氣道上皮細(xì)胞屏障對免疫應(yīng)答的調(diào)控

1、氣道上皮細(xì)胞屏障對免疫應(yīng)答的調(diào)控翻譯：冼明海 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高州市人民醫(yī)院郝 星 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院審校：郝 星 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院周榮華 四川大學(xué)華西醫(yī)院摘要氣道內(nèi)的細(xì)胞群落在維持肺部免疫穩(wěn)態(tài)方面起著協(xié)同作用，并使我們在呼吸時免受空氣中病原體和污染物的侵害。氣道上皮細(xì)胞除了具有結(jié)構(gòu)特性，可以有效地清除下呼吸道的粘膜纖毛外，還具有免疫活性，可以感知氣道環(huán)境的變化并與免疫細(xì)胞發(fā)生相互作用。單細(xì)胞RNA測序揭示了氣道壁中存在的細(xì)胞異質(zhì)性，并鑒定出具有獨特分子特征，分化軌跡和在健康與疾病中具有多種功能的新型細(xì)胞群。在這篇綜述中，我們討論了隨著細(xì)胞表型轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的發(fā)展，我們對氣

2、道上皮結(jié)構(gòu)功能的看法是如何演變的，并重點關(guān)注上皮與局部神經(jīng)元和免疫系統(tǒng)的相互作用。前言目前，公認(rèn)的是，氣道內(nèi)的細(xì)胞不僅僅是構(gòu)成外部環(huán)境與下層間充質(zhì)之間的屏障。這些特殊的上皮細(xì)胞集合對克服粘膜纖毛屏障的微生物和有害刺激做出反應(yīng)，是宿主防御的重要組成部分，與免疫系統(tǒng)細(xì)胞相互作用，以維持穩(wěn)態(tài)，并在必要時促進(jìn)免疫反應(yīng)。呼吸道上皮細(xì)胞還必須對吸入環(huán)境中所含的多種毒素做出反應(yīng)，并且越來越多的證據(jù)表明上皮功能障礙是影響多種肺部慢性疾病的驅(qū)動因素。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，上皮細(xì)胞由基底細(xì)胞與分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞緊密結(jié)合而成，形成一個緊密的單元，既維持物理屏障，又能通過免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子對吸入的環(huán)境作出反應(yīng)。但是，隨著先

3、進(jìn)測序技術(shù)的出現(xiàn)，這種觀點已轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N動態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中包含了多種高度專業(yè)化的細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠?qū)Νh(huán)境變化做出反應(yīng)，與常駐微生物群落相互作用，并與其他多種專業(yè)化細(xì)胞系統(tǒng)合作，例如免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。呼吸道是一個復(fù)雜的器官系統(tǒng)，分為上呼吸道，包括鼻腔，咽，喉；下呼吸道包括傳導(dǎo)氣道（氣管，支氣管和細(xì)支氣管）和呼吸區(qū)（呼吸性細(xì)支氣管和肺泡）（圖1）。每個區(qū)域都有特定的功能，細(xì)胞組成的區(qū)域差異反映了這一點。從鼻腔到肺泡的整個呼吸道都有特定的上皮細(xì)胞群。精細(xì)的電子顯微鏡研究為人類氣道中主要上皮細(xì)胞類型的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)提供了早期的認(rèn)識。除了使用經(jīng)典的電子顯微鏡定義的形態(tài)學(xué)特征外，細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)

4、免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)用于表型和量化整個呼吸道中的上皮細(xì)胞群，從而確定解剖位置對細(xì)胞組成的影響。呼吸道由纖毛和分泌細(xì)胞排列組成，主要用于促進(jìn)黏膜纖毛清除空氣中的顆粒物和感染源。像其他粘膜表面一樣，氣道上皮與環(huán)境直接接觸，因此對宿主防御至關(guān)重要。盡管與腸道粘膜具有相同的胚胎起源，但氣道粘膜表面的免疫學(xué)活性必然是獨特的，并受環(huán)境條件（溫度梯度、雙向氣流），常駐微生物群落和空氣中抗原差異的影響。盡管不是本綜述的重點，但位于肺遠(yuǎn)端肺泡區(qū)域的上皮細(xì)胞在表型和功能上也是不同的。肺泡上皮1型（AT1）細(xì)胞為氣體交換提供了特定的表面，而2型（AT2）細(xì)胞分泌了肺表面活性物質(zhì)，以防止呼氣時肺泡塌陷。在每個解剖部位

5、中，都有祖細(xì)胞群，例如氣道中的基底細(xì)胞和肺泡中的AT2細(xì)胞，這些細(xì)胞群可維持穩(wěn)態(tài)條件和損傷后上皮細(xì)胞的再生。圖1 |修訂后的scRNA-seq捕獲的人氣道上皮細(xì)胞庫。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）改變了人們對呼吸道上皮細(xì)胞的傳統(tǒng)觀點，包括上呼吸道和下呼吸道的上皮細(xì)胞。修訂后的具有新鑒定的細(xì)胞類型，例如離子細(xì)胞和不同的細(xì)胞狀態(tài)。氣道內(nèi)的細(xì)胞組成和細(xì)胞狀態(tài)是根據(jù)解剖位置（近遠(yuǎn)軸）和疾病存在有否而變化的。根據(jù)肺段的不同，用于獲取人體樣本進(jìn)行測序的方法也有所不同。采集人氣道上皮細(xì)胞的主要方法是在支氣管鏡檢查期間進(jìn)行支氣管灌洗和支氣管內(nèi)活檢，這與通過手術(shù)活檢或外植體獲得的肺實質(zhì)組織采集肺泡區(qū)域相

6、反。 BAL，支氣管肺泡灌洗。新型測序技術(shù)的出現(xiàn)不僅促進(jìn)了新型細(xì)胞類型的鑒定，而且揭示了先前命名但知之甚少的細(xì)胞類型（例如簇/刷細(xì)胞）的潛在功能。也有跡象表明存在異質(zhì)細(xì)胞類型和狀態(tài)，并且其細(xì)微變化將受到環(huán)境變化的影響，例如，吸煙或暴露于過敏原或污染物?，F(xiàn)在清楚的是，氣道壁代表著一個動態(tài)的上皮細(xì)胞“群落”，與常駐的免疫細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一個整體的單元，在維持粘膜免疫穩(wěn)態(tài)以及促進(jìn)宿主防御吸入病原體方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這篇綜述中，我們概述了如何使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來繪制氣道上皮的特征，以及其如何突出了新型特異上皮細(xì)胞的功能，以及它們?nèi)绾闻c免疫和神經(jīng)元系統(tǒng)細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)氣道免疫。繪制氣

7、道上皮特征單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）改變了我們對氣道上皮的認(rèn)識，揭示了一定程度的細(xì)胞多樣性，而這種多樣性在顯微鏡觀察下尚未證實。這項技術(shù)可描述單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，因此有助于對異質(zhì)細(xì)胞群中不同細(xì)胞亞群的無偏特性進(jìn)行描述，推動對既往未鑒定的細(xì)胞類型和狀態(tài)的新發(fā)現(xiàn)。人類細(xì)胞圖譜協(xié)會的目標(biāo)是通過整合空間數(shù)據(jù)，以單細(xì)胞分辨率全面繪制健康和疾病狀態(tài)下的肺細(xì)胞組成和分子表型變化。此外，利用已知的配體-受體相互作用，也可以計算出氣道壁中上皮-免疫的相互作用。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究人類上皮細(xì)胞生物學(xué)依賴于肺組織的可獲取性。一項針對人體的最早研究分析了特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者的病變外植體實質(zhì)肺組織和

