NC膜吸附蛋白的常見(jiàn)問(wèn)題處理

1、NC膜吸附蛋白的常見(jiàn)問(wèn)題處理基于膜的檢測(cè)試劑研發(fā)人員應(yīng)該嚴(yán)格考慮影響蛋白質(zhì)在硝酸纖維素膜上結(jié)合眾多因素，其中包括原材料的固有屬性和處理過(guò)程等。隨著膠體金標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展、研發(fā)人員對(duì)膠體金快速檢測(cè)技術(shù)深入研究，市場(chǎng)上基于膜的快速免疫層析檢測(cè)產(chǎn)品的種類(lèi)迅速增多。雖然免疫層析產(chǎn)品的包裝設(shè)計(jì)種類(lèi)繁多，實(shí)際上目前主流的商品化檢測(cè)試劑盒主要下面兩種形式。最常用的檢測(cè)形式為側(cè)向?qū)游龌蛘邔游龆浚@種檢測(cè)形式通常應(yīng)用于診所或者由直銷(xiāo)客戶檢測(cè)。另一種檢測(cè)形式為豎向斑點(diǎn)滲濾，該檢測(cè)形式需要較強(qiáng)的操作技巧，僅限于研究使用。不管試劑采用那種檢測(cè)形式，靈敏、可重復(fù)的檢測(cè)試劑的生產(chǎn)需要試劑生產(chǎn)商采用有效的途徑制備檢測(cè)線工作

2、液。快速診斷試劑生產(chǎn)商經(jīng)常對(duì)如何優(yōu)化檢測(cè)線相關(guān)的文章非常感興趣。這些文章可以有助于研發(fā)人員涉及關(guān)于蛋白質(zhì)固著于硝酸纖維素膜基本原理的討論，并對(duì)研發(fā)人員在開(kāi)發(fā)免疫層析試劑中面臨的常見(jiàn)問(wèn)題給予強(qiáng)調(diào)。由于關(guān)于蛋白質(zhì)吸附于NC膜的問(wèn)題普遍存在于側(cè)向?qū)游?，因此這篇文章重點(diǎn)討論這方面的問(wèn)題。蛋白質(zhì)吸附的重要性圖1依靠在膜上適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合捕獲試劑，用試紙條檢測(cè)樣本可以獲得清晰、明顯的結(jié)果。在免疫層析檢測(cè)中，蛋白質(zhì)固著于NC膜作為待測(cè)樣本的捕獲試劑。由于檢測(cè)結(jié)果完全取決于捕獲試劑在膜上達(dá)到良好的吸附效果，因此蛋白質(zhì)在膜上均一、良好的吸附對(duì)檢測(cè)結(jié)果非常重要（見(jiàn)圖1）。自從NC膜第一次應(yīng)用于蛋白質(zhì)吸附以來(lái)，已有相當(dāng)多

3、的關(guān)于蛋白質(zhì)吸附于NC膜的研究，但蛋白質(zhì)吸附于NC膜的確切作用機(jī)理仍然不能確定。雖然多種作用力在結(jié)合中起到作用，尤其比如疏水力、氫鍵、靜電作用，但是每種作用力的重要性和明確的效果仍然讓人難以琢磨。目前有兩種比較合理的作用模式。第一種模式認(rèn)為，蛋白質(zhì)最初通過(guò)靜電作用被吸附到NC膜表面，而長(zhǎng)期的結(jié)合作用是通過(guò)氫鍵和疏水作用完成的。雖然這一原理難以證明，但與已發(fā)表的文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，也是最為接受的作用機(jī)理。圖2本檢測(cè)結(jié)果中的捕獲線有代表性的反應(yīng)了蛋白吸附問(wèn)題表2在這幾個(gè)例子中，樣品檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)線存在明顯的蛋白質(zhì)結(jié)合問(wèn)題。第二種模式認(rèn)為，蛋白質(zhì)首先通過(guò)疏水相互作用結(jié)合到NC膜上，通過(guò)靜電力牢固地與N

