尺寸排阻色譜法

1、尺寸排阻色譜法1簡介尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)，是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。被廣泛應(yīng)用于大分子分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。分子篩效應(yīng)：其固定相為化學惰性多孔物質(zhì)凝膠，凝膠具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中流出。2特點1.保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。2.保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。3.固定相與分子間作用力極弱

2、，趨于零。由于 ,柱子不能很強保留分子因此柱壽命長。4.不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10能得以分離。5.大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，后流出色柱；而中等分子居兩者之間。6.生物相容性好，有很高的活性回收率。3類型凝膠過濾色譜：用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等。 凝膠的代表是葡萄糖系列；流動相是水凝膠滲透色譜法：用于分析高聚物的摩爾質(zhì)量，如：聚乙烯、聚氯乙烯等。常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；流動相是有機溶劑（四氫呋喃）4凝膠定義：指含有大量液體(一般是水)的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 分子

3、排阻色潽法對所用的凝膠的基本要求： a. 化學性質(zhì)惰性，不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，可以反復(fù)使用而不改變其色譜性質(zhì)。 b. 盡可能不帶電荷以防止發(fā)生離子交換作用。 c. 顆粒大小均勻，機械強度盡可能高。 5固定相分類按機械強度可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯 （Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液 相色譜時，流速不宜大。剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑 又可用有機溶劑作流動相 ，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。按化學性質(zhì)分 有機凝膠（均勻凝膠、半均勻凝膠、非均勻凝膠）；無機凝膠（非均勻凝膠）。6流動相的選擇排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。溶劑的粘度要小，因