8、不適合移植的供體的肺葉作為對照組織。對于人類氣道上皮的研究，可以通過在常規(guī)臨床護(hù)理的范圍內(nèi)進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查來獲取疾病狀態(tài)下的支氣管刷和支氣管內(nèi)活檢樣本。值得注意的是，細(xì)胞含量因所使用的采樣方法而異，這將影響通過scRNA-seq所獲得的細(xì)胞簇（圖2）。獲取年齡匹配的健康對照樣本更具挑戰(zhàn)性，因為這需要研究志愿者接受侵入性手術(shù)。只有通過臨床醫(yī)生和科學(xué)家之間的密切合作以及通過人體組織生物庫，才能獲得合適的人體肺組織。重要的是，需要仔細(xì)考慮樣本運輸?shù)膶嶋H情況，因為組織的低溫保存和從診所中采集新鮮樣本到實驗室處理的最短的時間延遲對于確保高質(zhì)量的scRNA-seq數(shù)據(jù)至關(guān)重要。冷缺血72h后，多種類型

9、的肺細(xì)胞由于細(xì)胞應(yīng)激或死亡，導(dǎo)致線粒體計數(shù)增加，且CD4+和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞特異性比例下降。組織用膠原酶的酶解作用被廣泛用于分離用于scRNA-seq研究的細(xì)胞，但需要注意的是，它可以誘導(dǎo)早期基因的表達(dá)，包括Fos和Jun以及熱休克蛋白（HSP）基因的亞群。因此也可能在單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫中引入一些重要的人為因素和潛在偏差。在scRNA-seq分析過程中，共享相似基因表達(dá)譜的細(xì)胞聚集在一起，并可根據(jù)已知的標(biāo)記基因進(jìn)行注釋(表1)。在第一個對哺乳動物氣道的單細(xì)胞研究中，發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞簇，它不與任何先前已知的上皮細(xì)胞類型相對應(yīng)，根據(jù)其基因表達(dá)特征，被稱為“肺離子細(xì)胞”。這個新細(xì)胞類型的發(fā)現(xiàn)

10、凸顯了scRNA-seq的強大作用（表1,2）。 集群下的亞群可用于識別特定細(xì)胞類型簇內(nèi)的不同細(xì)胞狀態(tài)。在氣-液平面培養(yǎng)物中分化的人鼻上皮細(xì)胞進(jìn)行的單細(xì)胞分析顯示，表達(dá)FOXJ1的多纖毛細(xì)胞前體亞群稱為“體細(xì)胞”，其表達(dá)特定基因，包括DEUP1（也稱為CCDC67），F(xiàn)OXN4和CDC20B，這些對于中心粒細(xì)胞擴(kuò)增和纖毛生成至關(guān)重要。還可通過scRNA-seq在健康的人類呼吸道中鑒定出氘核細(xì)胞。在人類氣道中，通過差異標(biāo)記基因表達(dá)的基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞之間細(xì)微但不同的分子狀態(tài)已經(jīng)被描述。杯狀細(xì)胞根據(jù)其獨特表達(dá)的基因可分為兩個亞群；例如，鼻上皮中的“杯狀2”細(xì)胞具有與免疫細(xì)胞募集有關(guān)基因的

11、較高表達(dá)，例如CXCL10，IL19和CSF3。呼吸道細(xì)胞群的解剖學(xué)起源在控制其轉(zhuǎn)錄特征和細(xì)胞狀態(tài)中起著重要作用。一項對取自健康受試者四個不同解剖部位的毛刷和活組織切片的單細(xì)胞研究，顯示了鼻腔和氣管支氣管腔室之間上基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞的區(qū)域特定亞群。同一類型細(xì)胞之間基因表達(dá)譜的空間變化部分與特定氣道位置所需的生物學(xué)功能有關(guān)。鼻上皮細(xì)胞中的分泌細(xì)胞富含與細(xì)胞運動、分化和感覺通路相關(guān)的基因集，而在支氣管樹中，它們富含與先天免疫和傷口愈合應(yīng)答通路相關(guān)的基因。值得注意的是，由于基因表達(dá)特征的重疊性，在單細(xì)胞研究中對分泌細(xì)胞類型(包括球狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞)的注釋不一致。圖2 |氣道的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)

12、研究。對于下呼吸道的人類單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)研究，采用支氣管鏡獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)、氣道壁刷檢和支氣管內(nèi)活檢。起始物質(zhì)決定被測序的氣道免疫細(xì)胞，上皮細(xì)胞和基底細(xì)胞的相對貢獻(xiàn)。通過灌洗和活檢的酶解獲得可行的單細(xì)胞懸液。生物信息學(xué)管道通過降維和可視化技術(shù)（例如統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）生成獨特的細(xì)胞簇，并有助于基于細(xì)胞標(biāo)記基因的簇群注釋。在健康和疾病中可以確定新的細(xì)胞簇和細(xì)胞狀態(tài)，并且可以使用軌跡分析來研究動態(tài)的、分化的細(xì)胞類型。通過收集比較健康志愿者的細(xì)胞與呼吸系統(tǒng)疾病患者的細(xì)胞，進(jìn)一步揭示了氣道上皮細(xì)胞狀態(tài)的決定因素。對輕中度哮喘患者的氣道壁進(jìn)行活檢分析后，發(fā)現(xiàn)

13、了健康氣道中未發(fā)現(xiàn)的幾種細(xì)胞狀態(tài)。共同表達(dá)纖毛細(xì)胞的基因標(biāo)記物，包括FOXJ1和杯狀細(xì)胞基因（如MUC5AC），被稱為“粘液纖毛細(xì)胞”，并被認(rèn)為代表哮喘中IL-4/IL-13信號驅(qū)動的新型過渡細(xì)胞狀態(tài)。一項對IPF（一種進(jìn)行性疤痕形成性肺病）患者的實質(zhì)肺組織的單細(xì)胞分析在纖維化遠(yuǎn)端肺組織發(fā)現(xiàn)了以前未知的、轉(zhuǎn)錄獨特的細(xì)胞簇，這些細(xì)胞表達(dá)出部分的氣道基底細(xì)胞標(biāo)志物。這些有趣的“異常基底”細(xì)胞，即KRT5-KRT17 +，共同表達(dá)編碼間質(zhì)標(biāo)志物的基因，如膠原1型1鏈(COL1A1)，轉(zhuǎn)錄因子SOX9(在遠(yuǎn)端氣道發(fā)育中起作用)和與IPF發(fā)病相關(guān)的基因，包括編碼基質(zhì)溶素的MMP7。肺上皮細(xì)胞是一個動態(tài)的

14、細(xì)胞群落，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在連續(xù)的分化過程中捕獲了處于不同階段的細(xì)胞的獨特功能。這一特征首次被用來闡明小鼠肺泡發(fā)育四個不同階段的上皮譜系層次。隨著scRNA-seq生物信息學(xué)方法的改進(jìn)，研究人類樣品中的細(xì)胞命運并揭示人類氣道上皮細(xì)胞分化的微妙之處已成為可能?？梢酝ㄟ^軌跡推斷算法在計算上利用伴隨著每個細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄變化，該算法根據(jù)細(xì)胞沿其各自軌跡的進(jìn)展對細(xì)胞進(jìn)行排序，并以“偽時間”進(jìn)行量化。氣液界面培養(yǎng)中鼻氣道上皮細(xì)胞的偽時間分析表明，杯狀細(xì)胞可以作為纖毛細(xì)胞的前體，并且在這種分化軌跡的背景下可以發(fā)現(xiàn)FOXJ1 + MUC5AC +細(xì)胞。此外，利用每個基因的未剪接和剪接的mRNA的相對豐度，有可能

