B族維生素對植物生長的重要意義； 2、發(fā)現(xiàn)了生長素是一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。1933年我國的李繼侗和沈同研究銀杏的胚培養(yǎng)，將銀杏胚乳提取物加入培養(yǎng)基，獲得成功。1934年Went 發(fā)現(xiàn)了生長素。隨后相繼發(fā)現(xiàn)了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。B簇維生素。1934年，美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，使根的培養(yǎng)首次獲得了真正的成功。（培養(yǎng)基：無機鹽、酵母提取物和蔗糖，后來用3種B族維生素：吡哆醇、硫胺素和煙酸取代酵母浸提物獲得成功）1934年Gautheret在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加了B族維生素和IAA后，形成層的生長明顯增加，揭示了B族

3、維生素和IAA在植物組織培養(yǎng)中的作用，直接導致了1939連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。1939年Nobecourt的胡蘿卜也建立了連續(xù)生長的培養(yǎng)物。 故三人被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1943年,white 正式提出了植物細胞具有全能性的學說.1948年，Skoog和催澄在煙草莖段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除生長素（IAA）對芽形成的抑制作用，而誘導形成芽，從而確定了腺嘌呤/生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1956年，Miller發(fā)現(xiàn)了激動素后，用它代腺嘌呤的效果更好。1958年，在美國工作的英國人Stewward，從胡蘿卜愈傷組織和細胞培養(yǎng)中，誘導

4、分化產(chǎn)生了個體植株，給“全能性”理論以科學論證。3、迅速發(fā)展階段（20世紀60年代至現(xiàn)在）1960年，Cocking用真菌纖維素酶在番茄幼根分離得到大量活性原生質(zhì)體，開創(chuàng)了植物原生質(zhì)體和體細胞雜交研究工作。Kanta在植物試管受精研究中首次獲得成功。1960年，Morel用蘭花莖尖培養(yǎng)實現(xiàn)了脫去病毒和快速繁殖方面已獲成功，導致歐洲、美洲和東南亞等許多國家蘭花工業(yè)的興起。（莖尖-原球莖-小植株）1962年Murashige和Skoog發(fā)表了促進煙草組織快速生長的培養(yǎng)基組成，這就是目前我們常用的MS培養(yǎng)基。1964-1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛葉曼佗羅花藥培養(yǎng)中由花粉

5、誘導得到了單倍體植株。1970年P(guān)ower首次成功實現(xiàn)原生質(zhì)體融合。1971年Takebe等首次由煙草原生質(zhì)體獲得再生植株，這一成功促進了體細胞雜交技術(shù)發(fā)展，同時也為外源基因?qū)胩峁┝死硐氲氖荏w材料。1972年，Carlson等通過原生質(zhì)體事例首次獲得了兩個煙草物種的體細胞雜交種。1978年Murashige提出了人工種子的概念。20世紀80年代初，隨著土壤農(nóng)桿菌成功的用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，植物基因工程開始成為研究的熱點。1983年Zambryski首次用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。 三、特點1.培養(yǎng)條件可人為控制2.生長周期短繁殖率高3.管理方便，利于自動化4.遺傳品質(zhì)一致5.培養(yǎng)材料經(jīng)

6、濟6.誤差小、重復性強四、意義和應(yīng)用（1）能夠有效保持優(yōu)良品種特性（2）獲得無病毒植株（3）快速繁殖新品種，加速優(yōu)良品種推廣（4）節(jié)約耕地，提高農(nóng)民產(chǎn)品產(chǎn)出率（5）在遺傳、生理生化和病理等研究上的應(yīng)用（6）便于運輸與種質(zhì)資源保存五 、 實驗室、設(shè)備要求和實驗室設(shè)計 植物組織培養(yǎng)是在無菌的條件下進行離體植物材料培養(yǎng)的技術(shù)。要達到無菌操作和無菌培養(yǎng)，首先是要有一定的無菌環(huán)境，使用無菌的容器和用具（經(jīng)過滅菌處理的）進行無菌操作，將無菌的植物材料接種在無菌的培養(yǎng)基上，然后把要培養(yǎng)的植物材料放在一定的溫度、濕度、光照、營養(yǎng)條件下，使其生長、發(fā)育和繁殖，這就必須要有一定的設(shè)備和條件。51 植物組織培養(yǎng)室的

7、基本結(jié)構(gòu) 選址： 在建造植物組織培養(yǎng)室時，應(yīng)選擇采光好、通風好、環(huán)境干凈的地點，以利于組織培養(yǎng)的順利進行和降低培養(yǎng)過程的污染率。 實驗室：植物組織培養(yǎng)工作的開展除需要培養(yǎng)室外，還應(yīng)該有與之配套的洗滌室、藥品室、稱量室、培養(yǎng)基配制室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室、細胞學實驗室、暗室和物品存放室等。 （1）洗滌室洗滌培養(yǎng)容器、小用具等，要求有工作臺面、上水和下水，水池、培養(yǎng)容器擺放支架、電源、電熱干燥箱等。洗滌室墻壁要有耐濕、防潮功能。新購進的玻璃器皿首先要用1%左右濃度的稀鹽酸將可溶性無機物除去，再用中性洗滌劑洗滌，一般器皿的洗滌可用洗衣粉洗滌，或用洗衣粉加熱洗滌，用自來水沖洗干凈。對較難洗滌的培養(yǎng)容

8、器，如吸管等可在重鉻酸鉀洗液中浸泡后再洗，洗到玻璃表面上不沾水滴才算合乎要求。（2）藥品貯藏室 要求干燥、通風，避免光照，有存放各種藥品試劑的藥品柜、冰箱等設(shè)備，化學試劑、玻璃器皿等物品分類存放于柜中，有毒物品（HgCl2）需要專人密封保存，需低溫保存的藥品和藥液放置于冰箱中貯藏，藥品貯藏室緊鄰化學稱量室較好，便于工作。（3）稱量室（天平室） 要求干燥、密閉，無直射光照，避免腐蝕性藥品和水氣直接接觸。有固定的水磨石平臺，安放普通天平和萬分之一分析天平（電子天平），要有電源插座，最好設(shè)計在陰面的房間，這樣對怕光藥品的保存和稱量有利，稱量室緊鄰培養(yǎng)基配制室較好，以方便配制母液和培養(yǎng)基。如房間較少時

9、，可以與藥品儲藏室合二為一。（4）培養(yǎng)基配制室主要進行培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌前的暫時存放。配制的培養(yǎng)基需要實驗臺，上下水，電源，加熱設(shè)備等。配制培養(yǎng)基室要求備有各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、吸管等玻璃器皿，有安放藥品和器皿的各種櫥架、水浴鍋、過濾滅菌裝置和酸度計等。規(guī)模較小時， 可與洗滌室合并在一起。（5）培養(yǎng)基滅菌室器皿和培養(yǎng)基的消毒滅菌，最好在一個專用的滅菌室內(nèi)進行。由于采用高溫高壓蒸汽滅菌方法，滅菌室最好有排除蒸汽的排風扇等。建筑上要求其墻壁耐濕、耐高溫。有用于干熱滅菌的烘箱、濕熱滅菌的高壓蒸汽滅菌鍋、蒸餾水器、水源、水池，供、排水設(shè)施。有用于滅菌的兩相和三相電源或煤氣加熱裝置，擺放和

