嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)檢測規(guī)程完整

1、嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1、目的為了規(guī)親和柱凈化樣本中嘔吐毒素的操作流程，特制訂本操作規(guī)程2、圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于糧食、飼料、食品中嘔吐毒素的檢測。3、檢出限和定量限項(xiàng)目島津安捷倫樣本檢出限(pg/kg)樣本定量限(pg/kg)樣本檢出限(yg/kg)樣本定量限(pg/kg)DON12.9636.721515034、_職責(zé)部門名稱部門職責(zé)質(zhì)量管理部1、負(fù)責(zé)本制度的實(shí)施。2、負(fù)責(zé)本制度的監(jiān)督執(zhí)行。5、程序5.1原理測定的基礎(chǔ)是抗原、抗體反應(yīng)，抗體連接在柱體，樣品經(jīng)過提取、過濾后，緩慢的通過嘔吐毒素免疫親和柱，在免疫親和柱毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他無關(guān)物質(zhì)。用中醇洗脫嘔吐毒素，然

2、后注入到分析儀器中用于檢測。5.2溶液配制PBS緩沖液:稱取&0g氯化鈉，l2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL蒸鐳水或去離子水溶解，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0,再用蒸憎水或去離子水定容至1L。上述PBS緩沖液用于樣品的提取、稀釋，以及親和柱的清洗。5.2.2嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液：先用色譜級(jí)中醇將高標(biāo)稀釋到5ppm,再用水將其稀釋到lppm,此時(shí)標(biāo)品的溶劑為20%中醇，然后再用20%HJ醇將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋到500ppb、200ppb、lOOppbx50ppb。5.3樣品前處理玉米、小麥、面粉、配合飼料、濃縮料、精補(bǔ)料等吸水性較小的樣本將樣品粉碎，稱取25g樣品，加入5g

3、聚乙二醇，加入125mL蒸鐳水：高速均質(zhì)(10,000r/min)lmin(或用搖床200r/min300r/min居lj烈振蕩20min)；-用快速定性濾紙過濾，收集濾液；-濾液再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；取25mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù)：25.3.2隸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性較強(qiáng)的樣本一稱取10g樣品，加入1OOmL蒸憎水；高速均質(zhì)（10,000r/min）lmin（或用搖床200r/min300r/min劇烈振蕩20min）；-用快速定性濾紙過濾，收集濾液；-濾液再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；取5mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù)：25.3

4、.3酒類-取脫氣的酒類樣品（含二氧化碳的酒類樣品，使用前先攪拌或超聲脫氣）或不含二氧化碳的酒類樣品25g,用PBS緩沖液定容至100mL；高速均質(zhì)（10,000r/min）lmin（或用搖床200r/min一300r/min劇烈振蕩20min）；-用快速定性濾紙過濾，收集濾液；-濾液再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；取2mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù)：25.3.4醬油、醋、醬及醬制品取樣品25g，用PBS緩沖液定容至lOOmL；高速均質(zhì)（10,000r/min）lmin（或用搖床200r/min300r/min劇烈振蕩20min）；-用快速定性濾紙過濾，收集濾液；-濾液再用微纖維

5、濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；-取2mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù)：25.4凈化取出免疫親和柱，將上方塞子取出斜剪斷，再插回親和（3mL的免疫親和柱去掉上方塞子，安裝上轉(zhuǎn)接頭，將轉(zhuǎn)接頭另一端與注射器固定后使用）-將柱子與氣控操作架上的注射器連接固定，取適量處理后的洛液上樣；-去掉親和柱下方堵頭，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以12滴/秒的速度流出；待液體排干后，方法5.3.1中的樣品用蒸鐳水或去離子水洗滌2次，每次10mL,其余樣品首先用O.l%Tween-2O水溶液洗滌10mL，再用蒸鐳水或去離子水洗滌10mL,流速23滴/秒；待液體排干后，上樣ImL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脫液并在5060C加

6、熱條件下N2氣吹干，然后用ImL流動(dòng)相（20%屮醇）復(fù)溶；復(fù)溶液用022pm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中用于HPLC分析。*每次上樣前都要將上次液體完全排干。5.5液相測定5.5.1液相色譜條件C18柱：250mm（長）x4.6mm（直徑），填料粒徑5pm；流動(dòng)相：20%甲醇流速:1.0mL/min；柱溫：40C；進(jìn)樣體積：50pL紫外檢測器：218nm5.5.2色譜定量分別取相同體積樣液和標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣本中嘔葉毒素的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣中嘔吐毒素的濃度，標(biāo)準(zhǔn)品色譜

7、圖參考下圖：IQO0ClmV附圖：DON-SOOppb標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜CON60CdejUOHpigDON50go使用前，免疫親和柱需回至室溫（2225C）。注意事項(xiàng)親和柱28C儲(chǔ)存，不得凍存。-不要使用過了有效日期的免疫親和柱。-取樣量：根據(jù)需要可以適當(dāng)增加或減少取樣量，注意提取液量要相應(yīng)改變。柱容量：2000ng，當(dāng)樣本中待檢毒素的含量除以稀釋倍數(shù)高于柱容量時(shí)，需要適當(dāng)降低上樣液的體積，重新檢測。-pH：親和柱的上樣溶液pH需在68之間，若偏離此圍需要用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。由于樣本中嘔吐毒素的含量普遍較高，如果計(jì)算后樣本含量大于4mg/kg時(shí)，表示已經(jīng)超過親和柱柱容量，需要適當(dāng)降低上樣液的體積，重新檢測。-上機(jī)檢測時(shí)的溶劑與流動(dòng)相保持致可以消除洛劑效應(yīng)的影響。-嘔吐毒素可致癌，應(yīng)戴手套操作。-使用過的容器及標(biāo)準(zhǔn)品溶液最好用次氯酸鈉溶液（5%V/V）浸泡過夜。6、相關(guān)文件免疫親和柱檢驗(yàn)