蛋白質(zhì)純化和鑒定

1、關(guān)于蛋白質(zhì)的純化與鑒定第一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Lecture Outline蛋白質(zhì)的分離純化的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的分離純化原則和程序蛋白質(zhì)的含量測(cè)定蛋白質(zhì)純度鑒定蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)層析技術(shù)蛋白層析的主要技術(shù)8/15/20222第二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七部分蛋白層析的主要技術(shù)第三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蛋白層析的主要技術(shù)Gel Filtration Chromatography (GFC) Ion Exchange Chromatography (IEX or IEC)Affinity Chromatography (AC)H

2、ydrophobic Interaction Chromatography (HIC)8/15/20224第四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月I. Gel FiltrationChromatography （GFC）第五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Gel Chromatography凝膠過(guò)濾 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959)分子篩層析（molecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)排阻層析 （exclusion chromatography）(Pedersen

3、, 1962) 指混合物隨流動(dòng)相經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。 Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.第六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理凝膠層析的數(shù)理關(guān)系凝膠層析的優(yōu)點(diǎn)凝膠層析的缺點(diǎn)凝膠介質(zhì)凝膠類型的選擇其它條件選擇Gel filtration第七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、基本原理 樣品固定相流動(dòng)相小分子被延滯小分子大分子較快流出 分子篩效應(yīng)

4、分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。第八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）純化：對(duì)生物大分子的純化。如病毒、蛋白質(zhì)、酶、激素、抗體、核酸和多糖等。應(yīng)用：第九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Gel filtration purification of an enzyme: SDSanalysisM - LMW markers1 - Start material2 - Pool from ion exchange3 - Pool from HIC4 - Pool from Superdex 75 pg4321MM67

5、k43k30k第十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）分子量的測(cè)定：球形蛋白質(zhì)的洗脫體積主要是由它的分子量決定的，在一個(gè)相當(dāng)?shù)姆肿恿糠秶鷥?nèi)，洗脫體積大約是分子量對(duì)數(shù)的線性函數(shù)。用相同形狀的和已知的蛋白質(zhì)作出一條校正曲線，測(cè)定洗脫體積后可從校正曲線得到分子量。第十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Highly efficient desalting in less than 1 minute （三）溶液的濃縮：加入干膠，溶液的水和小分子被膨脹的凝膠吸收。（四）去除干擾的小分子：脫鹽（鹽可被看作是小分子）、EDTA、生物標(biāo)記等。10 20 30 40 50 secAlbu

6、minNaCl第十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（五）更換緩沖液：為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)更換緩沖液體系（六）測(cè)定平衡常數(shù)：例如藥物的蛋白結(jié)合率。藥物本身分子量較小，與蛋白結(jié)合后成為分子量較大的物質(zhì)，通過(guò)凝膠過(guò)濾將二者分開(kāi)。第十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系 1、柱床體積 (VT) 2、洗脫體積（Ve）即欲分離物質(zhì)通過(guò)層析柱洗脫下來(lái)所需洗脫液的總體積。3、外水體積（V0） 4、內(nèi)水體積（Vi）5、凝膠干體積（Vg）6、分配系數(shù)（Kd） 第十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月柱床體積VT凝膠干體積Vg內(nèi)水體積Vi存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間

7、的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中流動(dòng)相的體積。顆粒內(nèi)部所含水相的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。 VT = 1/4 D2h 外水體積V0VT = Vg + V0 + Vi數(shù)理關(guān)系Void volume VoVolume of the gel matrix VgPore volume Vi第十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月洗脫體積VeVoVeVolumeConcentration第十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Ve -Vo Kd = Vi分配系數(shù)（ Kd ）：特點(diǎn)：（1）與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮?/p>

8、關(guān) （2）與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無(wú)關(guān) 每個(gè)溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間有一個(gè)特定的分配系數(shù)（Kd）Ve=Vo+KdViKd is difficult to get because Vi is difficult to measure第十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(3)Ve = Vo + Vi Kd = 1分子完全不被排阻完全向凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散在兩相分配的比值為1,最后流出.(1)Ve = Vo Kd = 0分子完全被排阻于凝膠顆粒之外全部分布于流動(dòng)相里,最先流出。(2) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKd為溶質(zhì)以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散 Kd=0 0Kd1 Kd=1洗脫體積第

9、十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三.凝膠層析的優(yōu)點(diǎn) 1. 凝膠是一種不帶電荷的惰性載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 2. 操作條件較溫和。用來(lái)分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)。 3. 樣品得率高,重復(fù)性好,可進(jìn)行大量樣品的分離純化。 4. 最快的更換緩沖液第十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、凝膠層析的缺點(diǎn)1. 要求樣品和洗脫液的粘度很低。2. 凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3. 凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用。如芳香族化合物與脂蛋白等。第二十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月葡聚糖 （glucos

