分子生物學(xué)-DNA的復(fù)制

1、第五章 DNA的復(fù)制(DNA Replication )DNA復(fù)制 親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ)配對(duì)的游離的dNTP，合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過(guò)程。復(fù)制子(Replicon，復(fù)制單位或復(fù)制元) DNA中含有一定復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)的復(fù)制單位。 復(fù)制子的長(zhǎng)度大小不均，1.3萬(wàn)90萬(wàn)bp不等。DNA的半保留復(fù)制（Semi-Conservation Replication） 概念： 復(fù)制過(guò)程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模板合成其互補(bǔ)鏈，新生的互補(bǔ)鏈與母鏈構(gòu)成子代DNA分子 。理論上DNA的復(fù)制也可采用其

2、它方式，如叫全保留復(fù)制(conservative replication)和分散模型（dispersive model）的復(fù)制方式也是可能的。第一節(jié)半保留復(fù)制的驗(yàn)證 半保留模型（semioconservetive model） 全保留復(fù)制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。驗(yàn)證半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)一、Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn) 二、Taylar實(shí)驗(yàn) 三、姐妹染色單體差別染色方法（sister- chromatid differential staining）5溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，簡(jiǎn)稱(chēng)BUdR） 斑色染

3、色體（Harlequin chromosome） 四、Cairns復(fù)制模型型復(fù)制 圖11-4 Taylor 蠶豆根尖放射自顯影實(shí)驗(yàn)。(a)按半保留復(fù)制預(yù)期DNA在復(fù)制過(guò)程中標(biāo)記情況；(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶和蛋白一、快停突變與慢停突變快停突變：把細(xì)菌培養(yǎng)溫度提高（42 45）復(fù)制迅速停止。快停突變所涉及的產(chǎn)物和鏈的延伸有關(guān)慢停突變：將細(xì)菌培養(yǎng)溫度提高，DNA合成并不立即停下來(lái)，延續(xù)一段時(shí)間后合成才會(huì)停止。慢停突變表明突變的基因和復(fù)制起始有關(guān)。篩選出與DNA合成、延伸有關(guān)的蛋白和酶。二、復(fù)制的酶系統(tǒng)（一）DNA聚合酶1.DNA聚合酶的共同特點(diǎn)（1）需要提供合

4、成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引 物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外還有其它功能。 表11-1 E.coli 中的三種DNA多聚酶 DNApolDNApol DNA pol 結(jié)構(gòu)分子量 109 KD90 KD900 KD構(gòu)成 單體單體異多聚體分子數(shù)/細(xì)胞 400？10-20酶活性：5 3聚合酶 +35外切酶 +53外切酶 +(可切單鏈)突變體突變位點(diǎn)pol Apol BpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突變表型修復(fù)有缺陷能修復(fù)阻止復(fù)制復(fù)制的特異性（復(fù)制的忠實(shí)性）：(1)合成前（presynthetic）錯(cuò)誤控制：能夠通過(guò)

5、匹配的化學(xué)特點(diǎn)加以識(shí)別，檢查進(jìn)入的堿基是否和模板互補(bǔ)，這是一種合成前的預(yù)防措施。(2)校正（proofreading）控制：在新的堿基加到鏈上以后，來(lái)檢查堿基是否配對(duì)。發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，會(huì)把剛加上去的錯(cuò)誤堿基切除。2.DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：(1) 模板結(jié)合位點(diǎn)；(2) 引物結(jié)合位點(diǎn)；(3) 引物3OH結(jié)合位點(diǎn)；(4) 底物dNTP結(jié)合位點(diǎn)；(5) 53外切酶結(jié)合位點(diǎn)；(6) 35校正位點(diǎn)。 3、DNA聚合酶的功能 特點(diǎn)：主要用于DNA的修復(fù)和后隨鏈中RNA引物的置換。使用的模板范圍較寬（1）有引物的ssDNA（線狀或環(huán)狀）。（2）有缺口的dsDNA（無(wú)論大?。?；（3）有