15、估計基因表達(dá)變化的速率，稱為“RNA速度”，并預(yù)測未來的細(xì)胞狀態(tài)。利用擴(kuò)散圖方法對細(xì)胞進(jìn)行偽時間排序，在小鼠氣道中發(fā)現(xiàn)了一種有趣的表達(dá)krt13的細(xì)胞群，它們是球狀細(xì)胞分化的基礎(chǔ)。移行細(xì)胞排列成離散的、分層的、高周轉(zhuǎn)率的結(jié)構(gòu)，稱為“小丘”，表達(dá)與鱗狀上皮分化、細(xì)胞粘附和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。scRNA-seq在細(xì)胞水平上繪制的全面轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息提高了我們對穩(wěn)定狀態(tài)下氣道上皮的認(rèn)識。該技術(shù)也已被用于研究COVID19重癥患者的氣道樣本，以便更全面的了解急性呼吸系統(tǒng)冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染的發(fā)病機制。從人類細(xì)胞圖譜協(xié)會整理的數(shù)據(jù)集中研究多種組織類型中的單細(xì)胞基因表達(dá)，與SARSCoV2

16、細(xì)胞進(jìn)入相關(guān)的基因，即編碼病毒進(jìn)入受體的ACE2和TMPRSS2，顯著富集于鼻分泌和纖毛上皮細(xì)胞中。值得注意的是，包括角膜、結(jié)膜、小腸和結(jié)腸在內(nèi)的其他粘膜表面細(xì)胞中ACE2的高表達(dá)可能與鼻腔的高表達(dá)相結(jié)合，解釋了SARS-CoV-2的高傳播性。這說明了如何利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)來進(jìn)一步了解新出現(xiàn)疾病的發(fā)病機制。罕見上皮細(xì)胞類型的功能基底細(xì)胞是多能干細(xì)胞，占所有氣道上皮細(xì)胞的三分之一，并在上皮屏障的穩(wěn)態(tài)維持和損傷應(yīng)答的再生過程中產(chǎn)生其他主要亞群，例如分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞?；准?xì)胞錨定在傳導(dǎo)氣道的基底膜上，并表達(dá)角蛋白5（KRT5）和轉(zhuǎn)錄因子腫瘤蛋白p63（TP63）。譜系追蹤和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄研究表明，氣道中存在

17、不同功能的基礎(chǔ)細(xì)胞亞群。上呼吸道和下呼吸道存在兩種離散的基底細(xì)胞狀態(tài)，但在上呼吸道的基底細(xì)胞頻率較低。這些細(xì)胞狀態(tài)反映了基底細(xì)胞不同的分化階段，與未成熟的基底細(xì)胞相比，成熟的基底細(xì)胞（位于更頂端的區(qū)域）表達(dá)的TP63和NPPC水平更低。Deprez等人將TP63表達(dá)較低、KRT19和NOTCH3表達(dá)較高的基底細(xì)胞注釋為“基底上”細(xì)胞。除這些主要細(xì)胞類型外，通過詳細(xì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，還發(fā)現(xiàn)了一些罕見的細(xì)胞群，它們的數(shù)量少于人類氣道上皮細(xì)胞總數(shù)的1。盡管不常見，但這些細(xì)胞似乎具有非常獨特的表型，并執(zhí)行特定的作業(yè)，對上皮結(jié)構(gòu)和功能的有效運作和維護(hù)至關(guān)重要。表1 ：未回答的問題單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域為

18、人類氣道中存在的細(xì)胞群落提供了一種變革性的高清視圖，但也為研究界帶來了許多未解決的問題。 當(dāng)代單細(xì)胞景觀中的細(xì)胞如何反映傳統(tǒng)顯微鏡檢測到的細(xì)胞？從單細(xì)胞scRNA測序獲得到的數(shù)據(jù)完善了我們對既往描述的氣道細(xì)胞類型（例如簇細(xì)胞）的表征，并導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了一個先前未描述的細(xì)胞“離子細(xì)胞”。1994年的電子顯微鏡研究報告了“不確定類型的細(xì)胞”，并且在最近的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中仍然存在未定義的細(xì)胞簇。因此，未來的工作必須集中于更好地研究這些細(xì)胞類型，以及確定它們在健康和疾病期間在氣道壁內(nèi)的空間關(guān)系。 我們應(yīng)該在多大程度上重視發(fā)現(xiàn)豐度低的細(xì)胞簇或特定細(xì)胞類型的亞簇?除了通過免疫熒光顯微鏡確認(rèn)特定細(xì)胞類型的存在外，為

19、了真正帶來重力和生物學(xué)意義，還需要通過實驗證明功能上的差異。接下來的挑戰(zhàn)是在人類健康和疾病的背景下解釋這些發(fā)現(xiàn)。 我們?nèi)绾谓忉屔贁?shù)研究對象中，人類樣本與細(xì)胞團(tuán)簇之間固有的生物學(xué)變異性？一種提供更大透明度的方法是顯示單個受試者的細(xì)胞組成和集群，以及那些被疾病整合的細(xì)胞。 我們?nèi)绾握{(diào)整細(xì)胞識別分配的差異？在定義特定細(xì)胞類型的特定陽性和陰性標(biāo)記基因上必須達(dá)成共識，因為在細(xì)胞類型和亞群的注釋上存在差異。任何新的分類方案都應(yīng)考慮到氣道細(xì)胞解剖來源的一致性和確定性。 細(xì)胞圖譜繪制傳統(tǒng)上依賴于實驗小鼠的使用，但目前各種計算工具允許從人類單細(xì)胞數(shù)據(jù)推斷細(xì)胞軌跡。據(jù)報道，基底細(xì)胞與罕見細(xì)胞類型（簇細(xì)胞，肺神經(jīng)內(nèi)

20、分泌細(xì)胞和離子細(xì)胞）之間的譜系關(guān)系存在差異，這可能反映了所研究的物種（小鼠與人類），使用的模型和/或軌跡算法，但也強調(diào)了在人類樣本中進(jìn)一步驗證的必要性。丘樣細(xì)胞（Hillock cells）scRNA-seq的出現(xiàn)使研究人員能夠研究細(xì)胞發(fā)育的軌跡。除了基底細(xì)胞，棒狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞之間的聯(lián)系外，Montoro等人還定義了一種獨特的軌跡，通過特異表達(dá)Krt13和Krt4的新型過渡細(xì)胞將氣管基底細(xì)胞和棒狀細(xì)胞連接起來。通過觀察這些細(xì)胞在肺部中的位置以及在小鼠體內(nèi)中的譜系追蹤，作者注意到Krt13 +細(xì)胞位于不包含管腔纖毛細(xì)胞的連續(xù)分層細(xì)胞群中。他們將這些分組稱為“小丘”，一種由位于Trp63 + K

21、rt13 +基底細(xì)胞頂部的管腔Scgb1a1 + Krt13 +細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，其中Trp63的表達(dá)沿著基底細(xì)胞上的梯度分布。重要的是，小丘包含大量的循環(huán)細(xì)胞，并表達(dá)了細(xì)胞粘附和上皮分化的標(biāo)志物，以及與屏障功能和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因。Plasschaert等人的研究證實鼠氣管和離體分化的人基底上皮細(xì)胞中存在著一個獨特的Krt13 + Krt4 +細(xì)胞群體，盡管他們得出的結(jié)論是，這個群體代表之間的一個中間人口基底干細(xì)胞和分化細(xì)胞腔的分泌細(xì)胞。此外，Krt13+Krt4+表達(dá)細(xì)胞在多酚誘導(dǎo)的小鼠氣管上皮損傷后1天出現(xiàn)。在人類中，KRT13通過“循環(huán)”基底細(xì)胞亞群在氣道上皮中表達(dá)，其特征是表達(dá)與細(xì)胞增