10、存放器皿和培養(yǎng)基的架子和櫥柜。規(guī)模小時，可與洗滌室和配培養(yǎng)基室合并。（6）培養(yǎng)基存放室滅菌的培養(yǎng)基最好存放一段時間后進行接種工作，以防污染和損失苗木。規(guī)模小時，可與洗滌室、配培養(yǎng)基室和滅菌室合并。（7）過度室（緩沖室）為避免進出時帶進雜菌，無菌室外應(yīng)該設(shè)置預備室，作為緩沖間。預備室和無菌室之間最好用玻璃墻隔離，便于觀察和參觀。在預備室中可放置工作服、鞋、帽等，也需要安裝自來水、水池和紫外燈，用于接種前的洗手和紫外滅菌，電源開關(guān)最好安裝在預備室外邊，以免在開關(guān)燈時紫外線對眼睛和皮膚造成傷害。（8）接種室無菌室的好壞對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。無菌操作室主要進行繁殖材料的表面滅菌和試管苗的繼代培

11、養(yǎng)和材料轉(zhuǎn)接，要求室內(nèi)干凈、密閉，光線好。一般安裝滑動門，以免造成空氣流動，引起污染。室內(nèi)墻壁光滑平整，地面平坦無縫，便于清潔工作。應(yīng)該安裝紫外燈，以便照射滅菌，還要有照明裝置及插座,以備臨時增加設(shè)備之用。室內(nèi)有超凈工作臺、接種用的小推車以及試管、三角瓶、塘瓷盤、酒精燈、接種工具等。平房易吸潮，容易引起污染，因此有條件的設(shè)計應(yīng)選擇樓房，最好在二層或二層以上，與其他區(qū)域隔離。為保證無菌室的良好條件，可預先用福爾馬林熏蒸，工作臺用70%酒精藥棉擦拭，在開紫外燈滅菌前應(yīng)該把所有需要的物品放入。不要造成死角，以免紫外燈無法照射到。此外還應(yīng)該設(shè)有消防設(shè)施。21 （9）培養(yǎng)室培養(yǎng)室是培養(yǎng)材料進行培養(yǎng)和生長

12、的場所，培養(yǎng)室的大小應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)架的數(shù)量和生產(chǎn)規(guī)模而定。植物組織培養(yǎng)需要較長的培養(yǎng)時間，同時還須考慮溫度和光照的影響。通常培養(yǎng)室的溫度保持在適宜一般植物生長的范圍內(nèi)，多為2027 ，光照強度在1000 lx以上。一般光照強度1000-5000 Lx，每天光照時間816 h。 培養(yǎng)室應(yīng)設(shè)計成多個小培養(yǎng)間比一個大房間效果好，因為小的培養(yǎng)間容易控制溫度、光照等環(huán)境指標，特別是培養(yǎng)材料較少時節(jié)能效果更為明顯。培養(yǎng)多種植物時的優(yōu)點更為突出，如不同植物所需的培養(yǎng)溫度、光周期不同，所設(shè)定的培養(yǎng)溫度和光周期不可能適合培養(yǎng)的每一種植物。小培養(yǎng)間也可以減少污染，培養(yǎng)室容易消毒和保持清潔。至少設(shè)計成一大一小兩間培養(yǎng)室

13、，這樣可以防止萬一環(huán)境污染，不至于全軍覆沒；也可以用大的培養(yǎng)間大量繁殖苗木，小的用來科研及少量珍稀品種試驗；當不同培養(yǎng)材料需要不同的培養(yǎng)條件時，便于分別處理。（10）細胞學實驗室 為觀察、記錄培養(yǎng)材料的生長情況及實驗結(jié)果，需要有細胞學實驗室。細胞學實驗室應(yīng)有固定的水磨石臺面，放置顯微鏡、解剖鏡等儀器。室內(nèi)應(yīng)安靜、干凈、清潔、明亮，保證光學儀器不振動、不受潮、不污染。室內(nèi)還應(yīng)該有一套染色設(shè)備，因為有時為了觀察清楚需要染色或進行制片觀察。（11）暗室 試驗材料的攝影記錄，一般可以用裝有照相裝置的顯微鏡、解剖鏡進行，有時需要用照相機直接拍攝完整材料。進行拍攝后需要沖卷和洗相，這就必須有配套的暗室，以

14、便及時看到結(jié)果。在暗室應(yīng)有沖洗、印相、放大、上光等設(shè)備。有固定的水泥工作臺面，還要有電源和自來水裝置。（12）物品存放室暫時不用的器皿、用具等貯存在物品存放室內(nèi)。物品存放室應(yīng)當設(shè)計在背陽、通風的房間，室溫較低，一般用樓房的低層的陰面房間較好，便于搬運。（13）溫室（大棚） 試管苗移栽必須在溫室或塑料大棚內(nèi)進行。試管苗移栽時一般要求溫室最低溫度在15 以上，相對空氣濕度在70%以上。52組織培養(yǎng)常用儀器設(shè)備及要求（1）玻璃器皿植物組織培養(yǎng)工作對玻璃器皿的需要是靈活多樣的，多種器皿都可使用。玻璃器皿最好用硼硅酸鹽（即派熱克斯玻璃）材料制造，一般要求溶解度小，其形狀可根據(jù)研究工作的目的和要求而定。（

15、A） 培養(yǎng)容器培養(yǎng)用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高壓蒸汽滅菌。根據(jù)培養(yǎng)目的和要求不同，可采用不同種類和規(guī)格的玻璃器皿。試管 在需要少量培養(yǎng)基進行研究、接種外植體或進行幼胚培養(yǎng)（如桃幼胚等）的實驗中，可以選用試管進行培養(yǎng)。要求試管口徑要大、長度稍短，便于操作，以2.0cm15cm、2.5cm15cm、3.0cm15cm為宜。三角瓶 又叫三角燒瓶和錐形瓶，具有瓶口小，瓶底大，培養(yǎng)面積大，受光好，易放置，培養(yǎng)效果好，在植物組織培養(yǎng)中最常用。接種外植體時多用容積為50mL的三角瓶，一般實驗用100mL的三角瓶，生產(chǎn)育苗多用150mL的三角瓶。近年來，三角瓶在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用愈來愈廣泛，無論是固體培養(yǎng)還

