表觀2016中文說(shuō)明書17-701

1、Magna RIPTMRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒Magna RIP試劑盒(目錄號(hào)17-700)EZ-Magna RIP試劑盒(目錄號(hào)17-701)Magna RIP Quad(目錄號(hào)17-704)僅供研用究于使診用斷。目錄引言23456678910101115試劑盒組分未提供的試驗(yàn)材料RIP工作流程RIP實(shí)驗(yàn)的裂解物要求控制核酸酶污染I. 裂解產(chǎn)物的配制用于免疫沉淀的磁珠配制RNA結(jié)合蛋白-RNA復(fù)合物免疫共沉淀(RIP)RNA的純化input RNA的質(zhì)量評(píng)估(可選)VI. 免疫沉淀RNA的分析RIP優(yōu)化和故障排除引言在復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程(如發(fā)育、分化、對(duì)環(huán)境變化的細(xì)胞反應(yīng))中，基因調(diào)節(jié)起著至

2、關(guān)重要的作用。除轉(zhuǎn)錄因子參與的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，細(xì)胞還應(yīng)用轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。在此，涉及到某些RNA結(jié)合蛋白(P)，共同瞬時(shí)調(diào)控功能性相關(guān)基因產(chǎn)物的mRNA的翻譯速度。盡管轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)已經(jīng)被廣泛的研究，RBP介導(dǎo)的 mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及在此過(guò)程中非編碼RN 所起的作用尚未闡明。廣泛應(yīng)用的ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)試驗(yàn)，能夠在體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境中識(shí)別DNA結(jié)合蛋白的DNA靶標(biāo)。與之類似，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)可可用于識(shí)別與特定細(xì)胞核或細(xì)胞漿結(jié)合蛋白相關(guān)的特定RNA分子(包括多種類型)。這些實(shí)驗(yàn)涉及RNA結(jié)合蛋白的內(nèi)源性復(fù)合物的免疫沉淀，以及與此RNA結(jié)合蛋白有關(guān)的任何RNA種類的共同分

3、離。這些種類RNA的純化使得mRNA(和與之有關(guān)的潛在的非編碼RNA)的分離和識(shí)別成為可能。RIP 實(shí)驗(yàn)兼容下游應(yīng)用，包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(R T-P CR) 、微陣列分析(RI P- 芯片)測(cè)序” 或者其他基于2 代測(cè)序的平臺(tái)(RIP-Seq)。Millipore通用RIP免疫沉淀試劑盒，允許研究人員利用針對(duì)RNA結(jié)合蛋白抗體或標(biāo)簽抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。此外，我們還以RIPAb+試劑盒提供RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的抗體，包IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所需的對(duì)照 (見com)。Magna RIPTM和EZ-Magna RIPTM組分盒2Magna RIPEZ-Magna RIPMagna RIP Quad (目

4、錄號(hào)17-700)(目錄號(hào)17-701)(目錄號(hào)17-704)MAGNARIP01MAGNARIP01MAGNARIP01(數(shù)量4)(4下貯藏)(4下貯藏)(4下貯藏) MAGNARIP02MAGNARIP02MAGNARIP02(數(shù)量4)(-20下貯藏)(-20下貯藏)(-20下貯藏)MAGNARIP03(-20下貯藏)試本試劑劑盒提盒供兩組個(gè)盒分子，含有進(jìn)行22次獨(dú)立染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)反應(yīng)的所有必需試劑。收到后，請(qǐng)?jiān)谒緶囟认聝?chǔ)存。所提供的緩沖液足以用于五個(gè)15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中獲得的染色質(zhì)，每個(gè)平皿可提供10份質(zhì)溶液(隨細(xì)胞類型和分析類型而變化)。注意：試劑盒包括足夠操作12次免疫

5、沉淀的試劑量。根據(jù)免疫原序列相似性預(yù)測(cè)，抗SNRNP70兔多克隆抗體能與人、小鼠、大鼠和犬類SNRNP70發(fā)生交叉反應(yīng)。U1 snRNA引物也應(yīng)能夠擴(kuò)增這些物種中U1 snRNA轉(zhuǎn)化的cDNA。貯藏收到后，各組分請(qǐng)?jiān)跇?biāo)簽所示溫度下貯藏。若按指示貯藏時(shí)，試組分自運(yùn)送日期起可穩(wěn)定貯藏6個(gè)月。3MAGNARIP01(所有RIP試劑盒包含的組分盒)(4下貯藏)組分目錄號(hào)數(shù)量A/G混合磁珠CS2031780.66mLRIP洗滌緩沖液CS203177100mLRIP裂解緩沖液CS2031762.4mL0.5M EDTACS2031750.5mL10% SDSCS2031740.3mL鹽溶液ICS20317

