生物信息學(xué)16s分析測(cè)序1

1、16s16S rRNA是編碼原核生物核糖體小亞基的，長(zhǎng)度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最常用和最有用的標(biāo)志。其序列包含可變區(qū)（Variable region）和保守區(qū)（constant region）?？勺儏^(qū)序列因細(xì)菌而異，且變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，通過(guò)提取環(huán)境樣品的DNA，并擴(kuò)增和檢測(cè)其中的一段或幾段區(qū)域，可以了解環(huán)境樣品(土壤、腸道、海洋)中細(xì)菌的種類和豐度。OTU (operational taxonomic units)如果序列之間，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè) OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的1

2、6S rRNA序列，也就是每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的細(xì)菌（微生物）種。通過(guò) OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。區(qū)域由于16s rDNA較長(zhǎng)（1.5kb），考慮到序。16s的讀長(zhǎng)限制，只能對(duì)可變區(qū)進(jìn)rDNA包含有9個(gè)可變區(qū)，分別是v1-v9。一般我們對(duì)v3，v3-v4和v6可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和。主要內(nèi)容QIIME安裝數(shù)據(jù)處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制樣品復(fù)雜度分析 (Alpha diversity)多樣品比較分析 (Beta diversity)系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建其他分析Qiime的安裝()Qiime的安裝電腦為什么安裝不了？Linux常見(jiàn)命令c

3、dpwdmkdir/touchlscpmvrmzip/tarhistorywgetshutdown/reboot切換到目錄顯示當(dāng)前目錄完整路徑新建目錄/文件查看文件與目錄文件移動(dòng)文件、目錄或更名刪除文件或目錄解壓縮文件查看歷史命令命令行的關(guān)機(jī)/重啟工具主要內(nèi)容QIIME安裝數(shù)據(jù)處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制樣品復(fù)雜度分析 (Alpha diversity)多樣品比較分析 (Beta diversity)系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建其他分析FASTQ數(shù)據(jù)EBI ( SRA ()樣品信息文件 (map.txt)1.第一列必須是#S應(yīng)該是唯一的。leID，為可區(qū)分的數(shù)字，字母或 。每一

4、行的這個(gè)值2.3.4.第二列必須為BarcodeSequence。每一行的這個(gè)值應(yīng)該是唯一的。第三列必須為L(zhǎng)inkrimerSequence，為擴(kuò)增樣品的引物。后面的列可以根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以描述，但是每一列必須包含至少兩個(gè)值，就是指定樣品信息，就可以在這個(gè)位置設(shè)置了。最后一列必須是Description。每一個(gè)樣品不一樣的地方，必須不一樣額。5.#SleIDBarcodeSequenceDescriptionLinkrimerSequenleTypeSRR1370913AGCTGACTAGTCGTGCCAGCMGCCGCGGTAAtumorSRR1370913SRR1370914AGCTGAC

5、TAGTGGTGCCAGCMGCCGCGGTAAtumorSRR1370914SRR1370915AGCTGACTAGTAGTGCCAGCMGCCGCGGTAAnormalSRR1370915SRR1370920AGCTGACTAGTTGTGCCAGCMGCCGCGGTAAnormalSRR1370920join_paired_ends.py (fastq-join)過(guò)濾 (split_libraries_fastq.py)convert to fastaRead too short after quality truncation N charactersOTU分析與注釋-pick_open

6、_reference_otus.pypick_otus.py從fasta文件中提取OTUs，提取方法有cd-hit，blast，Mothur，usearch。make_otu_table.py將提取出的OTUs制作成out_table，即.biom文件。assign_taxonomy.py使用reference中的reference_seqs和 taxonomy文件對(duì)序列分類。biom add-metadata將taxa數(shù)據(jù)加入到.biom文件。Venn圖Heatmap圖主要內(nèi)容QIIME安裝數(shù)據(jù)處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制樣品復(fù)雜度分析 (Alpha dive

7、rsity)多樣品比較分析 (Beta diversity)系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建其他分析core_diversity_yses.pysingle_rarefaction.py-Rarify the OTU tablebeta_diversity.pybeta多樣性principal_coordinates.pyPCoA圖形化alpha_diversity.pyAlpha多樣性make_rarefaction_plots.py稀釋曲線summarize_taxa.py-Summarize Taxonomyplot_taxa_summary.py-Taxa summary plotsAlpha多樣性（樣本

8、內(nèi)多樣性）Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量指標(biāo)有Chao1 豐富度估計(jì)量（Chao1 richnessestimator） 、多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）、多樣性指數(shù)（Simpson diversity index）等。計(jì)算菌群豐度：Chao；計(jì)算菌群多樣性：Shannon、Simpson。Chao1 豐富度估計(jì)量Chao1：是用chao1 算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，chao1 在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，由Chao (1984)最早提出。Chao1值越大代表物種總數(shù)越多。計(jì)算公式：Schao1=Sobs+n1(n1-