6、切口（nick）的雙鏈DNA。 1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)鏈的置換； (3)模板轉(zhuǎn)換（template-switching） 4. 內(nèi)切酶活性4、DNA多聚酶的結(jié)構(gòu)DNA pol 全酶在DNA上的裝配分為三個(gè)階段：（1）一個(gè)二聚體加上一個(gè)復(fù)合體識(shí)別引 物模板形成一種前起始復(fù)合物。（2）DNA在于,復(fù)合體結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象 發(fā)生改變，而對(duì)核心酶產(chǎn)生了高親和。 使核心酶能與DNA結(jié)合。（3）二聚體結(jié)合核心聚合酶，使其二聚化。（二） DNA連接酶 其作用機(jī)制是分三步進(jìn)行：1、EATPEAMPppi 在E.col

7、i中， ENADEAMPNMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5-PO4上使其活化3、活化的5PO4與相鄰的3OH作用形成35 磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。（三） 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白（single strand binding protein,SSB）又稱(chēng)為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helix destabilizing protein）由177個(gè)aa組成在E.coli 中以四聚存在分子量為74KDa ，每個(gè)分子可以覆蓋32nt在原核中SSB與DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個(gè)SSB和DNA的結(jié)合改變了DNA的結(jié)構(gòu)。（四）解旋酶(helic

8、ase)(五）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是可以切斷DNA鏈又能重新連接DNA的一種酶。 可以分為兩類(lèi)：型拓?fù)洚悩?gòu)酶 型拓?fù)洚悩?gòu)酶第三節(jié)復(fù)制的起點(diǎn)、方向和終點(diǎn) 一. 研究方法： 1 用同位素標(biāo)記電鏡觀察2. 用噬菌體插入標(biāo)記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法（denaturation mapping） 4. 雙向電泳法不同步培養(yǎng)時(shí)各標(biāo)記的拷貝數(shù)不同,復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記的拷貝數(shù)應(yīng)最多二、不同生物復(fù)制起點(diǎn)和方向 E.coli定點(diǎn)、雙向?qū)ΨQ(chēng)復(fù)制。 T7在近一端的17處開(kāi)始，向兩端延伸。 真核有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（i），雙向等速?gòu)?fù)制。 枯草桿菌有固定的起始點(diǎn)，雙向不對(duì)稱(chēng)復(fù)

9、制。 質(zhì)粒R6K早期為單向復(fù)制，復(fù)制了約1/5時(shí)基因 組進(jìn)行雙向復(fù)制。 質(zhì)粒Col E1有固定起始點(diǎn)，但卻為單向復(fù)制。 mt DNA進(jìn)行D（displaced loop）環(huán)復(fù)制 D環(huán)復(fù)制三、原核生物，噬菌體和病毒的復(fù)制起始和終止(一).環(huán)狀DNA的復(fù)制:1、雙鏈DNA的復(fù)制E.coli復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：（1）富含AT，這可能和雙鏈易于解開(kāi)起始復(fù)制有關(guān)；（2）含有多個(gè)回文結(jié)構(gòu)（914個(gè)GATC）8個(gè)GATC較保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3）具有 4個(gè)重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；（4）此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個(gè)起動(dòng)子，其可能的作用是：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物；產(chǎn)生復(fù)制必要的蛋白；產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的

10、RNA；起轉(zhuǎn)錄激活作用。復(fù)制起始的簡(jiǎn)單步驟：1、轉(zhuǎn)錄激活：在起始區(qū)雙鏈必須打開(kāi)一小段，這主要是依賴(lài)RNA聚合酶在附近的轉(zhuǎn)錄，將雙鏈打開(kāi)，這種作用就叫做轉(zhuǎn)錄激活。2、雙鏈解開(kāi)的這一點(diǎn)延著DNA向邊延伸擴(kuò)大，產(chǎn)生復(fù)制叉。3、開(kāi)始合成引物。4、引物合成后，DNApol組裝都引發(fā)的RNA上，完成復(fù)制體的組裝。2、單鏈DNA的復(fù)制：1968年Gilbert提出滾環(huán)復(fù)制模型:（1）共價(jià)延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈 分開(kāi);（3）不需RNA引物，在正 鏈3OH上延（4）只有一個(gè)復(fù)制叉;（5）形成多聯(lián)體（concatemer ）; 滾環(huán)復(fù)制的電鏡照片 哪些DNA進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制?真核rDNA的擴(kuò)增,F因子DNA的