4、C膜結(jié)合則。該結(jié)合模式同大量已發(fā)表的文獻(xiàn)結(jié)果一致，然而靜電作用機(jī)理對(duì)于采用干燥或乙醇吸附方法到達(dá)的蛋白質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定的吸附于NC膜上無(wú)法提高合理的解釋。不管蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力如何達(dá)到平衡，研究人員在優(yōu)化蛋白質(zhì)吸附于特定的NC膜時(shí)，必須綜合考慮所有影響蛋白質(zhì)吸附的作用力。這一觀點(diǎn)不可避免的影響著試紙條板材的選擇及其處理工藝。例如，如果產(chǎn)品開(kāi)發(fā)人員選用可以極度降低靜電相互作用或者疏水相互作用的緩沖液，那么蛋白質(zhì)的吸附能力則劇烈的降低。同理，蛋白質(zhì)點(diǎn)膜后充足地干燥對(duì)于確保蛋白質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定地固著于NC膜非常重要。生產(chǎn)商選用的材料能夠有效地將蛋白吸附于NC膜上。影響蛋白質(zhì)吸附于NC膜的材料通常有3種類(lèi)型：非特

5、異性的蛋白質(zhì)、影響靜電相互作用以及疏水相互作用的物質(zhì)。常見(jiàn)的能夠降低蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)包括競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的其他蛋白，如BSA、動(dòng)物血清，干擾氫鍵的形成物質(zhì)（如甲酰胺、尿素），影響疏水作用形成的物質(zhì)（如Tween、Triton、Brij）。人工合成的結(jié)合物比如聚乙烯醇、聚乙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮也可以影響蛋白質(zhì)的結(jié)合，它們的作用機(jī)理可能是抑制一個(gè)或者多個(gè)蛋白質(zhì)與NC膜結(jié)合的共同作用的結(jié)果。如果NC膜上結(jié)合的蛋白量不足或者蛋白結(jié)合力不夠強(qiáng)，就會(huì)出現(xiàn)相當(dāng)多的問(wèn)題，在檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)線上非常明顯（見(jiàn)圖2）。如果膜上結(jié)合的蛋白量太低，那么在結(jié)果中檢測(cè)線顯色較弱而且檢測(cè)靈敏度降低（見(jiàn)圖3）。如果蛋白不能牢

6、固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前發(fā)生擴(kuò)散,從而導(dǎo)致檢測(cè)線較寬、顯色較弱而不是鮮艷而清晰,使檢測(cè)結(jié)果難以解釋。在極端條件下，如果蛋白與NC膜的物理吸附作用太弱，流過(guò)的蛋白檢測(cè)物和表面活性劑溶液可能將固著的蛋白從NC膜上洗掉，從而顯示較寬或者根本不清晰的檢測(cè)線，難以解釋檢測(cè)結(jié)果。圖3弱的捕獲線反應(yīng)了吸附于膜上的蛋白量很低圖4流過(guò)的待檢蛋白和表面活性劑溶液洗掉NC膜吸附的捕獲蛋白導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)擴(kuò)散的檢測(cè)線。體外診斷試劑研發(fā)人員經(jīng)常遇到上述問(wèn)題，而且這些問(wèn)題明顯地延長(zhǎng)了免疫層析檢測(cè)試劑的研發(fā)周期。為了了解如何解決上述問(wèn)題，研究人員首先應(yīng)該牢固的掌握影響蛋白與NC膜結(jié)合的各種因素，包括材料