9、1)/2(n2+1)和多樣性指數(shù)Shannon-Wiener 曲線，是利用shannon指數(shù)來(lái)進(jìn)行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的量在不同深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。 當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。Simpson：用來(lái)估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量的描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。R-Abundance曲線同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。橫坐標(biāo)代表物種排序的數(shù) 量；縱坐標(biāo)代表觀測(cè)到的 相對(duì)豐度。物種的豐富程 度

10、由曲線在橫軸上的長(zhǎng)度 來(lái)反映，曲線越寬，表示 物種的組成越豐富；物種 組成的均勻程度由曲線的 形狀來(lái)反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度 越高。而曲線快速陡然下 降表明樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群 所占比例很高，多樣性較 低。Beta多樣性分析（樣品間差異分析）Beta多樣性是生態(tài)系之間的種多樣性，它包含分的比較生態(tài)系內(nèi)的每一獨(dú)特性。即衡量群落之類間的差別。Beta多樣性不僅描述生境內(nèi)生物種類的數(shù)量，同時(shí)也考慮到這些種類的相同性及其彼此之間的位置。不同生境間或某一生態(tài)梯度上不同地段間生物種類的相似性越差，Beta生物多樣性越高。PCoA(主坐標(biāo)分析)PCoA分析，即主坐標(biāo)分析（PCoA，Princip

11、alCoordinateysis）可以從復(fù)雜的度數(shù)據(jù)中提取和可視化展示主要的高信息量突變,與PCA的主要類似。它將距離矩陣的信息轉(zhuǎn)變成在一系列直交軸中顯示，這樣某種變量的最大值體現(xiàn)在第一個(gè)成分坐標(biāo)中，而另一種變量的最大值體現(xiàn)在另一個(gè)成分坐標(biāo)上。距離越近的點(diǎn)代表樣本間相似應(yīng)該聚在一起。高，理論上生物學(xué)重復(fù)的樣本unweighted unifrac對(duì)于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所有枝,考查其指向的葉節(jié)點(diǎn)是否只存于同一個(gè)群落,那些葉節(jié)點(diǎn)只存在于同一群落的枝的枝長(zhǎng)和,占整個(gè)樹(shù)的枝長(zhǎng)和的比例,就定義為UniFrac距離。UniFrac計(jì)算了僅被一個(gè)群落占據(jù)的進(jìn)化歷史的相對(duì)大小,這個(gè)量越大,說(shuō)明兩個(gè)群落中獨(dú)立的進(jìn)化過(guò)程越

12、多,也就說(shuō)明這兩個(gè)群落的差別越大。若兩個(gè)群落完全相同,那么它們沒(méi)有各自獨(dú)立的進(jìn)化過(guò)程,UniFrac值為0;若兩個(gè)群落在進(jìn)化樹(shù)中完全分開(kāi),即它們是完全獨(dú)立的兩個(gè)進(jìn)化過(guò)程,那么UniFrac值為1.weighted unifracUniFrac的定義中,可以看出它只考慮序列是否在群落中出現(xiàn),而不考慮序列的豐度。若兩個(gè)群落包含的物種完全相同,那么不管每個(gè)物種的豐度是否有差別或者差別的大小，UniFrac值為0。但在某些具體的情況下,的恰恰是群落中物種豐度的變化,例如研研究者感腸道微生物分布在抗生素治療下的變化情況,這究時(shí)UniFrac就不能解決問(wèn)題了。weighted unifrac方法,就是在U

13、niFrac的基礎(chǔ)上,將序列的豐度納入考慮,它能夠區(qū)分物種豐度的差別。主要內(nèi)容QIIME安裝數(shù)據(jù)處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制樣品復(fù)雜度分析 (Alpha diversity)多樣品比較分析 (Beta diversity)系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建其他分析系統(tǒng)樹(shù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（英文：phylogenetic tree或 evolutionary tree）是表明被認(rèn)為具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹(shù)，又被稱為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、系統(tǒng) 演化樹(shù)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、種系發(fā)生樹(shù)、演化樹(shù)、進(jìn)化樹(shù)、系統(tǒng)樹(shù)。 它用來(lái)表示系統(tǒng)發(fā)生研究的結(jié)果，用它描述物種之間的進(jìn)化關(guān)系。構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)主要步驟filter_otus_from_otu_table.py挑選豐度1的OTUfilter_fasta.py獲得豐度1OTU的fasta文件make_phylogeny.py構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)ggtree.R系統(tǒng)樹(shù)可視化系統(tǒng)樹(shù)系統(tǒng)樹(shù)差異OTU分析;OTUbaseMea nlog2Fo ldChan gespvaluepadjtaxonomy17876444