11、轉(zhuǎn)移,裂解途經(jīng)的復(fù)制, X174,M13.G4等單鏈環(huán)狀DNA噬 菌體 第二階段復(fù)制都是進(jìn) 行滾環(huán)復(fù)制的.（二）線狀DNA復(fù)制DNA末端起始復(fù)制DNA中間起始復(fù)制DNA中間起始復(fù)制DNA末端起始復(fù)制線性雙鏈DNA的復(fù)制有的是從一端開(kāi)始的: 腺病毒（Adenovirus） 29 DNAs 脊髓灰質(zhì)病毒（poliovirus)腺病毒DNA全長(zhǎng)35937 bp,線性雙鏈，兩端各有反向重復(fù)順序103162 bp，兩末端各有50 bp為復(fù)制起點(diǎn)。其復(fù)制是以單鏈置換（strand displacement）形成一個(gè)大的莖環(huán)或叫平鍋形結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行的。（三）復(fù)制的終止1.E.coli的復(fù)制終止(環(huán)狀DNA復(fù)制終

12、止)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)終止區(qū)域（terE,D,A和ter F,C,B），位于相遇點(diǎn)的另一側(cè)100Kb處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿?dòng)的復(fù)制叉來(lái)說(shuō)是特異的。ter順序有一個(gè)23bp的區(qū)域，在體外可導(dǎo)致復(fù)制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要tus(terminus utilization substance)基因的產(chǎn)物Tus(36kD)， Tus能識(shí)別ter保守順序，并阻止復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)。ter-Tus復(fù)合物可能通過(guò)抑制螺旋酶來(lái)實(shí)行終止2.線性DNA的復(fù)制終止 兩個(gè)5有空缺的分子通過(guò)3端凸出的重復(fù)序列互補(bǔ)配對(duì)。 DNA多聚酶從3端延伸填補(bǔ)起這個(gè)空缺，留下最后的裂隙由連接酶封閉，產(chǎn)生了一個(gè)大分子

13、串聯(lián)體。 由限制酶在連接處交錯(cuò)切割，產(chǎn)生3 凹端，由DNA多聚酶在3-OH上延伸填滿新的空缺，產(chǎn)生兩條完整的雙鏈。 第四節(jié) 復(fù)制的過(guò)程 1、岡崎片段 任何一種DNA聚合酶合成方向都是從5向3方向延伸，而DNA模板鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械碾p鏈，這樣在一條鏈上，DNA合成方向和復(fù)制移動(dòng)方向相同（前導(dǎo)鏈），而在另一條模板上卻是相反的（后滯鏈）。那么在復(fù)制叉中新鏈?zhǔn)侨绾魏铣傻哪兀恳?、半不連續(xù)復(fù)制 Reiji Okazaki在DNA合成實(shí)驗(yàn)中添加放射性的脫氧核苷酸前體觀察到前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，滯后鏈分段合成。這些分段合成的新生DNA片段稱(chēng)岡崎片段。細(xì)菌岡崎片段長(zhǎng)度1000-2000核苷酸，真核生物岡崎片段長(zhǎng)度100-

14、200核苷酸。岡崎實(shí)驗(yàn) （1）脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（pulse-labeling experiment） 以E.coli為材料，在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入同位素3H標(biāo)記的dTTP，經(jīng)30秒后，DNA剛開(kāi)始復(fù)制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開(kāi)，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來(lái)確定片段的大小，再檢測(cè)放射標(biāo)記，結(jié)果表明被3H標(biāo)記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長(zhǎng)10002000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大2050倍。 （2）脈沖追逐實(shí)驗(yàn) 早期合成的DNA片段以后的命運(yùn)又是如何的？是依然如舊的短片段，還是連接成了長(zhǎng)片段。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是先進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)3