16、是液體培養(yǎng)，都可用三角瓶。一般用口徑2.5cm3cm的大口徑三角瓶較好。果醬瓶或罐頭瓶 成本低，瓶口大，操作方便，透光好，培養(yǎng)材料生長健壯，但培養(yǎng)污染率較高。生產(chǎn)中應(yīng)用較多的是200mL的果醬瓶，也有用較大的罐頭瓶。培養(yǎng)皿 在無菌材料分離、濾紙滅菌、種子發(fā)芽、病毒鑒定時較常用，其規(guī)格有直徑6cm、9cm、12cm的。固體平板培養(yǎng)一般采用直徑6cm的小型培養(yǎng)皿。此外，可以用培養(yǎng)皿室內(nèi)催芽，以供培養(yǎng)時取材之用。在無菌室還可以在培養(yǎng)皿中解剖莖尖、分離花粉、切割繼代培養(yǎng)物及其他外植體或培養(yǎng)材料。植物組織培養(yǎng)專用容器 這是一種新型組培專用容器，采用進口高分子PC（俗稱太空玻璃）為主要材料生產(chǎn)，在高壓蒸汽

17、滅菌條件下反復使用不破裂、不變形，使用壽命長，透光率高于玻璃容器。最大的優(yōu)點是不易破碎，符合機械化洗瓶要求，利于降低損耗和工廠化生產(chǎn)。瓶口包扎，以達到防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染的目的?？捎枚喾N方法，通常以紗布包被棉花塞，外邊再包一層牛皮紙，用線繩或橡皮筋捆扎，也可用封口膜、鋁箔、雙層硫酸紙、耐高溫的塑料紙、耐高溫的塑料蓋。（B） 盛裝器皿盛裝容器主要是存放各種試劑和藥液。磨口瓶 包括無色和棕色兩類，細分為廣口瓶、細口瓶，規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL，廣口瓶用于存放試劑，細口瓶用來分裝配制好的各種母液。不易保存的母液存于冰箱中低溫保存，見光易分解的藥品可用棕色瓶安全保存。

18、 滴瓶 盛裝一定濃度的酸液或堿液，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。其中堿液用塑料滴瓶更好。搪瓷鍋（盆）或不銹鋼鍋（盆） 用于配制和熬制培養(yǎng)基，研究可用較小的規(guī)格，如1000mL規(guī)格的搪瓷缸，或4000mL規(guī)格的搪瓷鍋，生產(chǎn)上要選較大的規(guī)格，如8000mL或更大規(guī)格的不銹鋼鍋較好，可提高勞動效率。燒杯 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各種母液和培養(yǎng)基。（C） 計量器皿計量器皿要求有準確的刻度，以便于在配制各種母液及培養(yǎng)基時能準確定量，減少實驗誤差。容量瓶 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各種母液時定容?？潭任?又叫移液

19、管，規(guī)格有10mL、5mL、1mL、。用于吸取各種母液。量筒 規(guī)格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、25mL 、10mL、5mL，用于配制不同濃度的酒精和配制培養(yǎng)基時吸取大量元素母液等。（D）其他 除以上各種容器外，還應(yīng)具備一些其他玻璃器皿，如漏斗、稱量瓶、玻璃棒等，以便用于培養(yǎng)基的制備等工作。有條件時，還可以配備培養(yǎng)基分裝器，由大型滴管、漏斗、橡皮管及鐵夾等構(gòu)成。此外，還有量筒式分裝器，上有刻度，下有橡皮管及鐵夾控制。微量分裝可用注射器。（2）儀器與設(shè)備天平 可以根據(jù)實際需要配備選擇如下稱量儀器。天平應(yīng)放在干燥，避免震動，無腐蝕性藥品的地方，應(yīng)盡量避免移動，天平匣

20、內(nèi)應(yīng)放硅膠或其他中性干燥劑以保持干燥。（A） 藥物天平稱量精度為，用來稱取蔗糖和瓊脂等。（B） 扭力天平 既移動方便，又較為靈敏的稱量儀器，可彌補藥物天平和分析天平各自的不足，精度為，而且在1g 內(nèi)的物品不用加砝碼，故使用方便。（C） 分析天平 精度為，用來稱取微量元素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及微量附加物。選擇平穩(wěn)，干燥，沒有腐蝕性藥品和水氣的地方放置天平。（D） 電子天平 精度高、稱量快、但價格較高。冰箱 分普通冰箱和低溫冰箱。某些試劑、藥品和母液需低溫保存；有些材料需低溫處理。一般備有家庭用冰箱即可。烘箱和恒溫箱 洗凈后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱內(nèi)烘干，溫度以80100為宜。若需要干熱

21、滅菌，溫度升高至150180，持續(xù)13h即可。在進行培養(yǎng)物的干重分析時，可在80條件下烘干。恒溫箱即可用于植物原生質(zhì)體和酶制劑的保溫，也可用于組織培養(yǎng)中暗培養(yǎng)。恒溫箱內(nèi)裝上日光燈可進行溫度及光照方面的小型實驗。顯微鏡 一般用雙目體視顯微鏡較多，用于剝?nèi)∏o尖以及隔瓶觀察內(nèi)部植物組織生長情況。同時也還要有生物顯微鏡，用以觀察花粉發(fā)育時期及培養(yǎng)過程中細胞核的變化等。此外，倒置顯微鏡可以從培養(yǎng)器皿的底部觀察培養(yǎng)物，因此，在液體培養(yǎng)時，可用倒置顯微鏡進行觀察。酸度計（pH試紙也可） 培養(yǎng)基中的pH值十分重要，因此，在配制培養(yǎng)基時，需要用酸度計測定和調(diào)整。一般用小型酸度測定儀，既可在配制培養(yǎng)基時使用，也可

22、測定培養(yǎng)過程中pH值的變化。若不做研究，僅用于生產(chǎn)，也可用精密pH47的試紙來代替。測定培養(yǎng)基pH值時，應(yīng)注意攪拌均勻后再測。蒸餾水器 水中常含有無機和有機雜質(zhì)，如不除去，勢必影響培養(yǎng)效果。植物組織培養(yǎng)中常使用蒸餾水或去離子水，蒸餾水可用金屬蒸餾水器大批制備，要求更高的用硬質(zhì)玻璃蒸餾水器制備。去離子水是用離子交換器制備的，成本低，但不能除去水中有機成分。一般生產(chǎn)性的組培育苗，對水要求不太高，除配制各種母液用蒸餾水或去離子水外，配制培養(yǎng)基所用水可以用自來水代替，如果當?shù)厮|(zhì)較硬，可以用煮沸過并沉淀去雜質(zhì)后的白開水，以降低生產(chǎn)成本。空調(diào)器（空氣調(diào)節(jié)器） 夏季高溫不利于試管苗生長繁殖，常常造成組培苗

