realtime pcr的原理和應(yīng)用release

1、Realtime PCR的原理和應(yīng)用Yang Sun, PhDProduct Specialist主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Real Time PCR的概念Real time PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Ct值擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長。理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)

2、增效率Real time PCR的原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后結(jié)論：Log X0與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量Real time PCR的原理Real Time PCR的方法染料法 使用內(nèi)摻式染料 SYBR Green I 探針法 使用序列特異性探針 Taqman

3、 Molecular Beacons Dual Probes(FRET)SYBR GREEN法Real Time PCR的方法SYBR-Green 的優(yōu)點(diǎn) 使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 沒有序列特異性 可以用于不同的模板 便宜 靈敏 SYBR-Green 的缺點(diǎn) 特異性差，會(huì)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合 Taqman 的優(yōu)點(diǎn) 對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 特別適合于SNP檢測 與Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相 對(duì)簡單Taqman 的缺點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 Real Time PCR的方法分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑

4、之一 熒光背景低 分子信標(biāo)的缺點(diǎn) 設(shè)計(jì)困難 無終點(diǎn)分析功能 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo) 價(jià)格較高 Real Time PCR的方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法絕對(duì)定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M將正對(duì)照模板按照10倍進(jìn)行稀釋并且進(jìn)行PCR，將所得的Ct值進(jìn)行作圖，所得的斜率為S，則：影響效率的因素為：引物、鎂離子以及探針的濃度PCR效率的計(jì)算方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品

5、：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物含有已知數(shù)目的與待測樣品相同的擴(kuò)增片段的細(xì)胞Cited from Clinical Chemistry 48:811781185 (2002)Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法2 delta-delta Ct 主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Realtime PCR的應(yīng)用定量起始模板濃度 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP分析病原菌檢測藥廠GMP認(rèn)

6、證突變測定物種鑒定主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Real time PCR的問題及解決方案該選擇絕對(duì)定量還是相對(duì)定量？絕對(duì)定量的問題：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也有相當(dāng)多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會(huì)影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標(biāo)準(zhǔn)品又會(huì)增加批間差異。每次測定樣本都要同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測定更多的樣本，這樣也就使實(shí)時(shí)PCR的高通量有所降低。

7、由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因的擴(kuò)增效率一致。這樣會(huì)大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會(huì)對(duì)定量的結(jié)果造成很大的差異。 若選擇絕對(duì)定量則應(yīng)該注意：選擇與樣品具有完全相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)品盡量選用完全相同的體系若選擇相對(duì)定量則應(yīng)該注意：選擇合適的看家基因，通常可供選擇的看家基因包括GAPDH 、-actin、2-微球蛋白和rRNA盡可能測定擴(kuò)增效率Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR引物設(shè)計(jì)原則引物應(yīng)該非常特異Tm在5865之間GC含量在3080不要有連續(xù)的相

8、同的堿基，尤其是G如果有超過4個(gè)連續(xù)的G則此引物不可用3末端最后5個(gè)堿基中不能含有超過兩個(gè)的G或C兩條引物的退火溫度應(yīng)該盡量接近避免引物二聚體以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)物在100150bp之間最大不能超過200250bp若測定cDNA的含量時(shí)設(shè)計(jì)的探針最好時(shí)跨內(nèi)含子的應(yīng)該選擇至少時(shí)經(jīng)過PAGE純化的引物Tm比引物高810度G不能在5端堿基C的數(shù)量要大于G的數(shù)量G連續(xù)必須小于4個(gè)GC含量2080%探針長度9到40個(gè)堿基探針不能自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者不能和引物形成二聚體Realtime PCR探針設(shè)計(jì)原則雜交探針需要注意什么？在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須注意防止探針引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過程中的延伸。

9、引物探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3末端雜交，其形成以后，會(huì)致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競爭反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會(huì)產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對(duì)探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端完全磷酸化。 Real time PCR的問題及解決方案循環(huán)數(shù)為多少比較合適？一般的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)只須2530個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對(duì)于那些極微量的待測樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)

10、可以提高反應(yīng)的檢出限，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)當(dāng)循環(huán)數(shù)從25增加到34個(gè)循環(huán)時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會(huì)越高，實(shí)際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，敏感性便不再升高，因?yàn)檠h(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，也不可能因?yàn)樵黾用舾行远鵁o限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實(shí)踐中行不通，而且在理論上也不可行，因?yàn)殡S著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會(huì)抑制Taq酶的活性，另一方面，也會(huì)增加形成異源二聚體的可能性，這些都會(huì)影響到最終的定量結(jié)果。 Real time PCR的問題及解決方案Mg2的濃度如何進(jìn)行優(yōu)化？Mg2+濃度對(duì)敏感性的影響主要存在于兩方面