22、殖相關(guān)的基因，包括MKI67（編碼Ki67）。需要進(jìn)一步的分析來確認(rèn)小丘是否代表了一個真正獨特的生態(tài)位而不是過渡中的化生帶，并確定它們的起源和目的。實際上，尚不清楚這些結(jié)構(gòu)是否存在于整個氣道中或局限于氣管。為了證明它們的存在，Deprez等人描述了一群KRT13 +細(xì)胞，其中很大一部分在鼻甲中循環(huán)，這表明丘樣細(xì)胞可能存在于人類呼吸道的其他區(qū)域。表2：小鼠氣道上皮的生態(tài)模型本綜述的重點是人類氣道的上皮特征。然而，我們對上皮細(xì)胞功能及其與免疫細(xì)胞相互作用的大部分認(rèn)識是來自實驗室小鼠的實驗研究。正因如此，我們強調(diào)了小鼠和人類氣道之間細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)的近-遠(yuǎn)端變化以及差異。在小鼠中，基底細(xì)胞主要局限于氣

23、管和近端支氣管，而在人類中，基底細(xì)胞則遍布整個氣道。在人類中，分泌粘液的杯狀細(xì)胞是近端氣道中最豐富的分泌細(xì)胞類型，但在成年小鼠中，這些細(xì)胞相對較少，而棒狀細(xì)胞占主導(dǎo)地位。粘膜下腺位于管腔表面下方，并分泌粘液和其他抗菌因子到氣道中，但也充當(dāng)含有肌上皮基底細(xì)胞的干細(xì)胞環(huán)境。在小鼠中，粘膜下腺位于喉和氣道近端，但在人類中，它們分布在整個軟骨氣道。小鼠氣管的假復(fù)層纖毛上皮類似于整個人氣道中發(fā)現(xiàn)的纖毛。因此，有人認(rèn)為這可能是研究可翻譯人類氣道上皮細(xì)胞生物學(xué)的一個相關(guān)的領(lǐng)域。為了支持這一概念，在人類氣道的研究中已經(jīng)概括了小鼠氣管上皮細(xì)胞的一些單細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，包括肺離子細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。除氣管外，小鼠氣道上皮轉(zhuǎn)變?yōu)橛?/p>

24、纖毛、分泌(球狀)和肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞簇組成的簡單柱狀上皮，從而模擬了人類最遠(yuǎn)端氣道的組成。小鼠模型是生物醫(yī)學(xué)研究必不可少的工具，徹底改變了我們對免疫學(xué)的認(rèn)識。但是，值得注意的是，小鼠和人類免疫系統(tǒng)之間存在重要差異。小鼠生活環(huán)境的差異，特別是微生物接觸史，對其免疫細(xì)胞庫有深遠(yuǎn)的影響。例如，與成年人類或?qū)櫸锸笙啾龋谔囟ǖ臒o病原體環(huán)境中飼養(yǎng)的實驗室小鼠缺乏分化的記憶CD8+ T細(xì)胞亞群。這些關(guān)鍵的環(huán)境差異深刻影響了肺部免疫系統(tǒng)的發(fā)展，繼而影響了與局部上皮組織的相互作用。簇狀細(xì)胞（Tuft cells）呼吸道包含幾組化學(xué)感覺上皮細(xì)胞，它們協(xié)調(diào)與外部環(huán)境的相互作腸內(nèi)分泌細(xì)胞和簇狀細(xì)胞（也稱為“刷狀”細(xì)

25、胞）。這些化學(xué)感覺上皮細(xì)胞與味覺細(xì)胞有相似性，預(yù)計會引起免疫細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的陽性和陰性反應(yīng)。它們具有獨特的形態(tài)，呈瓶狀，頂端有微絨毛，并在腸道和呼吸道在內(nèi)的多種器官中表達(dá)。它們存在于腸道中，被認(rèn)為是由飲食代謝產(chǎn)物如琥珀酸和細(xì)菌產(chǎn)物(例如，群體感應(yīng)內(nèi)酯或脫氫氨基酸)觸發(fā)的。相比之下，它們在肺中的作用還不確定，但已在鼻子，氣管和近端氣道中被發(fā)現(xiàn)，并與神經(jīng)纖維緊密接觸，介導(dǎo)神經(jīng)元和免疫途徑之間的通信。但是，它們不是普遍可識別的。實際上，Vieira Braga等人在使用支氣管灌洗和支氣管內(nèi)活檢對人類氣道進(jìn)行scRNA-seq分析時，無法識別出一種獨特的簇狀細(xì)胞群。這可能反映了這些細(xì)胞的罕見性，也許

26、反映了用于收集氣道樣本的方法。簇狀細(xì)胞表達(dá)一系列指示性標(biāo)記物，包括POU結(jié)構(gòu)，2類，轉(zhuǎn)錄因子3（POU2F3），它被認(rèn)為是簇狀細(xì)胞特異性的譜系定義轉(zhuǎn)錄因子，以及瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員5（TRPM5）。目前，scRNA-seq已識別出兩個終末分化階段的Trpm5 +簇狀細(xì)胞群；一個對Gng13呈陽性，可能負(fù)責(zé)“味覺”的感知，另一個對Alox5ap呈陽性，表明它有助于白三烯的合成。簇狀細(xì)胞被認(rèn)為可以通過ATP傳感器P2Y2生成半胱氨酸白三烯。盡管通常以少量存在，但通過激活半胱氨酰白三烯途徑吸入常見的空氣變應(yīng)原后，氣管中的簇狀細(xì)胞會發(fā)生擴(kuò)增。內(nèi)源性生成的白三烯E4通過CysLT3R感知，

27、調(diào)節(jié)小鼠氣道刷狀細(xì)胞的數(shù)量和功能。因此，簇狀細(xì)胞能夠通過不同受體的組合表達(dá)來響應(yīng)多種信號。簇狀細(xì)胞被認(rèn)為能促進(jìn)保護(hù)性呼吸反射，例如打噴嚏，但也可導(dǎo)致呼吸暫停以及粘膜的局部神經(jīng)源性炎癥。鑒于簇狀細(xì)胞的分布和功能，也被稱為“孤立的化學(xué)感覺細(xì)胞”，增強局部神經(jīng)元系統(tǒng)提供的化學(xué)反應(yīng)性保護(hù)。scRNA-seq分析顯示小鼠簇狀細(xì)胞表達(dá)高水平的膽堿能和苦味信號轉(zhuǎn)錄物(Tas2r108, Gnat3, Trpm5)。用 2 型苦味受體(TAS2R)配體地那銨或喹諾酮類假單胞菌群體感應(yīng)分子刺激氣管叢細(xì)胞釋放乙酰膽堿，增加 TRPM5 和 M3 毒蕈堿乙酰膽堿介導(dǎo)的粘膜纖毛清除率及纖毛細(xì)胞的鈣釋放。據(jù)推測，從革蘭