23、生長不良，或引起玻璃化等不良反應(yīng)，需要購置空調(diào)器降溫，空調(diào)器功率應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)室大小來定。超凈工作臺 如有條件購置先進設(shè)備超凈工作臺，既方便，又舒適，無菌效果又好，它可代替無菌室和接種箱。超凈工作臺原系工業(yè)用于半導體元件與精密儀器儀表的裝置，現(xiàn)已成為植物組織培養(yǎng)上最常用、最普及的無菌操作裝置。它有單人、雙人、及三人式的，也有開放和密封式的。超凈工作臺一般較寬，購置和設(shè)計房屋時應(yīng)注意，以防房門太窄而搬不進去。超凈工作臺主要是通過風機，將送入的空氣經(jīng)過細菌過濾裝置，再流過工作臺面。因此超凈工作臺應(yīng)放置在空氣干凈、地面無灰塵的地方，以延長使用期。使用過久，引起堵塞，需要清洗和更換過濾器。培養(yǎng)架 進行固體

24、培養(yǎng)和試管苗大量繁殖時，需要有放置培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)架。制作培養(yǎng)架時應(yīng)考慮使用方便、節(jié)能、充分利用空間以及安全可靠。架子可用金屬、木材制作，隔板可用玻璃、木板、纖維板、金屬板等，最好用平板玻璃或鐵絲網(wǎng)，既透光，上層培養(yǎng)物又不受熱。這里介紹一種效果好、容量大、使用較安全、較適用的培養(yǎng)架，立柱用直徑30 mm左右的鋼管，橫架用25 mm角鋼焊制而成，燈座裝于每層兩側(cè)的橫架上，其上有槽，用于固定燈座。每層裝40 W日光燈23個，鎮(zhèn)流器最好裝于室外以利于散熱。也可在兩端橫架下方68 cm另裝一橫檔，其上裝燈座和啟動器。還有一種叫為萬能角鐵的配件，其長度為3 m，可切割成不同長度的配件，用于組裝培養(yǎng)架。此種培

25、養(yǎng)架可以任意組裝，并且造價較低。1根萬能角鐵原料售價一般在20元人民幣，1個培養(yǎng)架用10 根，加上螺絲等小型配件，1個培養(yǎng)架造價在300元以內(nèi)，較由其他的原料制成的培養(yǎng)架成本低。木制和鋁制造價和鐵制的造價均在500元以上，并且顯得笨重，特別是木制的容易發(fā)生火災。滅菌裝置 高壓蒸汽滅菌鍋是最基本的設(shè)備，用于培養(yǎng)基、器械等的滅菌。有大型臥式、中型立式和小型手提式等多種，可按生產(chǎn)規(guī)模來選用，大型效率高、小型方便靈活。小型手提式有內(nèi)熱式和外熱式兩種，內(nèi)熱式加熱管在鍋內(nèi)，省時省電，但不能用火爐加熱；外熱式可用電爐、煤爐、煤氣等加熱。手提式內(nèi)熱小型高壓滅菌鍋配一個3 kw調(diào)壓變壓器和定時鐘，可實現(xiàn)半自動滅

26、菌，并省電40%。此外，應(yīng)有紫外線燈、水浴鍋、室內(nèi)小推車、振蕩培養(yǎng)機和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機及其他培養(yǎng)裝置。（3）用具和器械 組織培養(yǎng)所需要的用具和器械，可選用醫(yī)療器械和微生物實驗所用的器具。常用的用具和設(shè)備如下。鑷子 小型尖頭鑷子，適用于攝取植物組織和分離莖尖、葉片表皮等。長1625cm的槍形鑷子，腰部彎曲，使用方便，可用于接種和轉(zhuǎn)移植物材料。剪刀 常用的有解剖剪和彎頭手術(shù)剪，一般用于試管內(nèi)剪取莖段，進行繼代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)接。在剪取外植體時，特別是木質(zhì)化程度較高的枝條常用剪枝剪（修枝剪），在果樹組織培養(yǎng)中，枝條修整時也需要修枝剪。解剖刀和芽接刀 常用的解剖刀，有長柄和短柄兩種。刀頭也有雙面和單面之分，可以經(jīng)常

27、更換。對大型材料如塊莖、塊根等需用大型解剖刀。果樹的枝芽常需要芽接刀。接種工具 包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成，用來接種花藥或轉(zhuǎn)移植物組織。鉆孔器 取肉質(zhì)莖、塊莖、肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時使用。鉆孔器一般做成T形，口徑有各種規(guī)格。細菌過濾器 溶液中有些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以及有機附加物質(zhì)，如吲哚乙酸等，在高溫條件下易被分解破壞，可用細菌過濾器來除菌?？刹捎媒饘僦频牟淌下┒?，以石棉微孔濾膜（孔徑為m）除去細菌。在過濾較少量的液體時，宜用醋酸纖維素或硝酸纖維素物質(zhì)制成的微孔濾膜，其孔徑為m。這種濾膜在氧氣存在下，能經(jīng)受125高溫滅菌。在過濾滅菌時需要一套加壓（注射器）或減壓吸濾設(shè)備，漏斗下接吸濾

28、瓶，吸嘴處接上一只內(nèi)裝脫脂棉的濾氣玻璃管。 注射器 普通的皮下注射器頭上安裝濾板夾，其上有m濾板，構(gòu)成一個微孔濾板微量注射器。可用來過濾滅菌，也可以用于微量懸滴培養(yǎng)中的營養(yǎng)液的分裝。其他 灼燒工具用的酒精燈、用于溶解培養(yǎng)基的帶有磁攪拌器的電爐、用于加速溶解大量瓊脂培養(yǎng)基的微波爐、用于貯備無離子水和重蒸餾水的大型塑料桶、試管架以及轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶、試管架的搪瓷盤或小鐵籃等。另外，可以根據(jù)培養(yǎng)效果的好壞和成本的高低選用適當?shù)钠咳屯庹?。一般試管和燒瓶可用未?jīng)脫脂的棉花塞（有時包上紗布或粗布），亦可用泡沫塞子或鋁箔塞。鋁箔也用以包裹棉塞和泡沫塞，也可以用能經(jīng)受高壓滅菌的塑料蓋。近年來，有一種透明的、可進行

29、高壓消毒的封口薄膜，既防止污染，又可使空氣透過，并有良好的透光作用。預先滅菌的或經(jīng)過高溫滅菌的培養(yǎng)器皿也可用帕拉膠片（parafilm）密封，該膠片是一種蠟制的、不能進行高溫滅菌、可伸展的黏性薄片或膠帶。也有只用兩三張羊皮紙或其他紙來包扎瓶口。六 培養(yǎng)基的配制、滅菌及操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)成功與否，一方面取決于培養(yǎng)材料本身的性質(zhì),另一方面取決于培養(yǎng)基的種類和成分，所以組織培養(yǎng)的發(fā)展與培養(yǎng)基的改進是分不開的。不同的植物材料對培養(yǎng)基的要求不同，因而必須根據(jù)不同的植物材料以及不同的培養(yǎng)目的選擇合適的培養(yǎng)基，并按照不同的培養(yǎng)階段加入適當?shù)奶砑游铩Ｗ鳛橹饕荚吹恼崽恰⒅挝锃傊臐舛燃芭囵B(yǎng)基的pH值都會影

