臨床熒光PCR結(jié)果分析及常見(jiàn)問(wèn)題

1、臨床熒光 PCR 結(jié)果分析及常見(jiàn)問(wèn)題中國(guó)人民解放軍三零二醫(yī)院王海濱一、熒光 PCR 技術(shù)在臨床診、療中的應(yīng)用PCR 技術(shù)是于 1983 年由 Mullis 發(fā)明，后來(lái)傳到我國(guó)，但是由于實(shí)驗(yàn)污染的問(wèn)題， 1998 年衛(wèi)生部取締 PCR 實(shí)驗(yàn)方法在臨床診斷中的應(yīng)用。熒光 PCR 出現(xiàn)后，污染減少很多， 但近幾年由于磁珠的應(yīng)用， 污染又再起。 2003 年， PCR 在 SARS 的早期診斷中非常有效， 當(dāng)時(shí)使用的是電泳法。 H1N1 甲型流感（ 2009 ）：熒光 PCR 技術(shù)作為確診指標(biāo)（ 755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（ SNP ）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B 。疾病（腫瘤）

2、易感基因的鑒定。二、影響臨床熒光 PCR 檢測(cè)結(jié)果的因素（一）影響臨床熒光 PCR 檢測(cè)結(jié)果的常見(jiàn)因素1. 檢驗(yàn)因素：實(shí)驗(yàn)室硬件、儀器、試劑、人員素質(zhì)、技術(shù)水平、管理水平。2. 非檢驗(yàn)因素：標(biāo)本采集、質(zhì)量、部位、標(biāo)本保存、條件、時(shí)間、標(biāo)本中的干擾物質(zhì)、樣本丟失?。ǘ?加強(qiáng)檢測(cè)前標(biāo)本的質(zhì)量管理避免問(wèn)題重復(fù)發(fā)生規(guī)范標(biāo)本前處理流程、 制度化的重要性， 建立不合格標(biāo)本記錄和定期總結(jié)制度、制定解決措施與可行路徑（編號(hào)和項(xiàng)目錯(cuò)誤等），查找標(biāo)本丟失可能的環(huán)節(jié)。加強(qiáng)本室新進(jìn)工作人員流程培訓(xùn)，經(jīng)常性進(jìn)行臨床醫(yī)護(hù)的交流與培訓(xùn)。（三） 實(shí)驗(yàn)室分區(qū)分為： 試劑配制、核酸提取、 PCR 擴(kuò)增以及開(kāi)放產(chǎn)物分析等區(qū)域。分

3、區(qū)目的：通過(guò)物理分割達(dá)到標(biāo)本、試劑或使用器具等被沾染或摻入污染，標(biāo)本間的交叉污染等。分區(qū)要求：至少要有清潔的試劑配制和核酸制備區(qū)三、試劑配制（一）試劑配制室的設(shè)置與維護(hù)以空間內(nèi)無(wú)核酸氣溶膠為準(zhǔn)！1 正壓、清潔進(jìn)風(fēng) ( 壁掛式空調(diào) ) 。試劑冰箱內(nèi)勿存放病原或核酸相關(guān)物品！定期清潔除霜！2 有效氯消毒液清潔實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、地面。3 移液器：使用前的清潔。4 離心機(jī)等：每周定期木漿紙巾擦拭， 方法。 一次性物品的使用 - 從 COBAS 的“ 浪費(fèi)” 中找到均衡?。ǘ┰噭┡渲谱⒁馐马?xiàng)試劑配制實(shí)際是簡(jiǎn)單的問(wèn)題，但是也是非常復(fù)雜的環(huán)節(jié)。1. 何時(shí)配制？如何配制！在核酸制備好后再進(jìn)行試劑配制，注意反復(fù)凍溶