28、氏陰性致病菌中檢測到這些群體感應(yīng)分子可提供一種機制，通過該機制上皮細(xì)胞可觸發(fā)辣椒素敏感性神經(jīng)纖維，釋放降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和P物質(zhì)，從而促進(jìn)先天免疫級聯(lián)反應(yīng)和微血管漏出，還可以抵抗細(xì)菌入侵，從而限制了能夠形成破壞性生物膜的種群密度。具有簇狀細(xì)胞特性的孤立性化學(xué)感應(yīng)細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)是患有鼻息肉的慢性鼻竇炎患者中IL25的主要上皮來源，其有助于II型固有淋巴細(xì)胞（ILC2s）的活化和IL13的產(chǎn)生，從而維持上呼吸道II型環(huán)境。簇狀細(xì)胞一旦激活，便可以釋放神經(jīng)遞質(zhì)（例如乙酰膽堿），參與白三烯和前列腺素生物合成的二十烷類化合物和ATP，以及細(xì)胞因子，如IL-25和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)。

29、所有這些介體均與過敏性炎癥有關(guān)，能夠通過表達(dá)特定受體誘導(dǎo)ILC2活化和累積。離子細(xì)胞（Ionocytes）對小鼠氣管上皮細(xì)胞和分化的人類氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一個新的細(xì)胞簇，稱為“肺離子細(xì)胞”，這是由于其基因表達(dá)譜與非洲爪蟾幼蟲皮膚粘膜纖毛上皮的離子轉(zhuǎn)運細(xì)胞相似。與非洲爪蟾一樣，離子細(xì)胞表達(dá)編碼V-ATPase質(zhì)子泵亞基基因，該亞基調(diào)節(jié)離子運輸和pH值。確定小鼠和人上皮細(xì)胞離子細(xì)胞譜系的關(guān)鍵因素是FOXI1，它屬于轉(zhuǎn)錄因子的子家族。在基因敲除小鼠和人類細(xì)胞培養(yǎng)物中的慢病毒研究表明，F(xiàn)OXI1調(diào)節(jié)CFTR基因的表達(dá)，該基因編碼一種關(guān)鍵的氯離子轉(zhuǎn)運體，在囊性纖維化中有缺陷或缺失

30、。囊性纖維化是一種致命性疾病，其特征是粘液粘度增加，粘膜纖毛清除能力受損，慢性感染和氣道炎癥，最終導(dǎo)致肺功能喪失。離子細(xì)胞僅占人類氣道上皮細(xì)胞的1-2，但CFTR mRNA的富集程度高于其他任何類型的氣道細(xì)胞。將scRNA-seq與傳統(tǒng)的在三個不同時間點的體內(nèi)譜系追蹤結(jié)合在一起的“脈沖序列”技術(shù)表明，基底細(xì)胞是離子細(xì)胞和其他罕見細(xì)胞類型的主要來源。鑒于scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的罕見細(xì)胞類型，Goldfarbmuren等人進(jìn)一步研究了人類氣管基底細(xì)胞中CRISPR-Cas9敲除系統(tǒng)中的罕見細(xì)胞譜系關(guān)系，以確定在分化過程中，離子細(xì)胞和肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(PNECs)來自于POU2F3+簇狀細(xì)胞。肺

31、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞PNECs是位于氣管、支氣管和細(xì)支氣管表面上皮內(nèi)的孤立細(xì)胞。它們也可以在肺內(nèi)氣道中以神經(jīng)內(nèi)分泌體的形式存在。PNEC作為氣道的化學(xué)傳感器，對氧氣、拉伸和化學(xué)刺激的變化作出反應(yīng)。它們是引起免疫和生理效應(yīng)的神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)的豐富來源。PNECs是唯一受神經(jīng)支配的跨物種保守的氣道上皮細(xì)胞類型，僅占肺上皮細(xì)胞總數(shù)的1%。據(jù)報道，它們是在發(fā)育過程中形成于肺上皮的最早的特殊細(xì)胞類型，并且被認(rèn)為在早期生命中具有特別重要的功能，因為缺乏PNECs的新生小鼠可以免受過敏性炎癥的影響。體外分析預(yù)測PNECs在一系列活動中的作用，包括氧感應(yīng)、維持支氣管和血管平滑肌張力以及協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)。然而，一系列突變

32、小鼠的實驗證實了PNECs的功能特性影響了一系列肺部疾病。PNECs的一個決定性特征標(biāo)記是基因Ascl1，它是PNECs形成所必需的轉(zhuǎn)錄因子。缺乏Ascl1的小鼠在出生時死亡，但一種旨在使PNEC前體中的Ascl1失活的條件性敲除后可使完全缺乏PNEC的小鼠存活，表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞中缺乏CGRP+細(xì)胞。這些Ascl1突變小鼠在基線檢查時是正常的，但在圍產(chǎn)期暴露于過敏原時，可以防止發(fā)生嚴(yán)重杯狀細(xì)胞增生和II型炎癥反應(yīng)。PNECs的缺失伴隨著關(guān)鍵神經(jīng)肽的減少，包括神經(jīng)遞質(zhì)GABA?；騬oundaboud（ROBO）的表達(dá)對于PNECs聚集到神經(jīng)內(nèi)分泌體、限制免疫細(xì)胞浸潤以及在出生后肺發(fā)育期間防止

33、肺泡發(fā)育不良均至關(guān)重要。盡管在Robo缺失的小鼠中PNEC在E15.5缺陷明顯，但生理效應(yīng)僅發(fā)生在出生后，這表明PNEC的效應(yīng)依賴于第一次呼吸時對空氣的物理暴露，從而進(jìn)一步證實PNEC是吸入環(huán)境變化的傳感器的觀點。相比之下，在成年小鼠中基因消融PNECs對氣道內(nèi)穩(wěn)態(tài)或化學(xué)損傷后的修復(fù)沒有影響。在早期小鼠模型中，PNEC通過神經(jīng)營養(yǎng)素4調(diào)節(jié)PNEC的神經(jīng)支配和GABA的分泌促進(jìn)Muc5ac的表達(dá)，從而促進(jìn)過敏原暴露期間的粘液高分泌。PNEC是靈長類動物肺和人類上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中GABA的唯一來源。PNECs也與氣道中的ILC2s密切相關(guān)，并通過CGRP進(jìn)行通訊，使IL-5和GABA的ILC表達(dá)最

34、大化，從而誘導(dǎo)粘液生成。在新生兒和成人過敏性炎癥模型中，杯狀細(xì)胞增生絕對需要GABA的產(chǎn)生，而在II型炎癥中不需要。重要的是，這些發(fā)現(xiàn)反映在人類身上，過敏性哮喘患者PNECs的CGRP+亞群數(shù)量增加。PNEC數(shù)量異常與多種肺部疾病有關(guān)，包括罕見的遺傳性疾病，如先天性膈疝和小細(xì)胞肺癌，以及一些常見病，如哮喘，表明這些細(xì)胞在生理和免疫途徑中的關(guān)鍵作用，這些途徑對肺在體內(nèi)平衡中發(fā)揮有效功能至關(guān)重要。氣道上皮細(xì)胞的免疫特性抗菌介質(zhì)和氣道粘蛋白，包括MUC5AC和MUC5B，由氣道和黏膜下腺體的分泌上皮細(xì)胞產(chǎn)生，參與氣道上皮表面的第一層宿主防御。分泌型IgA（SIgA）由漿細(xì)胞產(chǎn)生，通過聚合免疫球蛋白受