30、響外植體和培養(yǎng)材料的生長和發(fā)育。培養(yǎng)基通常有兩個水平（或兩個組成部分）一、是基本培養(yǎng)基，包括大量元素和微量元素（無機鹽類），維生素和氨基酸，還有糖和水等。迄今為止，基本培養(yǎng)基已有幾百種，但較常用的僅一二十種，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等基本培養(yǎng)基。二、是完全培養(yǎng)基，即在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)各種不同試驗要求，附加一些物質(zhì)，如添加各種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（BA、ZT、KT、2IP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等）以及其他的復雜有機附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽膏等。61 培養(yǎng)基的營養(yǎng)及成分（2）無機鹽無

31、機鹽是植物生長發(fā)育所必需的化學元素。在植物組織培養(yǎng)時，各種營養(yǎng)物質(zhì)主要從培養(yǎng)基中獲得，如氧、氫元素從水中得到，礦質(zhì)元素要靠加入適宜的無機鹽類物質(zhì)提供。培養(yǎng)基中除了氧、氫、碳有機物外，剩下的為礦質(zhì)元素，包括N、P、K、S、Ca、Mg等大量元素和Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等微量元素。 （1）水大量元素 大量元素常占植物體干重的百分之幾至萬分之幾氮是最重要的。一般用硝態(tài)氮或氨態(tài)氮。即無機氮在培養(yǎng)基中有兩種供應(yīng)形式，一種是硝酸鹽；另一種是氨鹽。當作為唯一的氮源時，硝酸鹽的作用要比氨鹽好得多，但在單獨使用硝酸鹽時，培養(yǎng)基的pH值會向堿性方向漂移。若在硝酸鹽中加入少量氨鹽，則會阻止這種漂移。因此，培

32、養(yǎng)基既含有硝酸鹽又含有氨鹽為好。磷對植物的生命活動具有十分重要的作用，缺磷時蛋白質(zhì)合成降低。鉀、鈣、鎂、硫等元素能影響植物組織中酶的活性，決定著新陳代謝的過程。微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Co多種微量元素，用量10-510-7mol/L，植物對這些元素的需要量甚微，稍多即會發(fā)生外植體變性、酶失活、代謝障礙等毒害。微量元素對植物組織的生命活動都有重要作用。如硼促進生殖器官的發(fā)育,影響蛋白質(zhì)的合成和授粉受精；銅有促進離體根生長的作用；錳與呼吸作用和光合作用有關(guān)。鋅是各種酶的構(gòu)成要素，增強光合作用效率，參與生長素代謝。Fe鹽 對葉綠素的合成與延長生長起重要作用。鐵元素不易被植

33、物直接利用和吸收，通常以硫酸亞鐵和Na2-EDTA(螯合劑)配制成螯合物用于培養(yǎng)基中。早期配方中曾采用過硫酸鐵Fe2(SO4)3，后又用氯化鐵（FeCl2）代替硫酸鐵，但它們都不是理想的鐵供應(yīng)源。在根培養(yǎng)時，接種后一周，采用氯化鐵的培養(yǎng)基的pH值就由偏移到，根開始表現(xiàn)出缺鐵癥。與根不同，愈傷組織由于能分泌與鐵離子相結(jié)合的天然螯合物，可以在一定程度上利用鐵鹽。（3）有機化合物 主要包括碳源（也是能源）、維生素類、氨基酸及其他有機附加物。碳源 植物組織在離體之后，由于沒有葉綠體或只有發(fā)育不好的葉綠體，基本上不能制造需要的碳水化合物，難以依靠自養(yǎng)作用維持其生存，必須在培養(yǎng)基中另外加入碳水化合物，它所

34、需要的碳素是以各種糖的形式提供于培養(yǎng)基中。糖除了在培養(yǎng)基提供培養(yǎng)物所需的碳骨架和能源外，還可在一定程度上調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最為重要。一般來說，蔗糖是最好的糖源，它具有熱易變（heat-liable）的性質(zhì)，經(jīng)高壓滅菌后，大部分分解為D-葡萄糖、D-果糖，只剩下部分的蔗糖，這更有利于吸收和利用。此外也可以直接利用果糖、葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖等。也有利用多糖類的可溶性淀粉和糊精以及果膠的報道。 常用的糖濃度為15%。糖的濃度不只是對細胞增殖有作用，同時也是影響細胞分化的因素之一。 維生素類 主要以各種輔酶的形式多項代謝活動，對生長分化有一定的作

35、用。完整植株是能夠制造維生素的，但是離體組織卻不能合成足夠的維生素。常用的維生素濃度約之間。其中鹽酸硫胺素（維生素B1）是絕對需要的（全面促進植物生長），一般加煙酸（維生素B3）、鹽酸吡哆醇（維生素B6）對根的生長好處。維生素熱易變性，易在高溫下降解，可進行過濾滅菌，添加肌醇能改善培養(yǎng)植物的生長狀況，在培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L的肌醇就足以影響維生素B1的效應(yīng)。加泛酸鈣（維生素B5）、生物素（維生素H）以及抗壞血酸（維生素C），但它們并不是普遍的限制因子。氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機氮源，除構(gòu)成生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶等）的基本組成外，還具有緩沖作用和調(diào)節(jié)培養(yǎng)物體內(nèi)平衡的功能，對外

36、植體的芽、根、胚狀體的生長、分化有良好的促進作用。常用的氨基酸有甘氨酸、酰胺類物質(zhì)（如谷酰胺、天門冬酰胺）和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。此外還有谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。 天然復合物 天然復合物的成分比較復雜，大多數(shù)含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。由于其對一些難培養(yǎng)的培養(yǎng)材料有特殊作用，所以在一些試驗中還常常應(yīng)用它。常用的天然復合物有椰乳（CM，100-200mL/L）、玉米胚乳、香蕉汁（150-200mL/L）、馬鈴薯汁（100-200mL/L）、 、水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白（LH）、酵母提取液（YE，0.5%）、麥芽浸出物（ME）、蘋果汁

37、等。由于它們是天然有機物，其成分往往不一，這些差異將會影響實驗的重復性。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，雖然用量少，但對外植體愈傷組織誘導和根芽等器官分化，起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用。影響最顯著的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是生長素類和細胞分裂素類物質(zhì)。生長素類：促進細胞的伸長生長和細胞分裂，被用于誘導愈傷形成，促進生根。生長素類中的吲哚乙酸（IAA）由于比較容易被氧化而很少使用，常用的是二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚-3-丁酸（IBA）。誘導愈傷組織用2,4-D、NAA，用量：細胞分裂素類:可促進植物細胞的分裂和不定芽形成，打破頂端優(yōu)勢形成叢生芽，有利于芽的增殖，常