4、對(duì)試劑質(zhì)量的影響，以及久配不用試劑對(duì)檢測(cè)的影響 ( 如 hot-TaqE) 。2. 如何避免熒光淬滅？避免在強(qiáng)光下配制，采用有效氯消毒液后應(yīng)進(jìn)行通風(fēng)或清水擦拭，勿在紫外燈下配制。3. 交叉污染的避免試劑與核酸何者先加更合理？試劑分配中的問(wèn)題：過(guò)吸、殘滴（第一孔）。熱蓋不能完全阻止蒸發(fā)，石蠟油，蓋、膜、離心。（三）試劑配制環(huán)境對(duì)檢測(cè)的影響PPT8 顯示的是試劑配制環(huán)境對(duì)檢測(cè)的影響，左邊的圖，是實(shí)驗(yàn)室在裝修的時(shí)候用了一些油漆， 在那個(gè)環(huán)境里面配制的試劑。右邊的圖， 是在無(wú)油漆環(huán)境下配制的。可以看到左邊的圖結(jié)果很差。（四）核酸制備凍存標(biāo)本使用前要混勻離心后使用；不同類型標(biāo)本：血清、血漿、細(xì)胞、組織、

5、乳汁、痰液、尿液等；標(biāo)本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（穩(wěn)定性）；核酸提取標(biāo)本加入量與核酸得率的關(guān)系！ 1+1 與 2 的關(guān)系；指示劑的引入，可以降低差錯(cuò)率。PPT10 顯示的是指示劑在一管法的應(yīng)用，可以看到上面藍(lán)色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差錯(cuò)。四、 熒光 PCR 擴(kuò)增（一）實(shí)驗(yàn)室怎么建？獨(dú)立區(qū)域、負(fù)壓通風(fēng)、物品專用：1. 實(shí)驗(yàn)室清潔用品的專用的重要性。2. 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理（ PCR 管加蓋、封膜、石蠟油），用兩層封口袋包裝后焚燒（如 PPT12 圖）。產(chǎn)物的處理必須由專業(yè)工作人員或經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的工作人員處理。禁止未經(jīng)培訓(xùn)的研究生、實(shí)習(xí)生和進(jìn)修生進(jìn)入?yún)^(qū)域?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行操作。3. 儀器

6、清潔處理程序：載板區(qū)先用 70% 乙醇清潔。該區(qū)所有垃圾需封閉運(yùn)輸并銷毀。4. 地面和空氣處理原則。（二） 熒光 PCR 儀器如何選擇？PCR 實(shí)驗(yàn)室的儀器非常多有幾十種，應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)的要求不同來(lái)進(jìn)行選擇。（三）熒光 PCR 儀器如何維護(hù)？熒光 PCR 儀器的功能模塊分為三個(gè)：1. 溫度模塊包含最基本的升降溫。要保證溫度模塊的均一性，既不能有邊緣效應(yīng)，也不能有局部溫度的影響。2. 光學(xué)模塊即測(cè)光系統(tǒng)， PCR 反應(yīng)的過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)都要測(cè)一次光，測(cè)光不論是照相還是掃描，都有一定的差別，光學(xué)模塊的敏感性要高。3. 軟件模塊熒光信號(hào)采集以后，要用軟件模塊來(lái)進(jìn)行分析。分析不但要人性化，而且還要準(zhǔn)確，不

7、能有故障。（四）熒光 PCR 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)量的選擇（ 60:50:40cycles ）COBASTAQMAN 60 個(gè)循環(huán)，早期是 40 個(gè)循環(huán)，近幾年的熒光 PCR 試劑，循環(huán)數(shù)有所增加，如丙肝增加到 45 個(gè)循環(huán)，乙肝 42 個(gè)循環(huán)。PPT16 顯示的是實(shí)驗(yàn)室的圖，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)量是 40 個(gè)。（五）質(zhì)控品的設(shè)立 - 沒(méi)有質(zhì)控就沒(méi)有質(zhì)量保證對(duì)一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)，一定要注意有空白對(duì)照，陰性對(duì)照與臨界對(duì)照，臨界對(duì)照是對(duì)精密度的考核。另外，有平行定量標(biāo)準(zhǔn)品。如果試驗(yàn)測(cè)的是血清，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)該是血清，而不是人造核酸。質(zhì)控品在結(jié)果報(bào)告中的應(yīng)用非常重要：1. 空白對(duì)照一般放在第一孔的位置，監(jiān)控?cái)U(kuò)增試劑及環(huán)境

