蛋白質(zhì)分子化學(xué)修飾

1、關(guān)于蛋白質(zhì)分子的化學(xué)修飾第一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 酶的活性中心第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的目的第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)第五節(jié) 酶化學(xué)修飾的應(yīng)用第六節(jié) 酶的蛋白質(zhì)工程第二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 酶的活性中心（active site） 一、活性中心的概念酶的必需基團(tuán)(essential group): 與酶活性有關(guān)的基團(tuán)酶的活性中心(active center): 由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域. 第三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶分子非必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基

2、團(tuán)非活性中心活性中心第四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月活性中心的重要化學(xué)基團(tuán) 7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基團(tuán),如（氨基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。 賴氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巰基 組氨酸的咪唑基 酪氨酸和絲氨酸的羥基第五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月OH第六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月活性部位只占酶分子很小的一部分第八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月胰凝乳蛋白酶 第九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于20

3、22年6月活性部位是一個(gè)三維實(shí)體第十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。 (4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合。第十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶的穩(wěn)定性 1.酶穩(wěn)定的分子原因 1）共價(jià)鍵： 肽鍵（peptide bond） 穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。 二硫鍵（disulfide bond） 由兩個(gè)Cys的側(cè)鏈-SH氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要

4、因素。第十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2）非共價(jià)鍵：疏水相互作用（hydrophobic interaction）: 是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。氫鍵（hydrogen bond）： 是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要力量。第十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月靜電相互作用（electrostatic interaction）： 又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負(fù)電荷間的作用力。對(duì)酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成于分子表面上。范德華力： 在電中性分子之間的非共價(jià)結(jié)合。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。金屬離子： Ca2+、Mg2+和Zn2+等高價(jià)陽離子

5、與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。第十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)蛋白質(zhì)水平化學(xué)修飾適應(yīng)所有酶，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)修飾過程破壞酶分子劑型固定化適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良穩(wěn)定劑簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)工作量大反應(yīng)介質(zhì)適用于特殊反應(yīng)體系和酶類適合的酶類還不普遍2. 穩(wěn)定酶的方法第十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、研究酶活性中心的方法 1.物理學(xué)方法： 用X射線衍射法直接檢測(cè)底物或其類似物與酶形成

6、的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對(duì)位置。第十六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為 1)非專一性化學(xué)修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若某基團(tuán)被修飾后： 酶活性不變?cè)摶鶊F(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)酶活性降低或喪失該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。第十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn) 失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。 S或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）。先加S或競(jìng) 加共價(jià)修飾劑 透析除去S或競(jìng) 活性不喪失第十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月差別標(biāo)記：

7、底物或抑制劑存在 活性基團(tuán)不與修飾劑作用 去除底物或抑制劑 原來被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記 可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)?；瘜W(xué)修飾含同位素標(biāo)記 的同樣試劑第十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾） 用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾） 采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。作用機(jī)制：利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。第二十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)修飾的專一性第二十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月親和修飾劑： 與S結(jié)

8、構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基 親和力大，而與活性中心以外的氨基酸 殘基親和力小。具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性 中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。第二十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.蛋白質(zhì)工程： 將酶相應(yīng)的cDNA定點(diǎn)突變，突變的cDNA只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。第二十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 酶化學(xué)修飾及修飾目的 一、酶化學(xué)修飾 1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因： 第二十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，日益增多的酶

9、制劑已用于食品發(fā)酵、疾病診治和預(yù)防、環(huán)境保護(hù)和監(jiān)測(cè)、化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，以及基因工程等生物技術(shù)領(lǐng)域。 但是酶在實(shí)際應(yīng)用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解(具有抗原性)；2、酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機(jī)溶劑及時(shí)間的考驗(yàn)，半衰期短、易變性失活(細(xì)胞外穩(wěn)定性差)；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應(yīng)生產(chǎn)工藝要求，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍(酶活性不夠高)。第二十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 改變酶特性有兩種主要的方法： 1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。 2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。第二十六

10、張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 酶化學(xué)修飾的概念 （原理 、方法、應(yīng)用）酶的化學(xué)修飾（chemical modification）： 通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 化學(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的優(yōu)良特性，甚至創(chuàng)造出新的活性。酶選擇性化學(xué)修飾： 肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾 化學(xué)修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學(xué)基團(tuán)特性，或直接或經(jīng)過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)

11、構(gòu)進(jìn)行改造。第二十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酶化學(xué)修飾的目的 1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末） 2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。 4）產(chǎn)生新的催化能力。第二十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理 凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使酶蛋白共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)），都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。 達(dá)到：改造酶的作用特性（

12、包括改變酶活性、專一性、對(duì)效應(yīng)物響應(yīng)性能及對(duì)輔助因子的要求）提高酶的穩(wěn)定性擴(kuò)大在體內(nèi)應(yīng)用可能性（防止在體內(nèi)非專一性水解、減少和消除免疫原性以利于醫(yī)療應(yīng)用）第二十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第三十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間

13、障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第三十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除 “遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。第三十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性 包括酶的 1.

