細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、關(guān)于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)體外實(shí)驗(yàn)第二張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)常用研究方法Text in here侵襲實(shí)驗(yàn)趨化運(yùn)動(dòng)劃痕實(shí)驗(yàn)第三張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞劃痕法是測(cè)定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等實(shí)驗(yàn)條件下觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)（傷口愈合實(shí)驗(yàn)，Scratch Assay）第四張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟 1先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻

2、的劃?rùn)M線，大約每隔0.51cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)3條線。第五張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟2. 在孔中加入約5105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同，接種原則為過(guò)夜后融合率達(dá)到100%；3.用10ml tip 槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS 洗滌2 次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。第六張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟4放入375%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3h 測(cè)量一次細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離，拍照(具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定)。第七張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟 5. 數(shù)據(jù)處理：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長(zhǎng)度-0 時(shí)距離=每個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度細(xì)胞

3、整體遷移的距離，求出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，時(shí)間為橫軸，遷移距離為縱軸（單位mm）作圖，并比較初始0 時(shí)與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的照片。第八張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng) 1.在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。2.一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是無(wú)血清或者低血清（2%）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。 3. 按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。4. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。對(duì)不同的細(xì)胞要觀察細(xì)胞的貼壁率等，確定實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間，保證培養(yǎng)終止時(shí)密

4、度適當(dāng)。第九張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理 趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞能夠感受到外界化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運(yùn)動(dòng)。趨化運(yùn)動(dòng)是一個(gè)非常保守的過(guò)程，對(duì)于生物體的生存、生命的繁衍等具有重要的意義。趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)（Chemotaxis Assay）第十四張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn) 微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)

5、胞等）能夠趨化性主動(dòng)遷移，穿過(guò)一定孔徑的濾膜而設(shè)計(jì)的。 濾膜（聚碳酸脂膜）將小室分隔成上下兩部分。靶細(xì)胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過(guò)濾膜形成梯度，細(xì)胞則沿著梯度穿過(guò)膜孔，黏附在膜的下面，計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測(cè)出趨化因子的趨化能力。第十五張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Boyden Chamber 裝置第十七張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟1. 在冰盒內(nèi)將趨化因子由高濃度向低濃度稀釋，將不同濃度的趨化因子置于趨化小室的下室，30ml/孔，每個(gè)濃度加3 個(gè)孔，其

6、中只加BM的孔為陰性對(duì)照；2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.1%BM 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5105/ml；3. 加樣：下室加不同濃度的趨化因子，將膜輕輕對(duì)折后展平，光面朝下毛面朝上，依次蓋上膠墊和上室將螺絲對(duì)稱擰上擰緊;在上室中加入細(xì)胞，50ml/孔，每個(gè)濃度加3 個(gè)孔；第十九張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟4. 將趨化小室在 37，5% CO2 的孵化箱中孵育3h；5. 在膜的兩端加上夾子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止碰到液體。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反復(fù)3 次后再蘸取一次，晾干；6. 固定, 染色第二十張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟7. 取

7、載玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蠟，蓋玻片封片；8. 顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，每孔至少 3 個(gè)隨機(jī)視野，3 個(gè)孔的數(shù)值取平均值;作柱狀圖，縱軸趨化指數(shù)或細(xì)胞數(shù)，橫軸組別；9. 趨化指數(shù)(Chemotaxis Index)=隨著趨化誘導(dǎo)因子的濃度梯度而遷移的細(xì)胞數(shù)目/用培養(yǎng)基做對(duì)照的遷移細(xì)胞數(shù)目第二十一張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)1. 膜，膠墊，上下小室之間防止有氣泡產(chǎn)生；2. 放膜時(shí)要對(duì)準(zhǔn)位置，過(guò)多調(diào)整位置，易發(fā)生交叉污染。3. 槍垂直，槍尖伸入孔中下大概4/5 處，迅速加樣，不要遲疑，打出液體的過(guò)程槍逐漸抬起，液體全部打出時(shí)槍尖離開液面。4. 洗膜時(shí)注意，不要把細(xì)胞面與非細(xì)胞面

8、弄反。第二十二張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十三張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn) Matrigel Invassion AssayTranswell 系統(tǒng)Transwell 小室0.4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡第二十七張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理 人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4時(shí)是液體，在37 會(huì)逐漸凝固成膠狀。主要成分為層黏連蛋白和型膠原，能在培養(yǎng)基中重建形成

9、膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。第二十八張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 濾膜孔徑一般為8mm，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。原理Transwell 電鏡圖片第二十九張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)1. 無(wú)菌條件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培養(yǎng)基）稀釋成1mg/ml 濃度，-20C 凍存?zhèn)溆茫?. 取出已稀釋好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的體積鋪于Tramwell 小室（24

10、孔板）聚碳酸酯膜上（注意：體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），37C 放置lh，使Matrigel 聚合成凝膠（注意：加基質(zhì)膠時(shí)最好將24 孔板放置在冰盒上，確保膠完全覆蓋孔底，不要有氣泡）；第三十張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培養(yǎng)基使膠重構(gòu)；4. 在 Transwell 下室中加入趨化因子或10%FBS 培養(yǎng)基600ml/孔；5. 在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞 l105 個(gè)/孔，細(xì)胞懸液體積200ml，置于5%CO2 培養(yǎng)箱于37C 培養(yǎng)24h（注意：細(xì)胞量和時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件摸索）；6. 待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上未穿過(guò)膜的細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)Transwell小室 上層培養(yǎng)液 細(xì)胞 基質(zhì)膠 下層培養(yǎng)液 細(xì)胞培養(yǎng)板 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 示意圖第三十一張，PPT共三十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7. 4%中性甲醛固定10 分鐘，Giemsa 染色10 分鐘，PBS 洗滌3 次，干燥，取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下直接觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞(200)；8. 每張膜中央部