35、體（pIgR）轉(zhuǎn)運到氣道上皮細(xì)胞的頂面，通過一種稱為“免疫排斥”的過程阻止空氣中微生物的粘附。上皮細(xì)胞配備有模式識別受體，如Toll樣受體，可快速感知并啟動對微生物威脅的免疫反應(yīng)；細(xì)胞因子受體，包括TNFR1，可使其對免疫細(xì)胞（如氣道巨噬細(xì)胞）產(chǎn)生的信號作出反應(yīng)。相鄰的氣道上皮細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)緊密連接和粘附連接相連，它們選擇性地調(diào)節(jié)離子和分子的細(xì)胞旁擴(kuò)散，維持屏障的完整性 。這些緊密連接將存在于頂端上皮表面的配體（例如，生長因子heregulin）與其位于基底外側(cè)表面的ErbB家族受體分離，因此只有在上皮完整性損傷和破壞時才發(fā)生激活。我們對這一黏膜表面功能的看法發(fā)生了深刻的變化，因為研究表明，氣

36、道上皮細(xì)胞具有錯綜復(fù)雜的特性，使得它們能夠指導(dǎo)宿主的免疫、炎癥和重塑 （圖3）。感知和清除凋亡細(xì)胞氣道是一個暴露于污染物、病原體和過敏原的環(huán)境，上述物質(zhì)均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞的清除由“專業(yè)”吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）及“非專業(yè)”吞噬細(xì)胞（氣道上皮細(xì)胞）進(jìn)行。人支氣管上皮細(xì)胞（來自BEAS-2B細(xì)胞系）通過識別磷脂酰絲氨酸直接吞噬在酸性吞噬體中熒光的CypHer5染料標(biāo)記的凋亡上皮細(xì)胞。小GTPase RAC1的可誘導(dǎo)缺失，它是吞噬途徑中的下游信號分子，在使用Ccsp-Cre/Rac1fl/fl小鼠模型的氣道上皮中，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞吞噬功能缺陷，并且抗炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）

37、和IL-10的產(chǎn)生顯著減少。嚴(yán)重的是，在RAC1缺失的小鼠中，表現(xiàn)為過度的過敏性氣道炎癥反應(yīng)，在支氣管肺泡灌洗液（BAL）中檢測到上皮細(xì)胞來源的IL-33水平升高。這一數(shù)據(jù)提出，即氣道上皮細(xì)胞是通過RAC1信號介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞吞噬作用，其在對常見吸入性變應(yīng)原的炎癥反應(yīng)的抑制中起著關(guān)鍵作用。這項研究使用了Ccsp-Cre小鼠，該品系專門針對呼吸道細(xì)胞（club細(xì)胞），因此該機制可能無法推廣到其他類型的氣道上皮細(xì)胞。氣道基底細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的識別在決定炎癥背景下的細(xì)胞表型和命運方面也起著關(guān)鍵作用。慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種炎癥性肺疾病，其發(fā)病早期會出現(xiàn)基底細(xì)胞增生。在氣道炎癥的環(huán)境中，驅(qū)動基底

38、細(xì)胞增殖的機制揭示了基底細(xì)胞存在一種以前未被認(rèn)識的新的能力。在穩(wěn)態(tài)條件下，小鼠氣管基底細(xì)胞表達(dá)與GAS6（橋連分子）結(jié)合的AXL受體（來自TAM受體酪氨酸激酶家族）。在H1N1/PR8甲型流感病毒感染的小鼠模型中，以氣道炎癥和纖毛上皮細(xì)胞凋亡為特征，AXL可促進(jìn)基底細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期并促進(jìn)其增殖。同樣，經(jīng)鼻給C57BL/6小鼠輸送的凋亡胸腺細(xì)胞增加了的增殖基底細(xì)胞（表達(dá)Ki67）的數(shù)量，這種作用在Axl基因敲除小鼠中顯著降低。因此，有人推斷，氣道炎癥期間的基底細(xì)胞增殖是通過AXL受體酪氨酸激酶識別凋亡細(xì)胞介導(dǎo)的。在缺乏AXL的情況下，基底細(xì)胞可以通過所謂的不對稱細(xì)胞分裂分化為其他類型的細(xì)胞，

39、從而加速再上皮化。COPD患者小氣道上皮細(xì)胞免疫組化染色顯示，表達(dá)AXL的基底細(xì)胞數(shù)量增加，其增殖與caspase3陽性凋亡細(xì)胞的存在有關(guān)。炎癥記憶基底細(xì)胞不僅能夠感知和響應(yīng)炎癥微環(huán)境的變化，而且還具有內(nèi)在的炎癥記憶能力，這是在慢性過敏性炎癥疾病的背景下發(fā)現(xiàn)的。慢性鼻竇炎（CRS）是一種II型免疫介導(dǎo)疾病，其特征是鼻和副鼻竇炎癥和上皮功能障礙，伴有或不伴有稱為息肉的異常組織生長?；准?xì)胞增生是這種環(huán)境下組織重塑的表現(xiàn)。用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了慢性鼻竇炎（CRS）伴息肉和不伴息肉患者的篩竇手術(shù)過程中采集的人體組織樣本，以及健康人下鼻甲和CRS伴息肉患者的鼻腔刮片。與疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)最顯著的

40、改變出現(xiàn)在基底細(xì)胞，分化/分泌細(xì)胞及腺細(xì)胞群。在息肉樣本中，基底細(xì)胞明顯擴(kuò)張，而上皮細(xì)胞多樣性受損?；准?xì)胞上調(diào)IL-4和IL-13應(yīng)答基因，并通過擬時間分析顯示未能分化。大量RNA測序和轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（ATAC-seq）的組合顯示轉(zhuǎn)錄因子（如KLF5和ATF3）的上調(diào)，可以維持未分化的細(xì)胞狀態(tài)，對應(yīng)于分選的息肉基底細(xì)胞中的富集基序。這些發(fā)現(xiàn)提示，表觀遺傳學(xué)水平的內(nèi)在變化可能是息肉基底細(xì)胞狀態(tài)差異的原因，并可能受局部II型炎癥環(huán)境的影響。體外培養(yǎng)的受刺激基底細(xì)胞的RNA序列分析顯示，IL-4和IL-13在非息肉基底細(xì)胞中誘導(dǎo)的基因數(shù)是息肉基底細(xì)胞的10倍以上。此外，在基線水平，Wnt通路

41、激活劑CTNNB1在息肉基底細(xì)胞中的表達(dá)水平只有通過IL-4和IL-13的刺激才能在非息肉基底細(xì)胞中實現(xiàn)，這表明息肉基底細(xì)胞對于體內(nèi)暴露于II型細(xì)胞因子存在“記憶”。這些數(shù)據(jù)對我們理解過敏性疾病有著深遠(yuǎn)的意義，因為這些疾病的治療通常需要集中在操縱免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上 。晝夜節(jié)律十多年來，人們已經(jīng)認(rèn)識到，除了大腦視交叉上核對晝夜節(jié)律的神經(jīng)激素控制外，外周組織及其細(xì)胞，包括氣道上皮細(xì)胞，具有一個內(nèi)在的晝夜節(jié)律鐘，負(fù)責(zé)每天的節(jié)律性免疫波動。在小鼠和人肺組織中，時鐘基因產(chǎn)物CLOCK和PER2在CCSP+呼吸道細(xì)胞（club細(xì)胞）中表達(dá)。通過在表達(dá)Per2熒光素酶融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（Per2-Luc小鼠