6、31.0mL鹽溶液IICS2031850.3mLMAGNARIP02(所有RIP試劑盒包含的組分盒)(-20下貯藏)沉淀促進(jìn)劑CS2032080.1mL正常小鼠IgGCS200621125g純化兔IgGPP64B125g蛋白酶抑制劑混合物200XCS20322020L核糖核酸酶抑制劑CS20321975L蛋白酶K (10mg/mL)CS2032180.36mL不含核酸酶的水CS2032170.3mLMAGNARIP03(僅17-701的組分盒)(-20下貯藏)陽(yáng)性對(duì)照抗體CS20321623L (0.5g/ L)，足(抗SNRNP70)*以進(jìn)行兩次免疫沉淀RIP引物，U1 snRNA*CS20

7、321575L(對(duì)人類U1 snRNAFor(正向引物)：5-GGG AGCAT GAT具有特異性的每種對(duì)CAC GAA GGT-3照引物5M)REV(反向引物)：5-CCA CAA ATG CAG TCG AGT TTC CC-3未提供的試驗(yàn)材料試劑設(shè)備用目的于抗RN體A結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)的磁真力空架抽吸(M器erckMillipore，目錄號(hào)20-400)PBS(不含核糖核酸酶)(如Fisher，目錄號(hào)渦旋振蕩器旋轉(zhuǎn)混合儀BP2438-4)苯酚:氯仿:異戊醇(125:24:1=細(xì)胞培養(yǎng)物離心機(jī)如，目錄號(hào)微量離心機(jī)4.3) (FisherBP1754I)氯仿(如Fisher，目錄號(hào)B

8、P1145)超低溫冷凍柜(-80)100%乙醇(分子生物學(xué)級(jí))熱可混變合溫儀度水(能浴達(dá)或到培5養(yǎng)5箱)關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)RT-PCR旋轉(zhuǎn)器cDN A 合成試劑盒或逆轉(zhuǎn)錄酶( 如計(jì)時(shí)器ABI，目PN 4387406)用于標(biāo)準(zhǔn)移液管(2mL，5mL，10mL，25mL)PCR的Taq DNA聚合酶和不含容核量酸酶(5的-1過(guò)00濾0器L移)移液液管管吸頭緩沖液dNTPs，各2.5mM細(xì)離胞心刮管捧(15mL和50mL)關(guān)于qRT-PCR不含核酸酶的微量離心管，1.5mLcDN A 合成試劑盒或逆轉(zhuǎn)錄酶( 如熱循環(huán)儀(終點(diǎn)或?qū)崟r(shí))，目PN 4387406)PCR離心管，0.2mLABI用于qPCR的SY

9、BR Green主混合物(如ABI，目錄號(hào)PN 4367659)危害信息本使用方其案它采個(gè)用人苯防酚護(hù)等設(shè)有備機(jī)。物萃取。與苯酚接觸會(huì)引起灼傷，可能致死。操作苯酚時(shí)，應(yīng)佩戴手套 含白酶有抑二制甲劑亞混砜合(D物M時(shí)S，O應(yīng))的佩2戴0手0X套蛋使白用酶其抑它制個(gè)劑人混防合護(hù)物設(shè)接備觸。時(shí)，可能滲透皮膚和粘膜。操作蛋4RIP工作流程對(duì)照組處理組在裂解緩沖液裂解細(xì)胞RIP 實(shí)驗(yàn)所需利疫用沉A淀/G抗磁體珠與，目免 的RBP蛋白用結(jié)未結(jié)磁合合力復(fù)的架合物固物料定，洗磁珠去提取RNA采列和用測(cè)qR序T進(jìn)-P行C分R、析微陣RIP時(shí)間管理磁珠-抗體配制1小時(shí)(4下，磁珠可在0.02%疊氮化鈉中貯藏?cái)?shù)周)