8、污染。2. 陰性對(duì)照第二孔位置，監(jiān)控核酸提取，試劑是否污染，可自行制備。3. 臨界對(duì)照實(shí)驗(yàn)室自行制作，是實(shí)驗(yàn)精確度需求。4. 等效定量標(biāo)準(zhǔn)品中間位置或最后，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性前提，參與核酸提取，標(biāo)準(zhǔn)范圍寬。（六）質(zhì)控品的制作HBVDNA ：介質(zhì)的選擇、臨界質(zhì)控的制作： 400IU/ML-50IU/ML ； HCVRNA ：介質(zhì)的選擇、臨界質(zhì)控的制作： 3000IU/ML-100IU/ML ； EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV 定性試劑盒的質(zhì)控， 陽(yáng)性標(biāo)本，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)；質(zhì)控品的朔源： WHO 標(biāo)準(zhǔn)或 COBAS 等；自建質(zhì)控品：建立數(shù)據(jù)記錄（穩(wěn)定性等）；室間質(zhì)控與室內(nèi)質(zhì)控的有機(jī)結(jié)合?。ㄆ撸?

9、HBVDNA 結(jié)果分析（質(zhì)控在控與失控）HBVDNA 結(jié)果分析， 就是熒光曲線的分析， 要盡可能保證報(bào)告的數(shù)值， 低限值和高于低限值的線要平行，盡可能不要失控。臨界質(zhì)控品： 400IU/ml ；基線的選擇：平均熒光值的 3-7% ；斜率：保持在3.0-3.6( 均值 3.3) ；相關(guān)系數(shù)： r=0.999 。1.COBAS 定量?jī)?nèi)標(biāo) (QS) 的失控PPT21 顯示的是 COBAS 定量?jī)?nèi)標(biāo)失控的情況。2. 不同定量區(qū)域 QS 值分布PPT22 顯示的是不同定量區(qū)域 QS 的分布，例數(shù)是 900 多例。如果內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)了失控，定量值就無(wú)法參考了。3. 假陰性曲線的識(shí)別在熒光 PCR 曲線里面， 如

10、果有熒光曲線是陰性、 不規(guī)則的， 要考慮是不是有干擾物質(zhì)，在試劑配制或者標(biāo)本里邊有干擾物質(zhì)。此時(shí)需要復(fù)檢。五、實(shí)驗(yàn)室人員（與職稱和學(xué)歷無(wú)關(guān)）（一）實(shí)驗(yàn)室人員分類1. 實(shí)習(xí)型：按照操作說(shuō)明進(jìn)行操作，但環(huán)節(jié)控制、環(huán)節(jié)間銜接和防污染意識(shí)差！2. 工作型：能夠再現(xiàn)說(shuō)明書(shū)操作要求，具有質(zhì)量環(huán)節(jié)控制意識(shí)，具有一定的防污染常識(shí)，但發(fā)現(xiàn)問(wèn)題和解決問(wèn)題能力稍差。3. 示教型：明晰試驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并能夠?qū)ο录?jí)工作人員進(jìn)行演示和示教，具有完整的防污染意識(shí)、質(zhì)量實(shí)現(xiàn)和一定的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題解決問(wèn)題能力。4. 專家型：能對(duì)商品試劑盒存在的問(wèn)題進(jìn)行改進(jìn)，具有提前預(yù)知的質(zhì)量意識(shí)。（二）移液器的使用移液器的使用，是小問(wèn)題，大學(xué)問(wèn)