7、的固有屬性及其檢測(cè)前的處理過(guò)程。本文的第一部分就這些問(wèn)題進(jìn)行討論，第二部分主要介紹在技術(shù)上如何解決這些問(wèn)題（待發(fā)表于IVD技術(shù)雜志）。影響蛋白質(zhì)吸附的因素當(dāng)研究蛋白質(zhì)捕獲劑結(jié)合于NC膜時(shí),研發(fā)人員應(yīng)該考慮下面五個(gè)影響蛋白質(zhì)結(jié)合作用機(jī)理的每一個(gè)關(guān)鍵因素。0溶解捕獲蛋白的工作緩沖液；0用來(lái)固著捕獲蛋白的NC膜；0捕獲蛋白自身；0將捕獲蛋白點(diǎn)樣于NC膜的系統(tǒng)；0捕獲蛋白點(diǎn)樣時(shí)的環(huán)境濕度。雖然很多研發(fā)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于免疫層析檢測(cè)中使用的工作緩沖液和膜的特性進(jìn)行了充分的研究，但他們不可能全面的研究或優(yōu)化他們使用的系統(tǒng)和捕獲試劑。這些忽略的步驟通常由于在開(kāi)發(fā)之前就已經(jīng)考慮恰當(dāng)，因此在開(kāi)發(fā)中很少有機(jī)會(huì)進(jìn)一步調(diào)整。

8、由于疏漏了對(duì)那些因素優(yōu)化，研發(fā)人員常常集中精力優(yōu)化他們認(rèn)為必須優(yōu)化的方面。捕獲劑隨著檢測(cè)項(xiàng)目的不同，作為捕獲劑的蛋白質(zhì)各不相同。即便捕獲劑差異的稍微,也沒(méi)有一個(gè)捕獲劑與另外的捕獲劑完全相同。不同的蛋白捕獲劑對(duì)不同膜的吸附能力不同，或許這一因素至關(guān)重要（見(jiàn)圖5）。單克隆抗體作為較均一的蛋白捕獲劑，優(yōu)化與NC膜的結(jié)合過(guò)程較為簡(jiǎn)單,而多克隆抗體由于含有針對(duì)大量不同的抗原決定簇的抗體，不同抗體的最佳結(jié)合條件可能稍微不同，從而導(dǎo)致蛋白與膜結(jié)合條件的優(yōu)化過(guò)程較為復(fù)雜。比如IgA、IgM存在結(jié)構(gòu)或者空間位阻等因素，其與膜結(jié)合條件的優(yōu)化過(guò)程較為困難。比如BSA、A蛋白以及G蛋白由于化學(xué)性質(zhì)或者分子太大較易吸附

9、于固相載體，從而非常難將其吸附于NC膜。HUtibtm.iilhIGon423-1七E.E4Mt富專(zhuān)E圖5IgG、白蛋白與不同廠家NC膜結(jié)合能力的比較。儀器設(shè)備捕獲劑噴涂系統(tǒng)仍然存在某些問(wèn)題，大多數(shù)商品化可用的（捕獲劑噴膜、劃線）儀器設(shè)備各有利弊。其可變參數(shù)包括能否噴涂給定的體積，能否觸及條、墊或膜,噴涂速度以及噴涂后處理過(guò)程。體外診斷試劑生產(chǎn)商需要的最佳解決方案即為找到能夠最有效地解決實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中面臨的問(wèn)題，比如原材料問(wèn)題、生產(chǎn)能力問(wèn)題。優(yōu)化其他因素也可以?xún)?yōu)化特定的捕獲線噴涂設(shè)備。環(huán)境濕度點(diǎn)膜時(shí)的環(huán)境濕度嚴(yán)重影響捕獲線的質(zhì)量，尤其對(duì)噴膜系統(tǒng)影響嚴(yán)重。如果空氣濕度太低，則NC膜上聚集靜電荷，