14、活性部位情況 2. 穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件 3. 側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性第三十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、 修飾劑的選擇 要考慮 1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量） 2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)） 3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件第三十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、反應(yīng)條件的選擇 要注意 1. 酶與修飾劑的分子比例 2. 反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件 3. 反應(yīng)溫度及時(shí)間第三十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（

15、大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。第三十六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修飾方法： 修飾前修飾劑活化 一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。第三十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、大分子修飾后酶性質(zhì)的變化（1）提高酶活力（2）增加酶的穩(wěn)定性 半衰期：酶活力降低原來活力一半所經(jīng)過的時(shí)間。（3）降低抗原抗體反應(yīng) 第三十八張，PPT

16、共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 應(yīng)用：如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等） PEG天門冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性 延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。第三十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基

17、團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第四十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。 1. 非極性R基氨基酸（共8種）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 纈氨酸(Valine,Val,V), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)第四十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.無電

18、荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic a

19、cid,Glu,E)第四十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)第四十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 化學(xué)修飾反應(yīng)的類型 1) 烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。可作用基團(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 第四十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月烷基化反應(yīng)第四十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2) 酰基化反應(yīng)試劑

20、特點(diǎn)： 含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之酰基化。可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第四十六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月?；磻?yīng) 第四十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3) 氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。第四十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。第四十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022

21、年6月2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1) 氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys, Arg, His, Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化酰基化修飾劑: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等第五十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2) 羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺第五十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3) 胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是

22、羰基對(duì)氨基?；Ｐ揎梽?丁二酮 二羰基化合物 1，2環(huán)己二酮 苯乙二醛第五十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 4) 巰基的化學(xué)修飾 來源：Cys 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）ESH 第五十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5) 二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）第五十六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月氧化：過甲酸: Performic acid第五十七張，PPT共八

23、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 6)咪唑基的化學(xué)修飾 來源：His 修飾反應(yīng):?；c烷基化 酰基化修飾劑: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修飾劑：碘乙酸 + ICH2COOH + HI第五十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月7）酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）第五十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH（四硝基甲烷）第六十張，PPT共

24、八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月8）吲哚基的化學(xué)修飾 來源：Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀酰亞胺第六十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第六十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學(xué)修飾的應(yīng)用 在醫(yī)藥方面：化學(xué)

25、修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)它在體內(nèi)半衰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。 在生物技術(shù)領(lǐng)域：化學(xué)修飾酶能夠提高酶對(duì)熱，酸，堿和有機(jī)溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學(xué)性質(zhì)。 在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：1.研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。第六十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)修飾效果舉例 用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍 用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的NHCH2COOH后，該酶對(duì)60C熱處理的穩(wěn)定性增高了1000倍。 超氧化物歧化

26、酶(superoxide dismutase, SOD)、L谷氨酰胺酶、L天門冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們?cè)趧?dòng)物血液循環(huán)中被清除的速度，酶的活力可以保存1545。第六十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1. 某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對(duì)的，很少有對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈絕對(duì)專一的化學(xué)修飾劑。2. 化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象的變化將妨礙對(duì)修飾結(jié)果的解釋。3. 酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能

27、關(guān)系中的作用。4. 酶化學(xué)修飾的結(jié)果對(duì)于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性所“必需”的，為什么是必需的，還得用X射線和其他方法來確定。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。第六十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法） 通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。第六十六張，PPT共八十八

28、頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 利用肽鏈有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別） 第六十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。第六十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于202

29、2年6月修飾后酶性質(zhì)的變化1）提高酶活力2）消除抗原性第六十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）金屬離子置換修飾1、概念 通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。2、作用范圍含有金屬離子的酶 金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（ 1 ）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（ 2 ）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。第七十張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、常用金屬離子 （往往是二價(jià)離子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2+，Co 2+，Cu 2+，F(xiàn)

30、e 2+等。4、 方法步驟向酶液加入一定量的EDTA將酶與金屬鰲合物分離金屬離子置換。舉例：-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過程中添加一定量的鈣離子。第七十一張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。 通過兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。蛋白質(zhì)工程：利用基因操作技術(shù)。第七十二張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的蛋白質(zhì)工程一、概念： 蛋白質(zhì)工程是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)(結(jié)合X-衍射分析技術(shù)、蛋白質(zhì)溶

31、液構(gòu)象理論及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì))，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造的技術(shù)科學(xué)。 常用：化學(xué)全合成法、限制酶酶切片斷取代法等。蛋白質(zhì)工程在酶的改造方面目前研究比較系統(tǒng)的例子是組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑（TpA）第七十三張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。第七十四張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：直接法：直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：X-射線晶體衍射研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振(NM

32、R)光譜研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。第七十五張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 X-射線衍射技術(shù)： 用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。第七十六張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、蛋白質(zhì)工程的主要手段以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。 位點(diǎn)特異性突變基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)基因突變 隨機(jī)突變基于高通量篩選法 基因內(nèi)部的剪接基因剪接 5或3端的剪接第七十七張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、蛋白質(zhì)工程改造的實(shí)際應(yīng)用 1.枯草桿菌蛋白酶 1）增強(qiáng)抗氧化性 2）改變底物特異性 2.溶菌酶（Lysozyme） 1)抗菌范圍的擴(kuò)大 2)熱穩(wěn)定性的提高第七十八張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1993年,美國科學(xué)家Arnold F H首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出第七十九張，PPT共八十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存