38、用于繼代和增殖培養(yǎng)。激動素(KT)、異戊烯基腺嘌呤（2iP）、6-芐基腺嘌呤（BAP）、玉米素（Zt）、噻重氮苯基脲（TDZ），強弱依次為： TDZ Zt 2iP BAP KT 。其它類:赤霉素GA3、脫落酸ABA、多效唑PP333（4）培養(yǎng)材料的支持物為使培養(yǎng)材料在培養(yǎng)基上固定和生長，要外加一些支持物。瓊脂（agar）是使用最為普遍的凝固劑，本身并不提供營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從海藻中提取，僅溶于95左右的熱水，成為溶膠。通常的用量為0.5-1.0%。加的太多，則培養(yǎng)基過硬；用量太少，則培養(yǎng)基太軟，培養(yǎng)基酸度大或滅菌時間過長時，培養(yǎng)基也發(fā)軟。瓊脂的質(zhì)量和純度不僅對培養(yǎng)基的硬度有影響

39、，而且還會影響培養(yǎng)結(jié)果，固體培養(yǎng)基所需要設(shè)備簡單，使用方便，只須可供調(diào)控溫度及光照的培養(yǎng)室。但固體培養(yǎng)基只有部分材料表面與培養(yǎng)基接觸，不能充分利用培養(yǎng)容器中的養(yǎng)分，而且培養(yǎng)物生長過程中，排出的有害物質(zhì)的積累，而造成自我毒害，必須及時轉(zhuǎn)移。液體培養(yǎng)基需要轉(zhuǎn)床、搖床之類的設(shè)備，通過振蕩培養(yǎng)，給培養(yǎng)物提供良好的通氣條件，有利于外植體的生長，避免上述固體培養(yǎng)基的缺點。 （5） 培養(yǎng)基的pH值培養(yǎng)基的pH值因培養(yǎng)材料不同而異。大多數(shù)園藝植物都要求在的條件下進行組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值的變化會影響到一些離子的溶解度，會使一些溶解度變小的鹽類沉淀，影響到植物對各元素的吸收比例，甚至會出現(xiàn)缺素癥。瓊脂培養(yǎng)基的

40、pH值還會影響培養(yǎng)基的凝固情況，一般培養(yǎng)基偏酸時（低于），培養(yǎng)基凝固較差，需要較多的瓊脂才能凝固，反之，培養(yǎng)基偏堿時（高于），凝固效果好。經(jīng)高壓滅菌后pH值會稍有下降,一般用1mol/L HCl調(diào)低.用1mol/L NaOH調(diào)高.（6） 其它成分在培養(yǎng)基中往往因培養(yǎng)目的不同、植物材料不同，而加入一些其它成分。目前較常見的有活性炭，另外還有抗生素物質(zhì)、抗氧化劑、誘變劑、生長抑制劑等。63 培養(yǎng)基母液的配制每種培養(yǎng)基往往需要十多種化合物，配制起來很不方便，也很難達到準確和精確，特別是微量元素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)用量極少，很難準確秤量，為了簡便起見，將配方中的藥品一次稱量供一段時間使用，即配成一些濃縮

41、液，用時稀釋，這種濃縮液就是濃縮貯備液（簡稱母液）。如果采用配制母液的方法，不僅可以解決上述問題，而且還可以減少工作量和便于母液的低溫貯藏。母液濃縮液是根據(jù)培養(yǎng)基配方加大若干倍（一般多為10200倍），一般按試劑種類和性質(zhì)將其分別秤量，分別溶解，分別配制，單獨保存或幾種混合保存。幾種試劑混合配制時要按一定順序?qū)⒏鞣N溶液混合成一定倍數(shù)的母液，母液濃度為實際應(yīng)用時濃度的10200倍，配制培養(yǎng)基時再按比例吸取即可。這樣配制一次母液，可多次使用，并在配制較多數(shù)量的培養(yǎng)基時，降低工作強度，提高工作效率，也提高試驗精度。常用的配制母液的方法是將大量元素分別稱量后，分別溶解后配成大量元素母液，微量元素按統(tǒng)一

42、的擴大倍數(shù)分別稱量和溶解在一起配制成微量元素母液，鐵鹽、有機物均需單獨配制，在配制母液時應(yīng)注意防止產(chǎn)生沉淀。藥品應(yīng)采用純度等級較高的分析純AR（二級）或化學純（三級），以免帶入雜質(zhì)和有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料有不利影響。配制母液要用純度較高的蒸餾水或去離子水，藥品稱量、定容都要準確。配好后，在容器上貼上標簽，注明配制日期、母液倍數(shù)和名稱。應(yīng)置于24冰箱中保存，尤其是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與有機物更應(yīng)如此?；九囵B(yǎng)基的四種母液有：大量元素（濃縮20倍）；微量元素（濃縮200倍）；鐵鹽（濃縮200倍）；除蔗糖之外的有機物質(zhì)（濃縮200倍）。在制備這四種貯備液時，應(yīng)使每一種成分分別溶解，然后再把它們彼此混合。現(xiàn)以MS

43、培養(yǎng)基為例進行母液的配制。 （1）大量元素母液在配制大量元素母液時一定要分別稱量，分別溶解，在定容時按表中的序號依次加入容量瓶中，以防出現(xiàn)沉淀。倒入貯液瓶中，貼好標簽和標好記錄后，可常溫保存或放入冰箱內(nèi)保存。 大量元素母液（配1升20倍的母液） 序號 成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg） 1 NH4NO3 1650 33000 2 KNO3 1900 38000 3 KH2PO4 170 3400 4 MgSO47H2O 370 7400 5 CaCl22H2O 440 8800配1升培養(yǎng)基吸取量50mL（2）微量元素母液在配制微量元素母液時也應(yīng)分別稱量和分別溶解，可用蒸餾水，也可用去離

44、子水，定容時不分先后次序，可隨意加入容量瓶中定容，一般不會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。倒入貯液瓶中，貼好標簽和標好記錄后，可常溫保存或放入冰箱內(nèi)保存。微量元素母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 稱取量 （mg） MnSO44H2O 22.3 4460 ZnSO47H2O 8.6 1720H3BO3 6.2 1240KI 0.83 166 Na2MoO42H2O 0.25 50 CoCl26H2O 0.025 5 CuSO45H2O 0.025 5 配1升培養(yǎng)基吸取量5(mL)（3）鐵鹽母液由于鐵鹽無機化合物不易被植物吸收利用，只有其螯合物才容易被植物吸收和利用，因此需要單獨配成螯合物母

45、液。目前常用的鐵鹽為硫酸亞鐵（FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物。此螯合物使用方便，又比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。配制方法為：稱取克硫酸亞鐵和克乙二胺四乙酸二鈉，分別用450mL的離子水（或蒸餾水）溶解，分別適當加熱并不停攪拌，待分別溶解后，再將兩種溶液混合在一起，調(diào)整pH值到，最后加蒸餾水或去離子水定容于1000mL的容量瓶中，倒入棕色貯液瓶中，貼好標簽和標好記錄后放入冰箱內(nèi)保存。鐵鹽母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg） FeSO47H2O 27.8 5560 Na2-EDTA 37.3 7460 配1升培養(yǎng)基吸取量5(mL)（4）有機物母液按表