10、從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)噴涂于NC膜表面時(shí)容易產(chǎn)生斑點(diǎn)，NC膜表面容易產(chǎn)生疏水斑。如果空氣濕度太高，導(dǎo)致NC膜對(duì)捕獲蛋白的毛細(xì)作用加強(qiáng)，從而容易引起捕獲線變寬或者擴(kuò)散。通常情況下，最佳的點(diǎn)膜環(huán)境相對(duì)濕度應(yīng)保持在45-65%。為了確保原材料的均一性，點(diǎn)膜前應(yīng)根據(jù)相應(yīng)試驗(yàn)確定的最佳平衡時(shí)間將NC膜在工作環(huán)境中平衡。工作緩沖液的優(yōu)化由于蛋白質(zhì)捕獲劑千差萬(wàn)別，不同蛋白的最大結(jié)合量工作緩沖體系各不相同。影響點(diǎn)膜工作緩沖液的重要因素有兩個(gè)。0蛋白質(zhì)的可溶性（即用于吸附于NC膜的蛋白量）；0蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性（即傾向于聚集或溶于水）為了確保足夠的蛋白噴涂捕獲線，首先必須將捕獲蛋白溶解于點(diǎn)膜緩沖液，而點(diǎn)膜緩沖液維持一定

11、的離子濃度可以確保蛋白的可溶性。盡管點(diǎn)膜工作液具備一定的離子強(qiáng)度有助于控制捕獲劑的PH值，但也可以干擾蛋白質(zhì)結(jié)合的靜電相互作用。因此，確定維持足量的捕獲蛋白濃度的最低可能離子強(qiáng)度至關(guān)重要。如果特定濃度的蛋白質(zhì)分子在溶液中穩(wěn)定，那么就會(huì)溶解于溶液中。但是如果它的能量狀態(tài)有利于形成固體，那么吸附到NC膜上的蛋白量多于穩(wěn)定溶解在溶液里的蛋白量。采用破壞穩(wěn)定劑或者沉淀劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生這種能量狀態(tài)，但是如果誘導(dǎo)過(guò)度也可能引起其它的問(wèn)題。如果蛋白在點(diǎn)膜以前沉淀，那么整個(gè)試劑系統(tǒng)就高度不穩(wěn)定且?guī)缀跬耆豢芍貜?fù)性，導(dǎo)致剩余的吸附到NC膜上的溶解蛋白量劇烈減少，而且沉淀物也可造成諸如堵塞噴涂設(shè)備管道或者NC膜微孔

12、等問(wèn)題。在某種情況下，點(diǎn)膜過(guò)程中為了達(dá)到適量的蛋白吸附必須將蛋白質(zhì)處于不穩(wěn)定狀態(tài)，有些情況也有例外。上述分析表明，通過(guò)調(diào)整蛋白噴涂工作緩沖系統(tǒng)的屬性能夠改變蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合作用，其中核心屬性涉及緩沖液的離子強(qiáng)度、酸度及所用沉淀劑濃度。離子強(qiáng)度在給定的離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶解度隨著工作緩沖液中鹽濃度的增加按比例增加。為了降低溶液中捕獲蛋白分子的穩(wěn)定性，溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)該盡可能低，這樣可以增加蛋白質(zhì)與NC膜結(jié)合的速度。同時(shí)，研發(fā)人員也應(yīng)該注意，高濃度鹽能夠引起蛋白沉淀，而且噴膜后的干燥過(guò)程中大量的鹽能夠干擾檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性和靈敏度。酸度點(diǎn)膜工作液的PH值相當(dāng)顯著的影響蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合效果

13、。通常蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最低的。因此，研發(fā)人員為了降低溶液中捕獲蛋白分子的穩(wěn)定性，將捕獲蛋白的等電點(diǎn)作為理想的噴膜工作緩沖液的Ph值。共沉淀劑研發(fā)人員通常選擇添加不穩(wěn)定劑或共沉淀劑降低溶液中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)整噴膜工作緩沖液。IgG的Fc區(qū)和F(ab)區(qū)對(duì)共沉淀劑的穩(wěn)定性不同，而且Fc區(qū)結(jié)構(gòu)更可能被共沉淀劑降解,部分不穩(wěn)定的Fc區(qū)導(dǎo)致更多在正常情況下隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露。因此，不管那種蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合機(jī)理被接受，由于采用共沉淀劑增加的蛋白質(zhì)疏水性將提高蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合能力。圖6采用不同緩沖液以lmg/ml鼠IgG劃線的檢測(cè)結(jié)果最常用的共沉淀劑時(shí)醇類(lèi)，醇類(lèi)有許多理由值得推