10、e）瓊脂糖 （agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）五、凝膠介質(zhì)第二十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1959年P(guān)orath和Flodin合成（商品名為Sephadex） （1）結(jié)構(gòu)：基本骨架：葡聚糖（dextran）交聯(lián)劑：3-氯代-1 ,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過(guò)醚鍵交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。1.葡聚糖凝膠第二十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）特點(diǎn)：交聯(lián)度：交聯(lián)劑越多 ，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密?？紫队。笈蛎浺灿?，機(jī)械強(qiáng)度高，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低，分離物質(zhì)的分子量大。化

11、學(xué)性質(zhì)： 穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸、堿和一般有機(jī)溶劑, 耐熱耐堿不耐強(qiáng)酸第二十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Sephadex的分級(jí)范圍 G10 700G15 1,500G25 1,000 5,000G50 1,50030,000G75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000吸水性G類的型號(hào)表示每克干凝膠吸水量（ml）x10如G-50 每克干凝膠吸水量為5ml。第二十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由瓊脂制成的線性多糖，由D-半乳糖和3，6-脫水L-半乳糖交替組成。大孔凝膠，

12、工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限，可分離MW40萬(wàn)以上的物質(zhì)，可用來(lái)分離核酸及病毒瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作用而降解對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高(溫度40 ,pH=4.5-9.0)2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose，Biogel-A)第二十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月型號(hào) 近似的瓊脂糖濃度(%)多糖 蛋白質(zhì) Sepharose 2B 220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106第二十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的

13、，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似，但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在pH 2-11范圍內(nèi)使用.3、聚丙烯酰胺凝膠第二十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月各種層析膠體：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose第二十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1. 組分離：當(dāng)兩種成分分子量差距很大時(shí)采用，例如脫鹽

14、。凝膠選擇使高分子量的洗脫體積在外水（Vo），低分子量的洗脫體積接近Vt。脫鹽一般推薦Sephadex G-25。2. 分級(jí)分離：當(dāng)分離幾種分子量接近的組分時(shí)，避免幾種成分的洗脫體積接近Vo或Vt。3. 分子量測(cè)定：要使樣品分子量落在選擇性曲線的線性部分及處于校正標(biāo)準(zhǔn)品的中間。一般推薦使用Sephacryl S-200 superfine, Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。六、凝膠類型的選擇第二十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月七.其它條件選擇 1. 柱的選擇 長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高。但層析柱長(zhǎng)度不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均

15、一、流速過(guò)慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。一般柱長(zhǎng)度不超過(guò)1m，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。 2. 樣品的選擇： 樣品體積占床體積的1-5%, 粘度小。 3. 洗脫液的選擇： 完全不帶電荷的物質(zhì)可以用蒸餾水洗脫。帶電荷的物質(zhì)可以用Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液，最重要的要考慮洗脫液對(duì)樣品的作用，如pH、離子強(qiáng)度、清潔劑等，是否會(huì)引起蛋白分解，影響酶、輔酶、激素的活性。第三十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 八、凝膠過(guò)濾的實(shí)驗(yàn)（一）、凝膠的準(zhǔn)備 Sephadex 干粉狀，用前需要膨脹，一般用蒸餾水進(jìn)行，注意不要用電磁攪拌，以免破壞凝膠顆粒。 不同類型的凝膠膨脹的時(shí)間不同： G-25,

16、G-50 膨脹過(guò)夜 G-75 一天 G-100 二天 G-200 三天 在沸水中膨脹可縮短時(shí)間，并可除去氣體。 Sephacryl, Sepharose, Sepharose CL是膨脹好的。第三十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （二）、裝柱將凝膠懸液調(diào)成大約75%。用負(fù)壓泵脫氣。如果是加熱后或冰箱中取出，要放置達(dá)室溫。層析柱放置在避免過(guò)度通風(fēng)和陽(yáng)光直射的地方，防止溫度變化。排掉層析床支持物內(nèi)的氣體。層析柱調(diào)到垂直位置。凝膠懸液要一次倒入柱內(nèi)，避免分層。第三十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （三）、檢查層析柱 以藍(lán)葡聚糖2000（2mg/ml）為樣品，觀察色帶在

17、柱內(nèi)洗脫時(shí)移動(dòng)的形狀判斷層析柱的質(zhì)量，同時(shí)其洗脫體積又可作為外水體積。（四）、加樣 1.手工加樣 2.加樣閥加樣 要求進(jìn)入凝膠的樣品前緣在同一水平。（五）、洗脫 洗脫裝置用蠕動(dòng)泵將洗脫液泵入層析柱。要注意洗脫液的供給，不要走干，一旦走干，層析柱必須重新裝才能使用。（六）、凝膠的清洗 凝膠在使用數(shù)次后，一些雜質(zhì)會(huì)吸附到上面，影響分離效果，需清洗后才能恢復(fù)原樣。 Sephadex,，Sepacryl， Sepharose CL 可用0.2M NaOH。 Sepharose 可用4pH9緩沖液及非離子清潔劑。第三十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (七)、凝膠的儲(chǔ)存和防止微生物生長(zhǎng) 使