46、中用量分別稱取各種有機物，分別溶解后，用蒸餾水或去離子水定容于1000 mL的容量瓶中，放入細口瓶中備用，貼好標簽和標好記錄后置于冰箱中低溫保存。瓊脂、蔗糖等用量較大的有機物質(zhì)，不用配成母液，在配制培養(yǎng)基時按量直接稱取，隨取隨用。 有機物母液（配1升200倍的母液）成分 配方用量(mg/L) 稱取量（mg）肌醇 100.0 20 000 煙酸（VB5） 0.5 100 煙酸硫胺素（VB1） 0.1 20 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.5 100 甘氨酸 2.0 400 配1升培養(yǎng)基吸取量5 (mL)（5）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液絕大多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不溶于水，可以加熱并不斷攪拌促使溶解，必要時加入稀酸或稀堿

47、等物質(zhì)促溶。各類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的用量極微，通常使用的濃度單位是mg/L，一般也要配制成母液，母液配制成1mg/mL的濃度，即稱取100mg生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后用容量瓶定容至100mL。有些藥品配制母液時不溶于水，需要用稀酸、稀堿或酒精溶解。常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機物的溶解方法如下：（A） 生長素類 溶于95%的乙醇或的NaOH中，用去離子水或蒸餾水定容，貯于棕色液瓶中，貼好標簽后放入冰箱內(nèi)低溫保存。NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸）、2,4-D（苯氧乙酸）般多用少量95%乙醇溶解，然后加熱的蒸餾水定容。（B） 細胞分裂素類 溶于或1mol/L的HCL或濃度小的NaOH中

48、，然后用去離子水或蒸餾水定容，貯于棕色液瓶中，貼好標簽后放入冰箱內(nèi)低溫保存。KT（激動素）、BA（6-芐基嘌呤）可先用少量1N鹽酸溶解，然后加熱的蒸餾水定容。ZT（玉米素） 先用少量95%乙醇溶解，再用熱的蒸餾水定容。（C） 赤霉素類 赤霉素易溶于冷水，但溶于水后不穩(wěn)定，易分解，最好用95%的乙醇配成母液存于冰箱。用時用去離子水或蒸餾水稀釋到需要的濃度。（6）其他（A）三十烷醇 取溶于5mL二氯甲烷中，再加入10mL吐溫80，攪拌至溶解后加蒸餾水至100mL，繼續(xù)高速攪拌至乳白色，即成0.1%乳液，存于冰箱中備用。若儲存時間過長發(fā)生乳析現(xiàn)象，應(yīng)先猛烈震蕩再使用。（B）葉酸 葉酸需先用少量氨水溶

49、解，用去離子水或蒸餾水定容。貯備母液都應(yīng)貯存于適當?shù)牟Ａ恐?，分別貼上標簽，標注母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配制一升培養(yǎng)基時應(yīng)取的量，母液最好放置于冰箱中低溫（24）保存，特別是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與有機物類物質(zhì)，貯存時間不要太長。在貯備椰子汁（液體胚乳）的時候，要先把從果實中采集到的汁液加熱煮沸，以除去其中的蛋白質(zhì)，過濾，然后置塑料瓶中貯存于-20的低溫冰箱內(nèi)。在使用這些貯備液之前必須輕輕搖動瓶子，如果發(fā)現(xiàn)沉淀懸浮物或微生物污染，必須重新配制。應(yīng)當注意的是某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如生長素、玉米素、脫落酸、赤霉素等以及某些維生素遇熱不穩(wěn)定，不能和其他營養(yǎng)物質(zhì)一起高溫滅菌，而要進行過濾滅菌。每次配制培養(yǎng)基時，吸取

50、母液量（mL）=所配培養(yǎng)基的毫升數(shù)/母液濃度倍數(shù)。如果配制1000mL培養(yǎng)基，并且母液濃度倍數(shù)為200倍，則吸取母液量（mL）=1000mL/200倍=5mL培養(yǎng)基無機營養(yǎng)研究規(guī)律：成分 配方(mg/L) 分子量 摩爾濃度NH4NO3 1650 80 20mmolKNO3 1900 101 19mmol KH2PO4 170 MgSO47H2CaCl22H2O 440 147 3mmolFeSO47H2O 27.8 278 0.1mmol Na2成分 配方(mg/L) 分子量 摩爾濃度MnSO44H2ZnSO47H2H3BO3 6.2 62 KI 0.83 166 0.005mM Na2MoO

51、42H2CoCl26H2CuSO45H264 培養(yǎng)基的配制（1）培養(yǎng)基配制步驟 配好各種母液后，就可以準備配制培養(yǎng)基了。配制培養(yǎng)基時可按如下步驟進行，如圖。 大量 微量 鐵鹽 有機物 生長調(diào)節(jié)劑 蔗糖 瓊脂 加水混合 調(diào)節(jié)pH值（用1N HCl或1N NaOH） 加熱溶解 玻璃器皿水洗、干燥 分裝 封口 高壓蒸汽滅菌 培養(yǎng)基冷卻凝固 培養(yǎng)基存放 準備接種（C） 培養(yǎng)基的分裝 將調(diào)整好pH值的瓊脂培養(yǎng)基要趁熱分裝到培養(yǎng)容器中，瓊脂在大約40時凝固。一般每瓶約40mL左右，塞上棉塞或用封口膜等封瓶口材料封口，再用線繩或橡皮筋捆扎。及時做好標記。七 外植體（1）外植體種類從理認上講，植物細胞多具有全

52、能性，若條件適宜，都能再生成完整植株，任何組織或器官多能作為外植體。但實際上，植物種類不同，同一植物不同器官、同一器官不同生理狀態(tài)，對外界誘導反應(yīng)的能力及再生能力是不同的。A、植物基因型 草本比木本易于組織培養(yǎng)，雙子葉植物比單子葉植物易于培養(yǎng)。 B、外植體來源 從田間或溫室中生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作為外植體，離體培養(yǎng)易于成功。對于大多數(shù)植物來說，莖尖是較好的外植體，由于莖尖形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳穩(wěn)定，也是獲得無病毒苗的重要途徑。也可以用葉片、莖段、根等。 C、外植體大小 外植體大小應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定，如是胚胎或脫毒培養(yǎng)，易小。如進行快繁易大。但過大不易滅菌