14、薦。醇類(lèi)的存在有助于NC膜的重濕潤(rùn)，減少NC膜可能帶有的靜電，而可以降低溶液中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。在基于膜的免疫分析中，3-5%的甲醇可以極大地提高檢測(cè)性能。在幾年前，將醇類(lèi)提高蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合性能應(yīng)用于ELISA微孔板生產(chǎn)中，而現(xiàn)在這方法已經(jīng)作為標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程。脂肪醇對(duì)NC膜結(jié)合蛋白的影響發(fā)表于1980年，加1%異丙醇作為固定劑在westernblotting實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用。雖然其他物質(zhì)如硫酸銨等作為沉淀劑有時(shí)也有很好的效果，但是它們通常不如醇類(lèi)，這類(lèi)型的試劑濃度稍微的變化都會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的沉淀效果。鑒于這種原因，通常不會(huì)使用醇類(lèi)以外的其他共沉淀劑。綜上所述，新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的噴膜工作緩沖液為：

15、10mMPH7磷酸緩沖液+3%甲醇。雖然這種緩沖液不是所有蛋白質(zhì)的最佳工作液，但它為開(kāi)發(fā)過(guò)程提供了一個(gè)極好的起始點(diǎn)。膜對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合的影響在快速診斷檢測(cè)中，NC膜在三個(gè)方面顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)合。0NC膜的孔徑0膜的后處理0膜的類(lèi)型由于作為捕獲劑的蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，沒(méi)有一種NC膜作為最佳NC膜適合于任何快速檢測(cè)反應(yīng)。不同類(lèi)型的NC膜與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力差別較大（見(jiàn)圖5）,這就意味著任何一個(gè)新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)都必須重新篩選膜。另外，對(duì)膜等額外優(yōu)化可能會(huì)進(jìn)一步提高快速檢測(cè)試劑的性能與重復(fù)性?？讖窖邪l(fā)人員在側(cè)向免疫層析中應(yīng)謹(jǐn)慎的對(duì)待NC膜供應(yīng)商提供的NC膜標(biāo)稱(chēng)孔徑。膜的實(shí)際孔徑取決于采用的測(cè)量方法，而不同膜生產(chǎn)商

16、采用不同的測(cè)量方法，因而兩個(gè)相同標(biāo)稱(chēng)孔徑的NC膜采用相同的測(cè)量方法檢測(cè)其實(shí)際孔徑差異顯著（圖7）。|hrinA*Dul白BaMiqCDtiini54521【ErhwHMrir-BdPJdM品齊圖7采用Coulter氣孔計(jì)檢測(cè)的NC膜孔徑數(shù)據(jù)通常在豎向過(guò)濾即根據(jù)NC膜的厚度檢測(cè)NC膜的孔徑，而豎向過(guò)濾測(cè)定的膜孔徑和類(lèi)型與側(cè)向過(guò)濾測(cè)定的膜孔徑與類(lèi)型沒(méi)有相關(guān)性。因此，在側(cè)向免疫層析中，常規(guī)方法測(cè)定的NC膜孔徑與實(shí)際孔徑有一定的差異。如果NC膜帶有塑料底襯，則無(wú)法用豎向過(guò)濾測(cè)定膜的孔徑。在這種情況下，供應(yīng)商提供的膜孔徑常常為基于側(cè)向毛細(xì)作用進(jìn)行估計(jì)。研發(fā)人員也可以慎重地根據(jù)標(biāo)稱(chēng)孔徑區(qū)分同一廠家的NC膜