15、0秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測(cè)結(jié)果。先合成的（帶標(biāo)記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉淀系數(shù)為70S120S較長(zhǎng)的片段，這意味著剛開(kāi)始合成的片段都是短片段，以后再連接成長(zhǎng)片段，人們就把最初合成的短片段稱(chēng)為岡崎片段（Okazaki fragment）。 細(xì)胞內(nèi)都存在有dTTP和dUTP，而DNApol卻并不能區(qū)分它們，因此也會(huì)將dUTP加入到DNA中，形成AU對(duì)。那么在DNA中為什么沒(méi)有U的存在呢？這是因?yàn)镋.coli細(xì)胞里有雙重“保險(xiǎn)”，防止了U的“混入”。第一道關(guān)是細(xì)胞里的dUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合

16、成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。 第二道關(guān)是尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無(wú)Pu和Py位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺口，進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。在細(xì)胞內(nèi)尿嘧啶N-糖苷酶作用較快，而AP酶作用較慢，在新鏈合成之初約1200bp就有可能摻進(jìn)一個(gè)U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切斷糖苷鍵，在AP酶未作用前在脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中就提取了，用NaOH沉淀時(shí)，AP位點(diǎn)十分易斷裂，所以前導(dǎo)鏈也成了小片段。 E.colidUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為D

17、NA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無(wú)Pu和Py位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺口，進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)(1)在dut -突變體（dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut +中短。這是因?yàn)閁摻入機(jī)會(huì)增加；(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)因?yàn)槟蜞奏-糖苷酶缺失，不會(huì)切除U的糖苷鏈，也就不會(huì)出現(xiàn)AP位點(diǎn)，所以堿沉淀時(shí)不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。在dut-

18、, ung-雙突變體中，結(jié)果和實(shí)驗(yàn)（2）相同，更進(jìn)一步證實(shí)了此推測(cè)。2、復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程的特征： 1、DNA的聚合反應(yīng)是以dNTP為底物，以帶有引物的DNA為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則在3-OH上加一個(gè)dNTP2、 需要二價(jià)正離子如Mg2+，由引物提供的3-OH作親本進(jìn)攻形成磷酸二酯鍵 3、鏈沿5到3方向延長(zhǎng)4、堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，若錯(cuò)配則被先切除掉5、反應(yīng)具有進(jìn)行性， DNA聚合酶從DNA上解離下來(lái)前可催化多次反應(yīng)3、鏈的延伸鏈的合成方向和復(fù)制叉移動(dòng)方向相同的是前導(dǎo)鏈，相反的是后隨鏈。前導(dǎo)鏈連續(xù)延伸，后隨鏈合成較為復(fù)雜。雙螺旋復(fù)制是同時(shí)復(fù)制的：每一個(gè)復(fù)制叉含有特別大的多聚體復(fù)合體，它是一個(gè)不對(duì)稱(chēng)

19、的二聚體，可能同時(shí)催化兩條鏈。在電鏡下觀察到雙螺旋DNA聚合酶也同樣具有兩個(gè)活性部位 復(fù)制體（replisome）：是由解旋酶、引發(fā)酶和DNA Pol 全酶組成的復(fù)合體。4、復(fù)制體和回環(huán)模型回環(huán)模型： DNA合成時(shí)，沿著復(fù)制叉的方向移動(dòng)。后隨鏈模板形成了一個(gè)回環(huán)，使環(huán)中RNA引物和岡崎片段的合成方向與前導(dǎo)鏈一致，以適應(yīng)雙鏈在同一復(fù)制體上進(jìn)行復(fù)制。特點(diǎn)：聚合酶和引發(fā)體聯(lián)系在一起可以協(xié)調(diào)它們的作用；復(fù)制體中的DNA Pol 是二聚體；后隨鏈?zhǔn)切纬苫丨h(huán)復(fù)制的。 二、真核生物的復(fù)制、真核生物聚合酶和有關(guān)蛋白、真核生物復(fù)制特點(diǎn)基因組中有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn) 一般要等第一輪復(fù)制結(jié)束后第二輪才開(kāi)始。 真核的復(fù)制起點(diǎn)