53、，過小難以成活。一般在為宜。葉片、花瓣5mm2，莖約，莖尖分生組織帶一兩個葉原基(2)植物材料的表面滅菌 A 外植體的滅菌方法植物生長在大自然中，而在大自然中無時無刻不存在各種微生物，處處都有雜菌滋生，因此，從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。采來用于培養(yǎng)的植物材料，不能直接進行培養(yǎng)，必須經(jīng)過仔細的表面滅菌處理后，獲得無菌材料后才能進行培養(yǎng)。把處理好的材料經(jīng)無菌操作手續(xù)放置到培養(yǎng)基上，即接種，接種的植物材料叫做外植體。實踐表明，外植體材料來源于不同環(huán)境條件下，其帶菌程度不同，滅菌難易程度和滅菌效果有明顯差別，采自田間的試材較溫室的材料難，新生嫩芽比老枝梢的芽容易，夏季生長旺

54、盛季節(jié)抽出的新芽滅菌效果好，污染率低。外植體取材自來水沖冼-70%酒精表面消毒（20-60S）-無菌水沖冼消毒劑處理無菌水充分沖冼-備用。第一步是刷洗、沖洗材料。采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分用適當?shù)能浢?、毛筆等在流水下刷洗干凈，也可以用毛筆沾少量洗衣粉刷洗。然后把材料切割到適當大小，根據(jù)清潔程度的差異，置于燒杯中，用流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，細小或易漂浮的材料可用紗布、塑料紗窗或銅絲網(wǎng)籠扎住。第二步是用洗衣粉或肥皂水浸洗并攪動，洗衣粉可按每100 mL水加12角匙的量配制，即濃度較高為好。大約浸攪15min，然后再用自來水沖凈洗衣粉，進一步減少污染。此過程可視外植體具體情況而定，

55、較干凈的或容易處理的可以省略此步驟第三步是材料的表面滅菌，要在超凈臺或接種箱內(nèi)操作。將一干凈燒杯(大小視材料多少而定)或廣口瓶內(nèi)、外表面用70%或80%酒精棉球擦拭作表面滅菌，置于超凈臺(已開機10min以上)，再把處理好的植物材料置入，同時已準備好了滅菌溶液、無菌水、待用培養(yǎng)基等。工作人員換上潔凈的工作服，戴上帽子。用肥皂洗手至肘部，用潔凈毛巾擦干，用70%酒精棉球擦手。在超凈工作臺前，附近應(yīng)放有座鐘或表，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到滅菌過的燒杯或廣口瓶中，看好時間，倒入滅菌溶液，加表面活性劑吐溫-80數(shù)滴，在持續(xù)滅菌的時間內(nèi)輕輕搖動廣口瓶，以促進植物材料各部分與滅菌溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌

56、徹底。在快到預定時間之前12min，即開始把滅菌溶液倒入另一準備好的大燒杯中，要注意勿使材料倒出。傾凈后立即倒入無菌水，輕輕搖動。表面滅菌的時間是從倒入滅菌溶液開始，到倒入無菌水時為止，加以記錄，為今后比較滅菌效果，積累經(jīng)驗。無菌水沖洗每次3min左右，視采用的滅菌溶液種類不同，一般沖洗310次。沖洗完畢后，這時的材料就可以接種了。另外，要選擇適當?shù)臏缇鷦?。目前市場上供?yīng)的一些化學滅菌劑都具有表面滅菌的作用，而在試劑的選擇上與時間長短的處理上則應(yīng)根據(jù)材料對它的敏感性來決定。表4-3為常用表面滅均劑使用濃度及效果比較。 B 滅菌劑及其效果滅菌劑要求既要有良好的滅菌作用，又要不會損傷外植體材料，或

57、較少損傷材料，還要易被無菌水沖洗掉或能自行分解，不會遺留在培養(yǎng)材料上而影響生長。常用的滅菌劑有漂白粉（1%10%的濾液）、次氯酸鈉液（0.5%10%）、升汞（氯化汞，0.1%1%）、酒精（70%）、雙氧水（3%10%）。其中次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氯氣而揮發(fā)。過氧化氫液會分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氧氣而成無害的化合物。升汞有劇毒，對材料的表面滅菌效果好，只是滅菌后難易除去殘留的汞，為此滅菌后要多次沖洗，升汞的毒害作用不象漂白粉那樣可以很快表現(xiàn)出來，一般要經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后才會表現(xiàn)。漂白粉是一種有效的殺菌劑，但應(yīng)避光、干燥保存。70%酒精比其他濃度的酒精有更強的殺菌能力和穿透力，而且有濕潤作

58、用，可排除掉材料表面的空氣，利于其他滅菌劑的滲入，由于酒精穿透力強，故應(yīng)嚴格掌握好處理時間。為了使殺菌劑潤濕整個組織表面，還需在藥液中加入潤濕劑。常用的潤濕劑有吐溫（Tueen）80，或吐溫20，可加入數(shù)滴或用0.1%的濃度，對組織的濕潤有良好的效果。 常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較滅菌劑, 濃度（%）, 去除, 時間, 效果次氯酸鈣, 910, 易, 530, 很好次氯酸鈉, 2, 易, 530, 很好漂白粉, 飽和溶液, 易, 530, 很好溴水, 12, 易, 210, 很好過氧化氫, 1012, 最易, 515, 好氯化汞, 0.11, 較難, 215, 最好酒精, 7075, 易,

59、 0.22, 好抗生素, 450mg/L, 中, 3060, 較好硝酸銀, 1, 較難, 530, 好八、外植體接種與培養(yǎng)九、 繼代培養(yǎng)組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)物（細胞、愈傷組織、器官、試管苗等）培養(yǎng)一段時間后，為了防止培養(yǎng)的細胞團老化，或培養(yǎng)基成分利用完而造成的營養(yǎng)不良及過多代謝產(chǎn)物積累毒害等影響，要及時將其轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基中，進行繼代培養(yǎng)，使培養(yǎng)物能順利的增殖分化及生長。繼代培養(yǎng)時間的長短因植物材料不同、培養(yǎng)方法與目的不同而不同。一般液體培養(yǎng)1周繼代一次，固體培養(yǎng)2-4周。十 植物組織 器官培養(yǎng)技術(shù)一、植物組織培養(yǎng)一般步驟闡述植物組織培養(yǎng)的基本過程：（1）準備工作（2）培養(yǎng)基制備（3）外植體制備（4

60、）接種（5）培養(yǎng)（6）定期檢查（7）移栽、煉苗誘導愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實驗材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。 最常用的生長素是IAA，NAA和2，4D，使用濃度范圍約在。最常用的細胞分裂素是KT和6-BA，使用濃度范圍在10mg/L。二、愈傷組織培養(yǎng)過程（1）愈傷組織的形成起動期：外值體（explant）中已分化的活細胞在外源激素的作用下，通過脫 分化的起動期而進入分裂，并開始形成愈傷組織。特征：外觀上雖然未見明顯變化，但實際上細胞內(nèi)一些大分子代謝動態(tài)已發(fā)生明顯的改變。 脫分化起始期的實質(zhì)是在外源生長素的誘導下，首先激活了這些細胞中特定基因表達，為細胞分裂期的DNA