17、，但不推薦采用這種方法區(qū)分不同廠家生產(chǎn)的NC膜。尤其對(duì)于側(cè)向?qū)游鰜?lái)說(shuō)，標(biāo)稱(chēng)孔徑不是NC膜蛋白質(zhì)結(jié)合能力的依據(jù)，建議研發(fā)人員進(jìn)行新的研發(fā)項(xiàng)目前最好篩選最佳的NC膜。盡管標(biāo)稱(chēng)孔徑實(shí)際意義較小，但NC膜的側(cè)向孔徑和膜的結(jié)構(gòu)對(duì)于NC膜是否能應(yīng)用于側(cè)向?qū)游鲇兄匾挠绊?。在一定的范圍?nèi)，NC膜的有效表面積隨著標(biāo)稱(chēng)孔徑的減小而增加，從而NC膜的蛋白結(jié)合能力隨之增加。不同孔徑NC膜的近似表面積可以通過(guò)各種材料的比表面積率（SAR）進(jìn)行估計(jì)。比表面積率即NC比表面積率（SAR）表IWhatmanNC膜比表面積率檢測(cè)值（BET表面積檢測(cè)方法檢測(cè)數(shù)值）標(biāo)定孔徑大小伽）1105812986663膜孔內(nèi)的有效表面積與膜

18、表面積的比率（表1）。另外一個(gè)重要的因素即為隨著NC膜孔徑減小，側(cè)向?qū)游龅拿?xì)作用也降低（表2）,從而由于待檢分析物與捕獲蛋白較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間增加了側(cè)向免疫層析的檢測(cè)靈敏度。圖8后期處理過(guò)程中存在水，可能導(dǎo)致捕獲線存在條紋或產(chǎn)生嚴(yán)重的批間差異。上述兩種現(xiàn)象的綜合效應(yīng)即為采用較小孔徑的NC膜可以顯著提高檢測(cè)的靈敏度。作為常規(guī)的指導(dǎo)方針，如果研發(fā)人員比較關(guān)心最終檢測(cè)的靈敏度，則應(yīng)該選擇盡可能小孔徑的NC膜；如果研發(fā)人員比較關(guān)心側(cè)向?qū)游龅姆磻?yīng)速度，則應(yīng)該選擇較大孔徑的NC膜。在產(chǎn)品研發(fā)早期階段，無(wú)論需要什么種類(lèi)的NC膜，研發(fā)人員最好應(yīng)該盡可能篩選最佳的NC膜。后處理NC膜生產(chǎn)后通常進(jìn)行膜的后處理，可以

19、去掉膜表面的沒(méi)有聚合的單體分子或者改善NC膜的重濕潤(rùn)性。另外，后處理可以為NC膜添加少量的化學(xué)試劑或其他物質(zhì)以進(jìn)一步提高最終檢測(cè)試劑的性能。通常情況下，生產(chǎn)廠家應(yīng)該知道在NC膜上添加什么物質(zhì)，并掌握添加濃度和程序。在NC膜添加劑存以及NC膜結(jié)合一定蛋白質(zhì)的條件下，NC膜添加劑對(duì)膜爬行速率、老化情況的具有明顯的影響效果。在生產(chǎn)過(guò)程中，大量的企業(yè)為了保持NC膜的親水性而對(duì)其進(jìn)行后處理。實(shí)際上，就捕獲線點(diǎn)膜于NC膜等生產(chǎn)流程以后或到達(dá)終端用戶以前是否對(duì)NC膜進(jìn)行親水性處理意見(jiàn)不同。由于減少了側(cè)向免疫層析檢測(cè)試劑生產(chǎn)商必須的膜處理程序，購(gòu)買(mǎi)的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的NC膜擁有迷人的魅力。這種處理過(guò)的NC膜可以直接

