端粒結合蛋白在煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細胞惡變中的作用-答辯幻燈

1、端粒結合蛋白在煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細胞惡變中的作用碩士研究生： 李小龍導 師 ： 教 授 王 威 副教授1主要內容引言材料與方法結果結論致謝2引言 煤焦瀝青已被世界衛(wèi)生組織確定為明確的人類致癌物，但其致癌機制尚不十分清楚。研究已發(fā)現絕大部分腫瘤細胞的端?？s短，端粒酶活性增強，保持端粒的穩(wěn)定是防止細胞癌變的一個重要步驟。3端粒是真核細胞染色體末端非編碼DNA重復序列和與之相連的端粒結合蛋白的功能性復合體，端粒過度消耗或者結構破壞導致其功能障礙可引起細胞發(fā)生癌變。4該課題組已發(fā)現中溫煤焦瀝青煙可致BEAS-2B細胞端粒DNA相對長度縮短、端粒酶活力增高、POT1與TRF1的mRNA及蛋白

2、表達下調、TRF2的mRNA及蛋白表達上調。5該研究通過RNA干擾技術分別抑制POT1和hTERT基因表達來觀察煤焦瀝青煙染毒BEAS-2B細胞的端粒結合蛋白TRF1、TRF2、POT1和hTERT的mRNA表達與蛋白表達等，分析他們在細胞惡變中的作用。6材料與方法永生化人支氣管上皮細胞BEAS-2B。中溫煤焦瀝青煙短發(fā)夾RNA（shRNA）表達載體7溶解250mg中溫煤焦瀝青煙提取物于二甲基亞砜(DMSO) 50ml中，使用時培養(yǎng)液稀釋至1.88mg/ml染毒。根據POT1和hTERT的mRNA序列分別設計和合成各6組shRNA質粒表達載體。8BASE-2B細胞以煤焦瀝青組，DMSO溶劑對照

3、組和空白對照組分別進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至1代、10代、20代和30代時分別對細胞進行轉染，轉染后1 d、4 d、7 d時分別進行指標檢測。9采用Realtime PCR檢測端粒縮短情況； Realtime PCR檢測POT1，TRF1 ，TRF2和hTERT的mRNA表達情況；Western Blot方法檢測及驗證POT1的蛋白及端粒酶表達情況。10采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，采用t 檢驗，LSD檢驗，方差分析，Pearson相關性分析等方法，檢驗水準 = 0.05(雙側)。11結果熒光顯微鏡下的轉染細胞12抑制POT1基因的表達可導致hTERT的mRNA表達水平下調，端粒D

4、NA相對長度縮短，TRF1與TRF2的mRNA表達水平上調，且各指標之間存在相關性。13POT1干擾1代、10代、20代、30代各組細胞POT1mRNA表達量注：*表示經LSD檢驗與各組1d，空白對照組及各P-NC組比較，P0.05；#表示與空白對照組及DMSO(P-NC)組比較， P0.05。14POT1實驗組細胞POT1蛋白相對表達量注：*表示經LSD檢驗分別與各T-NC組及正常對照組比較，P0.05。15POT1基因抑制后CTP組細胞的克隆形成率16抑制hTERT基因的表達表達可導致POT1、TRF2的mRNA表達水平均下調，端粒DNA相對長度縮短，TRF1的mRNA表達水平上調，且各指

5、標之間存在相關性。17hTERT干擾1代、10代、20代、30代各組細胞TERTmRNA表達量注：*表示經LSD檢驗與各組1d，P-NC組及空白對照組比較，P0.05；#表示與空白對照組及DMSO(P-NC)組比較， P0.05。18hTERT實驗組細胞端粒酶相對表達量19TERT基因抑制后CTP組各組細胞的克隆形成率20結論抑制POT1基因表達可促進CTP對BASE-2B細胞的惡變作用，提示抑制POT1表達后，降低了端粒的保護作用，激發(fā)了TRF1及TRF2基因的表達使端粒長度縮短，細胞核異常，端粒酶活力降低，細胞惡變加速。21抑制hTERT基因表達后可減弱CTP對BASE-2B細胞的惡變作用，提示抑制hTERT基因可啟動端粒延長替代機制，從而延緩或減弱細胞惡變。2223致謝衷心感謝我的導師吳逸明教授在學習方面對我的嚴格要求、工作中的諄諄教誨和生活中的親切關懷。衷心感謝王威老師在生活和學術中給予的支持和幫助，他的學術風范，治學態(tài)度，厚德博學使