42、）的肺組織切片中測量Per2的生物發(fā)光反映的晝夜節(jié)律波動，可以在糖皮質(zhì)激素的作用下被“重置”，并且隨著選擇性切除呼吸道club細(xì)胞而消失。在C57BL/6小鼠中觀察到一天中對霧化脂多糖（LPS）誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的顯著時間變化，特別是BAL中性粒細(xì)胞計數(shù)。使用Ccsp-Bmal1-/-小鼠在club細(xì)胞中靶向敲除時鐘基因Bmal1可延長中性粒細(xì)胞對LPS攻擊以及肺炎鏈球菌的炎癥反應(yīng)的持續(xù)時間，但不增加髓過氧化物酶活性或減少細(xì)菌負(fù)荷。驅(qū)動這種肺部炎癥反應(yīng)的是中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL5，它在Bmal1基因敲除后失去了晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)。REV-ERB是一種位于分子時鐘核心轉(zhuǎn)錄激活子負(fù)反饋環(huán)下游的核受體，即

43、CLOCK和BMAL1。 REV-ERB在髓細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞固有免疫應(yīng)答的晝夜調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。小鼠CCSP+支氣管上皮細(xì)胞REV-ERB的DNA結(jié)合域的靶向刪除導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞在霧化LPS刺激下的炎癥擴(kuò)增。同樣，這種炎癥反應(yīng)是通過CXCL5在轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)增加介導(dǎo)的。有趣的是，REV-ERB及其旁基因REV-ERB的雙重缺失導(dǎo)致這些小鼠在LPS攻擊時及穩(wěn)態(tài)下未受挑戰(zhàn)的小鼠中性粒細(xì)胞炎癥進(jìn)一步增加，這表明REV-ERB蛋白發(fā)揮了穩(wěn)定的抗炎功能。體內(nèi)對LPS的炎癥反應(yīng)不受單純REV-ERB缺失的影響，強調(diào)了REV-ERB在這一途徑中的主導(dǎo)作用。對細(xì)胞功能的局部晝夜節(jié)律控制的進(jìn)一步了

44、解有可能揭示為什么一些患者會出現(xiàn)“夜間”哮喘或咳嗽。 上皮表面的免疫細(xì)胞相互作用 scRNA-seq有助于高分辨率定位氣道環(huán)境中各種先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞群落。氣道上皮細(xì)胞與常駐及招募的免疫細(xì)胞協(xié)同作用，調(diào)節(jié)肺的免疫功能（圖4）。盡管人類痰液和BAL的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有助于詳細(xì)描述氣道內(nèi)的免疫群體，但支氣管刷檢樣本和活檢可同時捕獲上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞成分。計算機技術(shù)的進(jìn)步正被用來揭示在健康和疾病中發(fā)生在氣道和肺泡腔的復(fù)雜的上皮細(xì)胞及免疫反應(yīng)間的各種關(guān)聯(lián) 。巨噬細(xì)胞是位于氣道腔內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞，在人痰標(biāo)本、氣道刷檢及BAL中很容易發(fā)現(xiàn)。小鼠研究表明，常駐氣道巨噬細(xì)胞在圍產(chǎn)期來源于胎兒單核細(xì)胞，并在整

45、個生命周期內(nèi)自我維持。最近的人類研究通過scRNA-seq揭示，在肺移植后，供體肺中大多數(shù)組織常駐的氣道巨噬細(xì)胞被供體循環(huán)單核細(xì)胞池來源的氣道巨噬細(xì)胞所取代，從而對這種模式提出了挑戰(zhàn)。對囊性纖維化患者痰液樣本進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，主要的氣道免疫群發(fā)生了與疾病相關(guān)的改變，從常駐的氣道巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎心嫉膯魏思?xì)胞和中性粒細(xì)胞，表現(xiàn)出促炎表型和基因表達(dá)變化，提示吞噬功能受損。常駐氣道巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的雙向相互作用確保維持對無害刺激的免疫耐受的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并在需要時對吸入的病原體作出適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性反應(yīng)和有效的組織修復(fù)。利用活體共聚焦顯微鏡建立的小鼠模型顯示，表達(dá)CD11c的肺泡巨噬細(xì)胞通過連接

46、蛋白43的縫隙連接與肺泡上皮細(xì)胞形成直接連接，從而限制了對LPS的炎癥反應(yīng)。利用來自四種哺乳動物（包括人類）肺組織的scRNA序列數(shù)據(jù)對細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的探索顯示，在肺泡細(xì)胞常態(tài)下，上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)時發(fā)生相互關(guān)聯(lián)。很少有研究調(diào)查人類氣道上皮-巨噬細(xì)胞之間的相互關(guān)聯(lián)，但我們需要充分了解這種環(huán)境界面上失調(diào)的免疫調(diào)節(jié)相互作用是如何導(dǎo)致人類疾病的，這是一個至關(guān)重要的領(lǐng)域。 為了探討炎癥性氣道疾病中的上皮-免疫軸，我們研究了過敏性哮喘患者在亞段支氣管被確定的過敏原激發(fā)前后的BAL。支氣管肺泡灌洗液中的集落刺激因子1（CSF1）在空氣過敏原激發(fā)后升高，且由氣道上皮細(xì)胞分泌。轉(zhuǎn)基因小鼠上皮細(xì)胞特異性

47、缺失Csf1可消除過敏性氣道炎癥。此外，上皮細(xì)胞來源的CSF1增加了變應(yīng)原激發(fā)后BAL中表達(dá)CSFR1受體的肺泡樹突狀細(xì)胞亞群的數(shù)量，并促進(jìn)了其向區(qū)域淋巴結(jié)的遷移。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明氣道中的上皮細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞相互作用增強抗原呈遞，增強適應(yīng)性過敏氣道反應(yīng)。呼吸道上皮表面對呼吸道病原體的強大免疫反應(yīng)也取決于有效的適應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)。值得注意的是，在抗原進(jìn)入的氣道周圍空間受限的局部誘導(dǎo)了一個T細(xì)胞亞群，即組織常駐記憶T（TRM）細(xì)胞，準(zhǔn)備對隨后的免疫應(yīng)答產(chǎn)生快速反應(yīng)。表達(dá)CD69的CD4+和CD8+ TRM細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與循環(huán)中的CD69-效應(yīng)記憶T細(xì)胞不同，其表達(dá)促進(jìn)肺黏膜組織內(nèi)滯留的粘附分子。

48、此外，在流感免疫小鼠中進(jìn)行的共生實驗發(fā)現(xiàn)，肺氣道CD8+ TRM細(xì)胞不斷由間質(zhì)CD8+ TRM細(xì)胞補充，而不是由循環(huán)中的記憶T細(xì)胞補充。這是由趨化因子受體CXCR6與氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的CXCL16結(jié)合介導(dǎo)的。在人類肺移植受體中，供者的TRM細(xì)胞持續(xù)存在于肺的BAL樣本中超過1年，但不存在外周血中。相當(dāng)一部分氣道CD8+TRM細(xì)胞共表達(dá)E整合素CD103，它與7整合素結(jié)合形成異二聚體E7，并與上皮細(xì)胞上的E-鈣粘蛋白相互作用，促進(jìn)黏膜部位的滯留。在活檢標(biāo)本中，供體和受體的T細(xì)胞位于氣道周圍，而在BAL標(biāo)本中，受體的浸潤T細(xì)胞隨著時間的推移變?yōu)門RM表型 。TRM細(xì)胞與氣道上皮細(xì)胞之間的