20、現(xiàn)貨供應(yīng)，從而免除了購(gòu)置蛋白質(zhì)噴膜后進(jìn)行處理NC膜儀器設(shè)備的費(fèi)用，并縮短的生產(chǎn)周期。在購(gòu)買(mǎi)處理過(guò)的NC膜以前，研發(fā)人員應(yīng)該考慮下列可能不適應(yīng)生產(chǎn)的情況。NC膜的儲(chǔ)存超過(guò)使用效期，導(dǎo)致在捕獲蛋白噴膜以前NC膜的親水性添加劑從膜上脫落，這是使用處理后NC膜的主要缺憾。NC膜上親水性添加劑的濃度改變也會(huì)影響NC膜的蛋白結(jié)合能力、膜的親水性以及側(cè)向爬行速度。因此，檢測(cè)試劑的有效期取決于膜親水性添加劑的含量、從NC膜生產(chǎn)到檢測(cè)試劑生產(chǎn)的時(shí)間間隔以及檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)試時(shí)面臨的未知因素。另外，如果生產(chǎn)商購(gòu)買(mǎi)后對(duì)NC膜進(jìn)行后處理，研發(fā)人員應(yīng)記錄NC膜上親水性試劑濃度并對(duì)其進(jìn)行充分的穩(wěn)定性研究，從而建立最佳的后處

21、理程序確保膜的使用和長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。未處理的NC膜的親水性與其孔徑直接相關(guān)，但親水性試劑處理的NC膜親水性則由其處理試劑決定。如果NC膜在儲(chǔ)存時(shí)處理試劑脫落或測(cè)試時(shí)被樣本沖走，那么膜的實(shí)際性能與其標(biāo)稱(chēng)性能相比發(fā)生劇烈的變化。通過(guò)原始質(zhì)控檢驗(yàn)，生產(chǎn)商可以確定親水性處理和孔徑結(jié)構(gòu)對(duì)NC膜的綜合影響。如果親水性處理試劑老化或從NC膜上脫落，從而使NC膜的性能取決于膜孔徑的比例增加，導(dǎo)致原始質(zhì)控檢驗(yàn)無(wú)效。研發(fā)人員通過(guò)采用孔徑結(jié)構(gòu)一致的不同批號(hào)且未經(jīng)親水試劑處理，以盡量確保產(chǎn)品的最小變異系數(shù)。表IIWhatman膜的典型層析率數(shù)據(jù)標(biāo)定孔徑大?。║m）遷移至4.5cm時(shí)所需時(shí)間（sec）32453551852

22、58140201210020由于許多處理試劑都是水溶性的，噴涂捕獲線時(shí)，任何水的存在均可沖掉捕獲線處的處理試劑，導(dǎo)致膜上部分區(qū)域由于沒(méi)有親水性處理劑而高度疏水，使捕獲蛋白不能與待測(cè)樣本、膠體金結(jié)合物充分結(jié)合，嚴(yán)重影響試劑盒的敏感性和特異性。疏水斑點(diǎn)常常引起樣品不均一通過(guò)捕獲線，使檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生條紋或顯色深淺不一致（圖8），甚至檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)白色條紋。如果在噴涂捕獲線后進(jìn)行親水處理，則可避免這些缺陷。研發(fā)人員應(yīng)該根據(jù)時(shí)間、成本權(quán)衡處理過(guò)或者沒(méi)有采用表面活性劑處理的原料在確保試劑穩(wěn)定性與精密性上的優(yōu)勢(shì)。膜的類(lèi)型不管膜的孔徑或者何種添加劑對(duì)其處理，NC膜的類(lèi)型顯著影響著其蛋白結(jié)合的水平。圖5顯示不同制造