10、免疫蛋沉白淀分/析蛋白質(zhì)印跡選)法(可(RNA質(zhì)量評(píng)估(可選)分析小時(shí)RNA4-6（qRT-PCR）5RNA純化2小時(shí)-80中貯RN藏A數(shù)可周在)乙醇RBP免疫沉淀4小時(shí)至過(guò)夜裂解樣本1小時(shí)(裂解產(chǎn)物可在-80下貯藏3個(gè)月)目的蛋白其它蛋白 RNAs抗體磁珠 磁力架詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案RIP實(shí)驗(yàn)的裂解物要求計(jì)算免疫沉淀次數(shù)。所需樣品包括目的抗體(用戶提供)，與目的抗體同類物種的陰性對(duì)照IgG。RIP常用對(duì)照品，anti-SNRNP70(目錄號(hào)CS203216)和陰性對(duì)照品正常兔I目錄號(hào)PP64B)均包含在EZ-Magna RIP試劑盒(目錄號(hào)17-701)中濃縮的細(xì)胞裂解物對(duì)于成功的免疫沉淀非常重要。

11、通常情況下，一次RIP反應(yīng)(即使用一種抗體進(jìn)行的一次免疫沉淀)需要100L 2.0 x107細(xì)胞的裂解產(chǎn)物)或者一個(gè)15cm培養(yǎng)板。根據(jù)所得細(xì)胞沉淀的體積，決定RIP實(shí)驗(yàn)需要的裂解緩沖液體積。裂解緩沖液體積可能會(huì)根據(jù)所使用的細(xì)胞類型不同而變化。表1為您列出HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物體積和所需RIP裂解緩沖液的一個(gè)示例。一旦您在特定細(xì)胞環(huán)境中應(yīng)用候選抗體獲得成功的RIP試驗(yàn)，您可以在必要時(shí)減少或進(jìn)一步優(yōu)化每次RIP試驗(yàn)的裂解產(chǎn)物用量。每次RIP所用的細(xì)胞總數(shù)或蛋白總量，必須依據(jù)所研究的RNA結(jié)合蛋白的豐度以及下游RNA檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。表1，每細(xì)胞培養(yǎng)物容器(HeLa細(xì)胞)的RIP裂解緩沖液的近似體積控

12、制核酸酶污染在本實(shí)驗(yàn)整個(gè)流程中，應(yīng)盡量采取標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施，以減少核糖核酸酶的污染。為最小程度的引入核糖核酸酶，應(yīng)在所有操作時(shí)，佩戴上手套。根據(jù)RNA操作的標(biāo)準(zhǔn)方案，對(duì)接觸細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物的所有儀器、玻璃器皿和塑料器皿，應(yīng)確保不含核糖核酸酶污染，或采用DEPC或其它核糖核酸酶滅活試劑進(jìn)行預(yù)處理。本盒已包含核糖核酸酶抑制劑(目錄號(hào)CS203219)。使用非本試劑盒組分其他溶液，應(yīng)確保不含脫氧核糖核酸酶或者核糖核酸酶。6容器類型表面積細(xì)胞數(shù)RIP裂解緩沖液的體積 (cm2)(L)T-75751.0 x 10750T-2252253.0 x 10715010-cm平板78.51.0 x 1075015

13、-cm平板176.62.3 x 107115I. 裂解產(chǎn)物的配制根據(jù)試驗(yàn)需要刺激或者處理細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的貼壁哺乳動(dòng)物細(xì)胞，密度約為適宜。80-90%全RIP裂解緩沖液的配制表2 完全RIP裂解緩沖液根據(jù)所得細(xì)胞量，配制適量的全RIP裂解緩沖液(請(qǐng)參見表2)。每100L RIP裂解緩沖液，加入0.5L蛋白酶抑制劑混合物和0.25L核糖核酸酶抑制劑，置于冰上待用。對(duì)于單層細(xì)胞或貼壁細(xì)胞：1.用10mL預(yù)冷PBS，洗滌燒瓶或平板上的細(xì)胞兩次。2.加入10mL預(yù)冷PBS。從每個(gè)燒瓶或平板上刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中。如需要，可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.在4下，1500rpm速度

14、離心5分鐘，棄去上清液，以收集細(xì)胞。4.重懸將細(xì)胞沉淀重懸于與等體積的完全RIP裂解緩沖液中。用移液管吹打混合，直至細(xì)胞在混合液分散均勻。將裂解產(chǎn)物置于冰上孵育5分鐘。此步低滲RIP緩沖液使細(xì)胞膨脹。每種裂解產(chǎn)物取約200L，置于不含核酸酶的微量離心管中，貯藏于-80下。通常，每種抗體對(duì)應(yīng)的裂解產(chǎn)物體積一般是100L/RIP，并且實(shí)驗(yàn)中常常包括陽(yáng)性和陰性抗體，因此，單次分裝200L細(xì)胞裂解物是比較適合的。為避免多次凍融，建議將裂解產(chǎn)物按需貯藏。對(duì)于懸浮細(xì)胞：1.在一個(gè)15mL錐形管中收集細(xì)胞。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.4下，1500rpm，離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，。3.在1