49、相互作用可以形成對環(huán)境抗原的免疫反應(yīng)。肺炎球菌肺炎可產(chǎn)生CD4+ TRM細(xì)胞，在異物再次感染時，這些TRM細(xì)胞可微調(diào)肺上皮細(xì)胞以增加CXCL5的表達(dá)并增強中性粒細(xì)胞的募集。在屋塵螨過敏性氣道小鼠模型中，氣道周圍CD4+ TRM細(xì)胞的持續(xù)存在與過敏原再激發(fā)的快速反應(yīng)相關(guān)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，這是哮喘的主要特征。哮喘患者和健康對照組氣道壁活檢的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組定義了兩個CD4+ T細(xì)胞亞群：經(jīng)典的CD4+ TRM細(xì)胞和一個新的稱為組織遷移性CD4+ T細(xì)胞群，它們表達(dá)與細(xì)胞外滲入組織（如S1PR1和SELL）相關(guān)的基因。在這項研究中，一個生物信息學(xué)工具被用來研究哮喘氣道壁中的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，揭示了輔

50、助性T細(xì)胞2與上皮細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間存在較多的相互關(guān)聯(lián)，這些細(xì)胞在疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。氣道微環(huán)境的特殊性質(zhì)可以通過表觀遺傳編程驅(qū)動免疫細(xì)胞中適應(yīng)性基因表達(dá)的改變，從而形成細(xì)胞表型和功能。與脾臟和肺間質(zhì)中的TRM細(xì)胞相比，流感感染后，CD8+氣道TRM細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)特征，富含與綜合應(yīng)激反應(yīng)和氨基酸饑餓相關(guān)的基因，最終導(dǎo)致這些細(xì)胞隨著時間的推移逐漸凋亡。在免疫系統(tǒng)的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，一種稱為黏膜相關(guān)恒定T（MAIT）細(xì)胞的類似先天性T淋巴細(xì)胞亞群，約占人類氣道壁活檢總T細(xì)胞的4%。累積量的T細(xì)胞受體（TCR）的表達(dá)允許MAIT細(xì)胞

51、識別核黃素（維生素B2）生物合成的代謝物，這些代謝物來源于細(xì)菌和酵母，由MHC相關(guān)蛋白1（MR1）遞呈。當(dāng)激活時，MAIT細(xì)胞產(chǎn)生快速的促炎細(xì)胞因子反應(yīng)，提供對呼吸道疾病的保護(hù)，但也顯示組織修復(fù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，提示在屏障完整性和感染后愈合中發(fā)揮的其他重要功能。宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的介質(zhì)可阻礙上皮細(xì)胞對氣道黏膜表面病原體的反應(yīng)。I型（IFN和IFN）和III型（IFN）干擾素是宿主抗病毒反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)，但最近被證明會損害感染后的上皮修復(fù)。肺內(nèi)樹突狀細(xì)胞對聚肌苷（聚胞苷酸（poly（I:C）產(chǎn)生持續(xù)性IFN，一種合成的病毒RNA類似物，在小鼠模型中損害上皮屏障完整性，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌重復(fù)感染的嚴(yán)重病

52、理學(xué)改變。在小鼠流感病毒感染的恢復(fù)期，長期暴露于IFN后，依賴TP53的氣道上皮細(xì)胞增殖和再生減少 。上皮干擾素反應(yīng)的性質(zhì)也直接受到入侵病原體類型的影響。在感染SARS-CoV的小鼠中，I型干擾素反應(yīng)延遲導(dǎo)致炎性單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的積聚，并導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫病理學(xué)改變。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)人類支氣管上皮細(xì)胞對SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與其他呼吸道病毒誘導(dǎo)的不同，與I型和III型干擾素途徑相關(guān)的基因被抑制，然而，編碼趨化因子和促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)旺盛，這可能是該病許多臨床表現(xiàn)的原因。在一部分嚴(yán)重COVID-19肺炎患者中，也發(fā)現(xiàn)了由于罕見的基因變異或IgG中和自身抗體導(dǎo)致的I型干擾素應(yīng)答缺陷。

53、氣道上皮細(xì)胞與天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用，以維持宿主的防御。來自上皮細(xì)胞的信號維持組織常駐的免疫細(xì)胞并調(diào)節(jié)其對抗原的反應(yīng)，相反，免疫細(xì)胞可以直接改變氣道上皮細(xì)胞的功能和表型。 氣道神經(jīng)免疫相互作用氣道上皮細(xì)胞的位置使其能夠通過分泌一系列介質(zhì)來感知和應(yīng)對環(huán)境變化，這些介質(zhì)促進(jìn)與下層實質(zhì)中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的相互作用。除了監(jiān)控呼吸道并觸發(fā)回避反應(yīng)（如咳嗽和打噴嚏）的特殊上皮細(xì)胞外，眾所周知，呼吸道有豐富的感覺神經(jīng)元支配，促進(jìn)了這些回避反應(yīng)的執(zhí)行。最近的證據(jù)表明，神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和特殊化感知肺上皮細(xì)胞之間的廣泛關(guān)聯(lián)對組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要 （圖5）。這種綜合作用還能夠協(xié)

54、調(diào)對入侵病原體或有害顆粒物的反應(yīng)，監(jiān)測環(huán)境變化，如溫度或氧氣的波動，甚至對物理環(huán)境（喘氣時發(fā)生的拉伸或收縮）作出反應(yīng)。例如，PIEZO1，一種由小鼠骨髓細(xì)胞表達(dá)的機械感知離子通道，被證明能感知環(huán)境周期性靜水壓變化并產(chǎn)生促炎反應(yīng)。肺部包含一系列不同的神經(jīng)細(xì)胞，包括對有害或潛在有害刺激作出反應(yīng)的傷害感受器感覺神經(jīng)元，而膽堿能神經(jīng)元通過與氣道平滑肌、腺體和肺血管上的毒蕈堿乙酰膽堿受體（mAChRs）相互作用來調(diào)節(jié)氣道張力、氣道平滑肌收縮、粘液分泌和血管舒張?？紤]到許多基本的呼吸反應(yīng)，如咳嗽，都是由感覺神經(jīng)元介導(dǎo)的，因此認(rèn)為其可能在肺部炎癥反應(yīng)中起重要作用。除了將感覺變化傳遞給大腦外，被激活的肺神經(jīng)元

55、自身也能釋放刺激性肽，促進(jìn)隨后的炎癥反應(yīng)。消融或化學(xué)抑制Nav1.8+或瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）感覺神經(jīng)元可減少過敏性炎癥和支氣管高反應(yīng)性，上述實驗結(jié)果表明它們對肺部炎癥的作用。 同樣，肺靶向性去除神經(jīng)支配，一種支氣管鏡下射頻消融療法，被用于慢性阻塞性肺病患者，用以持久地破壞副交感神經(jīng)，因其已被證實可降低氣道阻力、粘液高分泌及炎癥反應(yīng)。特殊化感知細(xì)胞和直接神經(jīng)元相互作用的結(jié)合也可能是呼吸道對吸入性呼吸道病原體、空氣污染物和過敏原作出反應(yīng)的另一種方式。上皮TRPV4的激活觸發(fā)了對細(xì)菌LPS的保護(hù)性反應(yīng)，增加了纖毛擺動頻率并產(chǎn)生了殺菌的一氧化氮。缺乏TRPV4的小鼠氣道高反應(yīng)性加重，中性粒細(xì)胞向氣道的募集增多。相反，TRPV1+神經(jīng)元的特異性缺失通過增加存活細(xì)胞因子誘導(dǎo)和細(xì)菌清除，增強了對金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的致死性肺炎的免疫保護(hù)。TRPV1和Nav1.8+傷害感受器神經(jīng)元通過抑制中性粒細(xì)胞數(shù)量、監(jiān)視活動以及調(diào)節(jié)常駐T細(xì)胞數(shù)量來影響細(xì)菌的傳播。特異性消融迷走神經(jīng)TRPV1神經(jīng)元可通過釋放神經(jīng)肽CG