11、，首先， Mg2+是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，如果Mg2+的濃度無法達(dá)到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無疑將會(huì)影響到實(shí)時(shí)定量的敏感性；其次， Mg2+的濃度過高，會(huì)增加引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致敏感性降低。不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Ct值，較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對(duì)其的深度選擇應(yīng)慎重。一般來說，對(duì)以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇25mM濃度的MgCl2，對(duì)以mRNA為模板的RTPCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為48mM。 Real time PCR的問題及解決方案模板的濃度多少合適？如果研究者是進(jìn)行首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實(shí)

12、驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個(gè)稀釋度（高和中、低濃度）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，使Ct位于1530個(gè)循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Ct小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對(duì)于Ct值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號(hào)比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍?；蚪MDNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右選擇。 Real time PCR的問題及解決方案引物的濃度如何選擇？引物的濃度是一個(gè)影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會(huì)致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會(huì)大大增加

13、。對(duì)于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5uM是個(gè)合適的濃度，若初次選用這個(gè)濃度不理想，可在0.31.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。退火溫度怎么設(shè)計(jì)？首次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5，然后在12內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，這個(gè)經(jīng)驗(yàn)值往往會(huì)同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。 Real time PCR的問題及解決方案雜交探針的濃度如何設(shè)置？初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號(hào)強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。熒光域值（threshold）如何設(shè)定？PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：thr

14、eshold = 10*SD(cycle 3-15) Real time PCR的問題及解決方案Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR所使用的核酸的純度要求要求盡量的純可以使用市售的試劑盒進(jìn)行純化如果使用酚氯仿的方法需要注意：殘余的酚會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄的效率并且使RNA的值偏高（使用紫外測定的時(shí)候）可以使用DNAase來處理RNA但是如果使用一些探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要注意后續(xù)的去除或者滅活。Real time PCR的問題及解決方案利用Realtime PCR定量RNA的時(shí)候需要注意什么?反轉(zhuǎn)錄最好使用基于MMLV使用隨機(jī)引物的方法來反轉(zhuǎn)錄總RNA。隨機(jī)引物的傾向性最小，

15、如果使用序列特異性的引物或者OligodT的話RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及PolyA的長度會(huì)影響其偏向性。并且限制了18sRNA在相對(duì)定量中的應(yīng)用。盡量采取兩步法而不要使用一步法反轉(zhuǎn)錄因?yàn)閮刹椒軌虮M量少操作容易降解的RNA。一步法由于酯的堆積以及溶液成分的缺少會(huì)造成低表達(dá)量的基因的轉(zhuǎn)錄被高表達(dá)量的基因的轉(zhuǎn)錄抑制。設(shè)計(jì)的引物和探針需要跨內(nèi)含子Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR的重現(xiàn)性很差怎么辦？ PCR 反應(yīng)擴(kuò)增的效率，如果在反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不一致，就會(huì)影響到目的基因在單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個(gè)問題，必須盡量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到

16、最佳擴(kuò)增效率。目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復(fù)性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應(yīng)使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本，如果待測樣本中目的基因的量處于反應(yīng)體系的檢出限附近，那么最好是使用復(fù)孔以保證結(jié)果的可靠性。標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，對(duì)于必須進(jìn)行絕對(duì)定量的研究，標(biāo)準(zhǔn)曲線是必不可少的，雖然標(biāo)準(zhǔn)品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應(yīng)使用規(guī)范的步驟

17、或是根據(jù)所購買的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行。 Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR的重現(xiàn)性很差怎么辦？ 如果有可能盡量選擇體積較大的測試體積（50l)。避免人為地失誤（錯(cuò)加，漏加等)如果可能盡量選擇板子中間作為實(shí)驗(yàn)孔反應(yīng)之前進(jìn)行離心以便消除泡沫和粘掛在管壁上的樣品重復(fù)孔，并且使用Master mix加入管家熒光ROXReal time PCR的問題及解決方案非特異性的信號(hào)怎么解決？ 反應(yīng)體系中形成的引物二聚體非特異性擴(kuò)增由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會(huì)在反應(yīng)體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實(shí)時(shí)PCR的敏感性。要解決這個(gè)問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的或者非特異性擴(kuò)增的形成，但是在定量檢測時(shí)，它卻可以避開二者的干擾，專一地測定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號(hào)?？梢允褂脽釂?dòng)辦法，所謂熱啟動(dòng)是指在反應(yīng)體系達(dá)到引物退火溫度時(shí)才加入某一反應(yīng)成分，因?yàn)橐锒垠w和非特異性擴(kuò)增是在各種試劑一經(jīng)混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少二者的形成要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，例如所設(shè)計(jì)的兩條引物不能互補(bǔ)（尤其在3端），使兩條引物的GC含量大致一致