15、0mL預(yù)冷的PBS中重懸細(xì)胞并洗滌。4下，1500rpm，離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞。4.重復(fù)第3步，再進(jìn)行一次洗滌。5.在等體積完全RIP裂解緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀。移液管吹打混均。將裂解產(chǎn)物放置在冰上孵育5分鐘。每種裂解產(chǎn)物約取200L，置于不含核酸酶的微量離心管中，貯藏于-80下。通常，每種抗體對(duì)應(yīng)的裂解產(chǎn)物體積一般是100L/RIP，并且實(shí)驗(yàn)中常常包括陽(yáng)性和陰性抗體，因此，單次分裝200L細(xì)胞裂解物是比較適合的。為避免多次凍融，建議將裂解產(chǎn)物按需貯藏。7x 1x NRIP裂解緩沖液100L100 L x =蛋白酶抑制劑混合物0.5L0.5 L x =核糖核酸酶抑制劑0.25L 0.

16、25 L x=對(duì)于組織樣品：1.將新切取的全組織用預(yù)冷的PBS洗滌三次。2.使用杜恩斯勻漿器或其它細(xì)胞分離器械，在預(yù)冷的PBS中分離該組織，直至獲得單細(xì)胞懸浮液。3.4下，1500rpm，離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞。4.在等體積完全RIP裂解緩沖液中重懸細(xì)胞團(tuán)塊的。移液管吹打混均。將裂解產(chǎn)物放置在冰上孵育5分鐘。每種裂解產(chǎn)物約取200L，置于不含核酸酶的微量離心管中，貯藏于-80下。通常，每種抗體對(duì)應(yīng)的裂解產(chǎn)物體積一般是100L/RIP，并且實(shí)驗(yàn)中常常包括陽(yáng)性和陰性抗體，因此，單次分裝200L細(xì)胞裂解物是比較適合的。為避免多次凍融，建議將裂解產(chǎn)需分裝貯藏。重懸注意本方法只凍融一次，以便溫

17、和地裂解細(xì)胞。裂解產(chǎn)物的即時(shí)初次冷凍，對(duì)完全裂解至關(guān)重要。裂解產(chǎn)物可在-80下貯藏3個(gè)月。避免多余的細(xì)胞凍融，以防止蛋白和RNA降解。新鮮分離的細(xì)胞，對(duì)RIP實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。II. 用于免疫沉淀的磁珠配制RIP實(shí)驗(yàn)的成功取決于高質(zhì)量抗體的使用。用于免疫沉淀的抗體用量，取決于其用于免疫沉淀時(shí)候選擇抗體的形式(如純化或非純化)和有效親和力。如使用純化抗體，建議每次免疫沉淀使用5g作為參考，如若使用非MerckMillipore RIPAb+驗(yàn)證抗體，則需要優(yōu)化抗體的使用。建議使用磁力架方便磁珠洗滌操作。為避免引入核糖核酸酶，如有可能，請(qǐng)使用無(wú)核糖核酸酶的無(wú)菌微量移液槍頭。1.通過(guò)顛倒微量離心管

18、或移液管吹打，重懸磁珠至完全分散均勻重懸。2.標(biāo)記用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的適當(dāng)數(shù)量微量離心管。樣品包括目的抗體(用戶自備)，以及與目的抗體同一物種的陰性對(duì)照抗體。當(dāng)使用EZ-Magna RIP(目錄號(hào)17-701)時(shí)，anti-SNRNP70(目錄號(hào)CS203216)和陰性對(duì)照正常家兔IgG(目錄號(hào)PP64B)可用作RIP分析的對(duì)照品。3.量取50L磁珠懸浮液，轉(zhuǎn)移到每個(gè)離心管中。4.在每個(gè)離心管中加入0.5mL RIP洗滌緩沖液，短暫渦旋。5. 離心管磁力架把離心管置于磁力架( 如MerckMillipore，目錄號(hào)20-400)上，磁珠被磁力架吸附在管壁后，棄去上清液。6.從磁力架中取出離心管。