11、。1. 移液器加吸頭的要點(diǎn)，需慢慢壓，不能用力壓。2. 不同量程移液器的應(yīng)用要點(diǎn)（液體性質(zhì)）。3. 移液器連續(xù)分液掛滴對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。4. 如何避免移液器連續(xù)分液導(dǎo)致的污染。5. 移液器吹打混勻帶來(lái)的污染！6. 移液器的清洗，需要高壓?jiǎn)幔?. 移液器的校準(zhǔn)，很多單位無(wú)法實(shí)現(xiàn)。（三）質(zhì)量環(huán)節(jié)意識(shí)的培養(yǎng)（輪流當(dāng)主任）1. 環(huán)節(jié)控制能力質(zhì)量環(huán)節(jié)的認(rèn)知：明晰實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)的組成和目的！關(guān)鍵環(huán)節(jié)的實(shí)現(xiàn)：細(xì)節(jié)的嚴(yán)謹(jǐn)性與準(zhǔn)確性！環(huán)節(jié)的連貫性與細(xì)節(jié)實(shí)現(xiàn)：實(shí)現(xiàn)完整實(shí)驗(yàn)！2. 防污染素質(zhì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境防污染意識(shí)：具備科學(xué)防污染清潔意識(shí)和實(shí)現(xiàn)能力，如標(biāo)本外溢的處理、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境（空氣、桌面、地面、移液器等）清潔，實(shí)驗(yàn)廢物的管

12、理和處理，離心機(jī)的清潔和維護(hù)等。標(biāo)本間交叉污染的預(yù)防意識(shí)和實(shí)現(xiàn)能力：避免移液過(guò)程中的隱形迸濺污染（移液器）；試劑加樣過(guò)程中的沾染污染；標(biāo)準(zhǔn)品的攜帶污染等。擴(kuò)增產(chǎn)物的外露污染：產(chǎn)物回流預(yù)防能力；產(chǎn)物處理流程。（四）人員的培養(yǎng)與專業(yè)技能比對(duì)不同職務(wù)、職稱和學(xué)歷人員同時(shí)進(jìn)行；環(huán)節(jié)操作與結(jié)果同時(shí)計(jì)分；比對(duì)結(jié)果記錄在案并作為評(píng)聘指標(biāo)。六、試劑盒的質(zhì)量與評(píng)價(jià)（一）評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：抗干擾 - 理論值與實(shí)際值的吻合。1. 特異性：不同血清型對(duì)特異性的影響，抗污染性能和污染試劑2. 敏感性：血清量、加樣量對(duì)敏感性的影響（ 1+1=2 ？） , 試劑系統(tǒng)的組成與敏感性 : 引物、探針序列的選擇與用量，跨欄式試劑： 10

13、 9 -10 2 IU/ml 應(yīng)處在線性范圍內(nèi)、且均存在熒光信號(hào)的上平臺(tái)。3. 重復(fù)性：取決于核酸提取方法與擴(kuò)增效率。（二）關(guān)于臨界檢測(cè)結(jié)果的漂移例如，本場(chǎng)檢測(cè)的時(shí)候，一個(gè)病人，一次檢測(cè)是 53IU ，一次是 20IU ，這都是漂移，這個(gè)技術(shù)方法性能本身，是正常的和合理的。但這種漂移的原因，是試劑盒核酸提取的穩(wěn)定性問(wèn)題。七、關(guān)于內(nèi)標(biāo)（一）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 無(wú)需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品 Ct 值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。1.Ct 值的重現(xiàn)性：PCR 循環(huán)在到達(dá) Ct

14、 值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)， 剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期 （對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的 Ct 值是恒定的。2.Ct 值與起始模板的線性關(guān)系：由于 Ct 值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定， 因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)本同步進(jìn)行核酸提取的曲線定量方法。（二）內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR ，雙重 PCR 反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。正因如此，定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，仍為一種半定量方法。美國(guó) Texas 大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。AppliedBiosystems 公司的 7700 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀是全球公認(rèn)的熒光定量 PCR 的金標(biāo)準(zhǔn)， 可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測(cè)， 但定量檢測(cè)仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法