23、商生產(chǎn)的不同標(biāo)稱(chēng)孔徑NC膜對(duì)免疫球蛋白和白蛋白的不同結(jié)合水平比較。一系列的數(shù)據(jù)顯示了結(jié)合水平上的差異與NC膜標(biāo)稱(chēng)孔徑變化關(guān)系不大。通過(guò)對(duì)圖表比較表明，免疫蛋白結(jié)合最佳的膜對(duì)白蛋白結(jié)合不一定最佳。因此，相關(guān)蛋白結(jié)合水平不僅受NC膜設(shè)計(jì)形式的影響，還受到生產(chǎn)商原料來(lái)源的影響。對(duì)于有固定表面積的一系列NC膜來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的結(jié)合水平是由NC膜的聚合物類(lèi)型與影響膜表面能量的處理試劑共同作用的結(jié)果。生產(chǎn)NC膜的基本聚合物可以適用于許多商業(yè)途徑，而且不同使用途徑性能上都有稍微差別，況且不同NC膜生產(chǎn)商采用不同的處理方法。因此，建議研發(fā)人員通過(guò)試驗(yàn)評(píng)價(jià)使用的NC膜及其對(duì)相關(guān)蛋白結(jié)合能力。NC膜的老化如果NC膜未

24、經(jīng)過(guò)親水性添加劑處理，新生產(chǎn)的NC膜將在其表面殘留約5-10%的濕氣。涉及NC膜老化的傳統(tǒng)觀念一致認(rèn)為殘留的濕氣可以揮發(fā)掉，因此，隨著NC膜濕氣的揮發(fā)，NC膜漸漸變得疏水、聚集靜電荷和易脆。實(shí)際上，并非如此簡(jiǎn)單。有些關(guān)于NC膜老化的研究認(rèn)為，NC膜殘留的濕氣是可揮發(fā)的，而最近研究表明,NC膜在長(zhǎng)期高相對(duì)濕度的儲(chǔ)存條件下，仍然保持疏水效果。經(jīng)過(guò)親水性試劑處理的NC膜穩(wěn)定性取決于親水性添加劑的性質(zhì)。儲(chǔ)存NC膜時(shí)，避免接觸容易引起NC膜產(chǎn)生疏水作用的有機(jī)溶劑和膜聚合物斷鏈的強(qiáng)光照射非常重要。目前，在正確的儲(chǔ)存條件下（45-55%相對(duì)濕度），NC膜至少穩(wěn)定儲(chǔ)存2年以上。噴涂捕獲線以后封閉的NC膜可以?xún)?chǔ)

25、存更長(zhǎng)時(shí)間。NC膜爬行速度的優(yōu)化NC膜的爬行速度是影響免疫分析結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。在NC膜、檢測(cè)線以及待測(cè)樣本濃度確定的情況下，檢測(cè)的靈敏度隨著爬行速度的下降而提高，即隨著NC膜爬行速度的下降，顯示的待測(cè)樣本濃度提高。表III有效的膜封閉材料材料Tween20TritonXTOOPVA(15kDa)PVP(33kDa)PEG(20kDa)Brij常用工作濃度(%)0.01-20.01-20.10-50.10-70.05-30.05-3兩者遵循一個(gè)與平方成反比的規(guī)律，即：顯示的待測(cè)樣本濃度a1/（層析速度）2因此，若NC膜爬行速度提高一倍則待檢樣本濃度顯示為原來(lái)濃度的1/4.封閉劑NC膜本身為疏水材料，而NC膜對(duì)水的層析作用主要由于其纖維間隙存在水份。NC膜的疏水作用主要由以下三個(gè)因素造成：0疏水待測(cè)物與NC膜非特異性反應(yīng)而產(chǎn)生的非特異性信號(hào)；0纖維間隙水份喪失引起的長(zhǎng)期儲(chǔ)存困難；0快速檢測(cè)中的重潤(rùn)濕速度、爬行速度太慢對(duì)噴涂捕獲線后的NC膜封閉處理可以減少或消除這些現(xiàn)象。在理論上，研發(fā)人員應(yīng)選擇有助于確保產(chǎn)品的穩(wěn)定性和可重復(fù)性的封