19、在每個(gè)離心管中加入0.5mL RIP洗滌緩沖液，短暫渦旋。87. 把離心管放在磁力架中，棄去上清液。8. 從磁力架中取出離心管，使磁珠重懸于100L RIP洗滌緩沖液中。在離心管中加入約5g目的抗體。9. 室溫下，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30分鐘。10.離心管短暫離心，放在磁力架中，除去上清液。11.從磁力架中取出離心管。在每個(gè)離心管中加入0.5mL RIP洗滌緩沖液，短暫渦旋。12.把離心管放在磁力架中，棄去上清液。13.重復(fù)第11-12步，再進(jìn)行一次洗滌。14.從磁力架中取出離心管。在每個(gè)離心管中加入0.5mL RIP洗滌緩沖液，短暫渦旋。把離心管置于冰上備用。III. RNA結(jié)合蛋白-RNA復(fù)合物免疫共

20、沉淀(RIP)1.配制RIP免疫沉淀緩沖液。每表3 RIP 免疫沉淀緩沖液次免疫沉淀實(shí)驗(yàn)需要900LRIP免疫沉淀緩沖液。每一次反應(yīng)，在860L RIP洗滌緩沖液中加入35L 0.5M EDTA和5L核糖核酸酶抑制劑(如表3)。2.把第II節(jié)第14步所得離心管放在磁力架中，棄去上清液。在每個(gè)離心管中加入900L RIP免疫沉淀緩沖液。3.快速解凍第I節(jié)中所得RIP裂解產(chǎn)物，4下，14,000rpm，離心10分鐘。取100L上清液加至含有磁珠-抗體復(fù)合物的RIP免疫沉淀緩沖液中。免疫沉淀反應(yīng)的最終體積將為1.0mL。4.取RIP裂解產(chǎn)物的上清液10L，置于一個(gè)新的離心管中，標(biāo)記為“input”。

21、把這份input樣品貯藏在-80，直至RNA純化操作(第IV節(jié))。這份10%input 的input將會(huì)用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或用于RT-PCR方法(實(shí)時(shí)或終點(diǎn))的比較。這份input RNA樣品也可用于RNA質(zhì)量評(píng)估(第V節(jié), 可選)。(可選)取RIP裂解產(chǎn)物的10L上清液，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白的表達(dá)。在10L RIP裂解產(chǎn)物中加入10L 2x SDS上樣緩沖液，并在95下加熱。RIP裂解產(chǎn)物可以直接應(yīng)用于SDS。5.將所有離心管放置在旋轉(zhuǎn)器上，4下，孵育3小時(shí)至過(guò)夜。6.短暫離心免疫沉淀反應(yīng)離心管，放在磁力架中，棄去上清液。7.從磁力架中取出離心管。在每個(gè)離心管中加入0.5mL R

22、IP洗滌緩沖液，短暫渦旋。8.把離心管放在磁力架中，棄去上清液。9.重復(fù)五次第7步至第8步操作，用500L預(yù)冷的RIP洗滌緩沖液洗滌磁珠六次。(可選)在最后一次洗滌過(guò)程中，從500L磁珠懸浮液中各取50L，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)免疫沉淀效率。使磁珠重懸于1X SDS上樣緩沖液中，并于95下加熱，以洗脫磁珠上結(jié)合的蛋白。離心沉淀磁珠，上清液可直接用于SDS檢測(cè)。9x 1x NRIP洗滌緩沖液860L 860L x=0.5M EDTA35L35L x=核糖核酸酶抑制劑5L5L x=總計(jì)900L 900L x=IV. RNA的純化表4 蛋白酶K緩沖液1.配制蛋白酶K緩沖液。每次免疫沉淀需要150 L蛋

23、白酶K緩沖液。此緩沖液含有117L RIP洗滌緩沖液、15L 10% SDS和18L 10mg/mL蛋白酶K可通過(guò)加入濃SDS，減少蛋白酶K變性的風(fēng)險(xiǎn)。2. 重懸第III節(jié)第9步免疫沉淀物于150L蛋白酶K緩沖液中。3. 解凍第III節(jié)第4步所得的input樣品，在離心管中加入107L RIP洗滌緩沖液、15L 10%SDS和18L蛋白酶K，定容至總體積150L。4. 使所有離心管置于55下孵育30分鐘，同時(shí)振蕩以充分消化蛋白。5. 孵育后，短暫離心離心管，把離心管放在磁力架上。把上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。6. 在裝有上清液的離心管中，加入250L RIP洗滌緩沖液。注意：在下面的第7步和