20、到兩邊的復(fù)制終點(diǎn)稱(chēng)為一個(gè)復(fù)制子（replicon）或一個(gè)復(fù)制單位（replicationunite）。DNA開(kāi)始合成的位置，一個(gè)初始起點(diǎn)(或者雙向復(fù)制起點(diǎn)-大多數(shù)起點(diǎn)是雙向的)，兩側(cè)有一些二級(jí)起點(diǎn)。初始起點(diǎn)經(jīng)常是0.5-2kbp長(zhǎng)，而二級(jí)起點(diǎn)可跨越50kbp，因此稱(chēng)為起始地帶(initiation zone) 真核和原核復(fù)制子的大小是非常相似的，但復(fù)制的速率真核要比原核慢得多真核的復(fù)制起始點(diǎn)的數(shù)目和復(fù)制單位的大小是隨著細(xì)胞的特點(diǎn)變化而改變的，如不同的生長(zhǎng)速率的細(xì)胞和不同組織的細(xì)胞。 并非所有的復(fù)制子都同時(shí)進(jìn)行DNA復(fù)制。而是有一定的起始時(shí)間順序。不同類(lèi)型的細(xì)胞復(fù)制起始的順序也不同。在不同的發(fā)育

21、時(shí)期，真核的復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制子的大小是會(huì)改變的，有些復(fù)制起點(diǎn)在有的發(fā)育階段就不再發(fā)揮作用 真核的復(fù)制起始區(qū)的順序稱(chēng)為自主復(fù)制順序 真核DNA復(fù)制時(shí)DNA聚合酶有五種()，原核只有三種。 真核細(xì)胞內(nèi)DNA引物酶和pol緊密偶聯(lián)，而在原核細(xì)胞內(nèi)引發(fā)酶是和解旋酶偶聯(lián)一起，形成復(fù)制體的一部分。 、真核生物復(fù)制起始區(qū)結(jié)構(gòu)(1)T蛋白具有解鏈酶活性，通過(guò)水解ATP解開(kāi)雙鏈，RF-A立即和單鏈結(jié)合，使之穩(wěn)定；(2)復(fù)制叉移動(dòng)一段距離，pol-引物酶復(fù)合物結(jié)合到復(fù)制區(qū)，合成第一段RNA引物；(3)RF-C結(jié)合到引物上，使pol合成第一條岡崎片段；(4)到前導(dǎo)鏈和后滯鏈的分界區(qū)，pol從單鏈上解下來(lái)，再結(jié)合到新的

22、復(fù)制叉處合成后滯鏈。(5)pol，RF-C和PCNA結(jié)合到前導(dǎo)鏈的第一條岡崎片段3端開(kāi)始合成前導(dǎo)鏈。(6) SV40的復(fù)制可能也形成復(fù)制體，后滯鏈形成回環(huán) 酵母的自主復(fù)制區(qū)ARS(autonomously replicationg sequence)發(fā)揮復(fù)制起點(diǎn)的功能，但是過(guò)量的。酵母染色體的著絲粒附近為ARS1序列ARS1分為A,B,C三個(gè)功能區(qū), A,B起主要作用,C起次要作用。A區(qū)為15bp,其中11個(gè)保守，稱(chēng)ACS (ARS consensus sequence)。有復(fù)制起始子的功能B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個(gè)功能區(qū)。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）結(jié)合區(qū)。酵母的復(fù)制ORC：由6個(gè)亞基組成相當(dāng)于Dna A和 的O蛋白，與 A/B1結(jié)合，結(jié)合于游離的DNA Cdc6:相當(dāng)于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白結(jié)合到復(fù)合體上。此對(duì)在Origin上起始復(fù)制是必須的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合于B3三、原核和真核生物復(fù)制體系比較E.coli SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB Dn