24、第8步中，確保在渦旋之前蓋緊離心管的蓋子。7. 在每個(gè)離心管中加入400L苯酚:氯仿: 異戊醇。渦旋15秒，在室溫下，14000rpm，離心10分鐘，以分離各相。8 . 小心取出350L水相，放在一個(gè)新的離心管中。加入400L 氯仿，渦旋15 秒，在室溫下，00rpm，離心10分鐘，以分離各相。9. 小心取出300L水相，放在一個(gè)新離心管中。10.個(gè)離心管中，加入50L鹽溶液I、15L鹽溶液II、5L沉淀增強(qiáng)劑，然后加入850L無(wú)水乙醇。混勻，在-80下保存1小時(shí)至過(guò)夜，以沉淀RNA。11.4下，14,000rpm，離心30分鐘，小心棄去上清液。12.用80%乙醇洗滌沉淀一次。4下，100rp

25、m，離心15分鐘。小心棄去上清液，使沉淀自然風(fēng)干。13.重懸RNA沉淀于不含核糖核酸酶的10-20L水中，將離心管置于冰上備用。input RNA的質(zhì)量評(píng)估(可選)NanoDrop通常情況下，可以采用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定總RNA(或input)的吸光度。理想情況下，A260/A280比值將接近于2.0，表明RNA較純且不含蛋白或化學(xué)品污染。如果這一比值小于1.8，那么可能影響其下游應(yīng)用。由于免疫沉淀物中的RNA含量一般較低，因此不推薦采用NanoDrop分光光度計(jì)品，如若需要，可用于評(píng)估來(lái)自input樣品的RNA質(zhì)量10 x 1x NRIP洗滌緩沖液117L117L x=10% SD

26、S15L15L x=蛋白酶K18L18L x=總計(jì)150L150L x=2.Bioyzer或Experion可以使用Agilent Bioyzer 的納米芯片或Bio-Rads Experion的RNA HighSense芯片，分析免疫沉淀的RNA亞組分的分子布曲線。相較于甲醛-瓊脂糖凝膠，Bioyzer或Experion ，是一種方便且更靈敏的替代方法。對(duì)于 RNA( 或input ) ，評(píng)價(jià)18s/28s rRNA比值有用的。介于1.6-2.0范圍內(nèi)的比值表明RNA具有良好的完整性。但是對(duì)免疫沉淀物質(zhì)，此比值可能無(wú)法獲得，除非已知rRNA是所研究免疫沉淀RNA結(jié)合蛋白的靶標(biāo)。如此，免疫沉淀

27、RNA的生物分析儀圖譜僅用于檢驗(yàn)RNA是否有嚴(yán)重的降解。VI. 免疫沉淀RNA的分析采用Magna RIP試劑盒分離的RNA，兼容多種下游分子分析方法，包括終點(diǎn)RT-PCR和定量RT-PCR，（如果已知RBP的結(jié)合靶標(biāo))，或采用微陣列或深度測(cè)序法。鑒于已知序列的RNA靶標(biāo)，可以設(shè)計(jì)基因特異性引物，驗(yàn)證靶標(biāo)抗體免疫沉淀的RNA。實(shí)驗(yàn)一旦成功，可采用一些方法對(duì)免疫沉中的RNA的分析，例如comparative microarray hybridization of resultingcDNAs or by deep sequencing of molecularly adapted product

28、s of the RIP reaction(詳情請(qǐng)參見Baroni, T.E.et al.(2008)，Methods Mol Biol.419:93-108)。下面列出采用EZ-MagnaRIP試劑盒(目錄號(hào)17-701，anti-SNRNP70目錄號(hào)CS203216)中所供應(yīng)對(duì)照抗體進(jìn)行的RIP實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)或?qū)崟r(shí)定量測(cè)定的方法。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，EZ-Magna RIP試劑盒的用戶可以使用市場(chǎng)上供應(yīng)的使用六聚體隨機(jī)引物的逆轉(zhuǎn)錄酶和試劑盒系統(tǒng)。因?yàn)槌墒斓腢1 snRNA與U1剪接體SNRNP70蛋白共同沉淀不是聚腺苷酸化，所以不推薦寡d(T)引物第一鏈cDNA合成示例(如高容量RNA-to-cDN

29、A試劑盒，ABI目錄號(hào)4387406)注意：在本節(jié)操作中，推薦使用無(wú)核糖核酸酶的耐氣溶膠吸頭，以盡量減少污染風(fēng)險(xiǎn)。1.為待分析的樣品，標(biāo)記適當(dāng)數(shù)量的0.2mL PCR離心管，置于冰上備用。2.在PCR離心管中，加入9L(至多2g RNA)樣品，并放回到冰上備用。3.按照表5，向放置在冰上的每個(gè)PCR反應(yīng)管，加入相應(yīng)的試劑。表5 蛋白酶K緩沖液11試劑1個(gè)反應(yīng)中所需體積(L)RNA9.02X RT緩沖液10.020X酶混合物1.0每次反應(yīng)總計(jì)20.04.把PCR反應(yīng)管放在PCR儀中。5.啟動(dòng)下述RT反應(yīng)程序：6.取出PCR離心管。用180L不含核酸酶的水稀釋反應(yīng)物(10X稀釋)。反應(yīng)物可以在-2

30、0下貯藏。標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)RT-PCR1.為待分析的樣品，標(biāo)記適當(dāng)數(shù)量的0.2mL PCR離心管，并放在冰上保存。至少有4份樣品采用本試劑盒包含的RIP引物進(jìn)行PCR：從陽(yáng)性對(duì)照抗體免疫沉淀中獲得的cDNA、從陰性對(duì)照抗體免疫沉淀中獲得的cDNA、inpDNA和DNA污染的對(duì)照“無(wú)模板” cDNARIP引物對(duì)人類U1 snRNA基因具有特異性。如若cDNA來(lái)自其它物種，推薦用戶設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)奶禺愋砸?，并根?jù)經(jīng)驗(yàn)相應(yīng)的PCR反應(yīng)條件。2.在PCR離心管中，加入2L適當(dāng)?shù)腸DNA樣品，并放回冰上保存。3.如表6所示，在冰上的每個(gè)PCR反應(yīng)管中，加入適量的試劑。首先加入H2O，最后加入Taq聚合酶。推薦用戶使

31、用Hot-Start Taq聚合酶。若未使用Hot-Start Taq聚合酶，必須在初始變性在每個(gè)離心管中加入Taq酶。如果配備主反應(yīng)混合物，要以足夠用于一個(gè)額外反應(yīng)的試劑用量計(jì)算，以彌補(bǔ)在分裝過(guò)程中的損失。表6 PCR試劑體積4.把PCR反應(yīng)管放在PCR儀中。5.啟動(dòng)下述PCR反應(yīng)程序：12 RT反應(yīng)3760分鐘 停止反應(yīng)955分鐘 保持4保持試劑1個(gè)反應(yīng)中所需體積(L)DNA2.0H2O12.610X PCR緩沖液(-MgCl2)2.0MgCl2 (50mM)0.62.5mM dNTP1.6RIP引物，U1 snRNA0.8Taq (5U/L)0.4總共重復(fù)20次。6.取出PCR管。反應(yīng)物

32、可以在-20下貯藏。7.每種PCR反應(yīng)物取10L，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，以100bp DNA Marker作為指示。目錄號(hào)17-701中包含的U1 snRNA的PCR產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)是100個(gè)堿基對(duì)。請(qǐng)參見第12頁(yè)圖A。實(shí)時(shí)定量PCR1.在與您選用的實(shí)時(shí)宣PCR儀兼容的PCR板中，加入2L cDNA樣品(對(duì)每份ChIP樣品，推薦重復(fù)三次qPCR反應(yīng))。2.如表7所示，配制主反應(yīng)混合物要以足夠用于一個(gè)額外反應(yīng)的試劑用量計(jì)算，以彌補(bǔ)在分裝過(guò)程中的損失。3.在2L樣品中，加入23L qPCR混合物。4.使用蓋子或光學(xué)膠帶密封平板，啟動(dòng)qPCR反應(yīng)。表7qPCR試劑設(shè)置和運(yùn)行參數(shù)13 1次反應(yīng)的q

33、PCR試劑組裝：qPCR參數(shù)ddH2O9.5L初始變性 95，10分鐘Sybr-Green主混合物 12.5L變性95,15秒引物混合物1L退火和延伸：60，1分鐘總計(jì)23L總共重復(fù)40次。初始變性943分鐘變性9420秒退火秒6030延伸7230秒最終延伸722分鐘圖A：RIP的PCR分析該RIP實(shí)驗(yàn)以HeLa細(xì)胞裂解產(chǎn)物為樣本，以anti-SNRNP70(目錄號(hào)CS203216)或正常家兔IgG(目錄號(hào).# PP64B)作為免疫沉淀抗體。以純化后的RNA為模板，以U1 snRNA(目錄號(hào)CS203215)特異性RIP引物為引物，進(jìn)行RT-PCR分析。泳道3可見明顯的PCR產(chǎn)物，指示SNRN

34、P70富集U1 snRNA。而泳道2中PCR產(chǎn)物很弱，指示負(fù)對(duì)照正常家兔IgGRIP未富集到U1 snRNA。U1 snRNA特異性cDNA也在10% input(泳道4)中觀察到，但在“無(wú)模板”PCR對(duì)照品(泳道1)中沒(méi)有觀察到。圖B：RIP的PCR分析該RIP實(shí)驗(yàn)以HeLa細(xì)胞裂解產(chǎn)物為樣本，以anti-SNRNP70(目錄號(hào)CS203216)或正常家兔IgG(目錄號(hào).# PP64B)作為免疫沉淀抗體。以純化后的RNA為模板，以U1 snRNA(目錄號(hào)CS203215)特異性RIP引物為引物，進(jìn)行qRT-PCR分析。照(泳道1)中觀察到。14RIP優(yōu)化和故障排除15步驟可能的問(wèn)題實(shí)驗(yàn)建議免

35、疫沉淀抗體無(wú)沉淀RIP裂解產(chǎn)物中的蛋白在RIP分析之前，采用IP蛋白質(zhì)印跡法，確證這種抗體可以使目的RBP免疫沉淀。選擇針對(duì)抗原不同表位的抗體。如有可能，使用MerckMillipore RIPAb+驗(yàn)證抗體。采用固定量的RIP裂解產(chǎn)物，用抗體稀釋系列進(jìn)行免疫沉淀，或反之。將4下目的抗體與RIP裂解產(chǎn)物的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至過(guò)夜。 確證抗體同種型與蛋白A或G的免疫沉淀相容。不推薦這種試劑盒用于IgM或雞IgY抗體。免疫沉淀中的磁珠量不足隨著時(shí)間推移，磁珠沉淀于離心管底部。在取出適當(dāng)體積進(jìn)行免疫沉淀之前，確保磁珠混勻。當(dāng)使用真空抽吸器時(shí)，小心抽取磁珠；使用高強(qiáng)度釹磁力架，如MerckMillipore

36、目錄號(hào)20-400 MagnaGrIP Rack。RNA純化蛋白酶K消化不完全當(dāng)進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí)，確保溫度設(shè)置為約55。高于65溫度長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)會(huì)使蛋白酶K滅活。較差的A260/A280比當(dāng)采用苯酚:氯仿和氯仿提取DNA時(shí)，避免中間相。在Bioyzer或Experion儀器上，檢測(cè)裂解產(chǎn)物input中提取的RNA，評(píng)估其中是否存在核糖核酸酶。較低RNA產(chǎn)率大多數(shù)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)量的RNA。但是采用RT- PCR，可以檢測(cè)到低于毫微克量的RNA。如果在cDNA合成后沒(méi)有檢測(cè)到RNA，考慮上述免疫沉淀故障原因。RNA降解參考本方案的推薦在溶液中使用核糖核酸酶抑制劑。不得引入核糖

37、核酸酶，確保工作環(huán)境中不含核糖核酸酶，。方案實(shí)施時(shí)，遵照核糖核酸酶對(duì)照品指南。使用核糖核酸酶滅活試劑，以確保工作區(qū)和物料不含核糖核酸酶。RNA純化沒(méi)有檢測(cè)到任何RNA延長(zhǎng)-80下乙醇沉淀的培養(yǎng)時(shí)間。有時(shí)，RNA乙醇沉淀物非常少。當(dāng)取出上清液時(shí)，確保沒(méi)有吸取RNA沉淀物。在RIP分析之前，采用IP-蛋白質(zhì)印跡法，確證這種抗體可以使目的RBP免疫沉淀。參考文獻(xiàn)1.Baroni, T.E., Chittur, S.V., Ge Mol Biol. 419:93-108.e, A.D., Tenenbaum, S.A. (2008). Methods2.Keene, J.D., Komisarow, J.M., Friedersdorf, M.B. (2006). Nat Protoc. 1(1):302-7.3.Baroni, T.E., Lastro, M