18、用中的柱子里，因?yàn)橛芯彌_液的不斷流動(dòng)，微生物不易生長(zhǎng)，未用的柱子和放在容器中的凝膠懸液要采用抗菌劑預(yù)防微生物的生長(zhǎng)，抗菌劑必須不與樣品作用。 通常用的防腐劑有：疊氮鈉 0.02% ，三氯丁醇 0.05% ，硫柳汞 0.005% ，洗必太 0.002% ，汞苯鹽（乙酸:硝酸）0.001-0.01%。 Sephadex,，Sephacryl,，Sepharose和Sepharose CL都可以在加防腐劑后以膨脹狀態(tài)儲(chǔ)存。最好在4冷藏，但要防止凍結(jié)，因?yàn)閮鼋Y(jié)將破壞凝膠顆粒。 Sephadex可以干燥后儲(chǔ)存，干燥的程序是徹底清洗膠，除掉鹽和雜質(zhì)，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，換稍濃一些的

19、乙醇，依次增加乙醇的濃度，最后用96%乙醇，使膠皺縮，布氏漏斗抽慮，60-80烘干。第三十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月II. Ion Exchange ChromatographyUseful at all stages of purification and at all scales第三十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理離子交換劑的類型離子交換劑與緩沖液的選擇 應(yīng)用離子交換層析的優(yōu)點(diǎn)Ion Exchange Chromatography第三十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、原理用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與

20、流動(dòng)相中的某種離子進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型混合物的層析方法。 第三十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月低鹽高鹽分離結(jié)束第三十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月帶電荷不同蛋白在特定pH值下有不同帶電性質(zhì)第三十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子交換樹(shù)脂如何分離蛋白質(zhì)洗脫樹(shù)脂與樹(shù)脂結(jié)合力第四十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、離子交換劑的類型在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽(yáng)離子交換劑 帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換陰離子交換劑帶正電荷，與陰離子交換 陰離子交換樹(shù)脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定。膠體膠體

21、第四十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月陽(yáng)離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹(shù)脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹(shù)脂第四十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹(shù)脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素第四十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 基質(zhì) 電荷基團(tuán) 反離子商品名纖維素 OCH2COO- Na+CM-纖維素纖維素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2 Cl-DEAE-纖維素聚苯乙烯SO3- Na+732陽(yáng)離子樹(shù)脂 聚苯乙烯N+（CH2）4 Cl-717陰離子樹(shù)脂第四十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子交換樹(shù)脂離子交

22、換纖維素離子交換凝膠（二）按載體種類不同第四十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.離子交換樹(shù)脂：聚苯乙烯樹(shù)脂：苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母體交聯(lián)劑第四十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子交換樹(shù)脂的性質(zhì)1、一般離子交換劑的特性多孔性：疏松、多孔網(wǎng)狀，活性基團(tuán)在網(wǎng)孔內(nèi)不溶性：不溶于稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性：離子交換性：具相當(dāng)數(shù)量的可交換或帶電基團(tuán)第四十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Dowex 100 149 m Dowex 50 297 mDowex 20 840 m 2、交聯(lián)度： 合成樹(shù)脂時(shí)所用的交聯(lián)劑在原料總重量中所占的百分比交聯(lián)度越大 樹(shù)脂的網(wǎng)孔越

23、小 膨脹性小 交換量少交聯(lián)度越小 樹(shù)脂的網(wǎng)孔越大 膨脹性大 交換量大 膨脹性增加易引起樹(shù)脂的機(jī)械變形破損第四十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)酸型 磺酸基 -SO3-H+ 中等酸型 磷酸根 -O-PO2H2 亞磷酸根 -O-POH2 弱酸型 羧基 -COOH陰離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)堿 季胺基團(tuán) -N+(CH3)3 弱堿 叔胺、仲胺、伯胺基團(tuán) 可引入的解離基團(tuán)第四十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月操作過(guò)程： 1.裝柱； 2.離子交換； 3.洗脫第五十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、離子交換劑與緩沖液的選擇 （一）離子交換劑的選擇必須考慮的影

24、響因素 1陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇2強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇3不同離子型交換劑的選擇4不同基質(zhì)離子交換劑的選擇第五十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇測(cè)定pI確定穩(wěn)定pH范圍 堿性分子在偏酸性環(huán)境中穩(wěn)定：細(xì)胞色素c 酸性分子在偏堿性環(huán)境中穩(wěn)定：核酸、HCG第五十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月離子交換劑的選擇圖第五十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月不同離子型交換劑的選擇選用何種類型離子交換劑?取決于離子交換劑對(duì)諸反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此，強(qiáng)陽(yáng)性和強(qiáng)陰性離于交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和

25、弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。第五十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月不同基質(zhì)離子交換劑的選擇1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小 大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素第五十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、緩沖液pH的選擇 2、緩沖液離子組成的選擇3、緩沖液離子強(qiáng)度的選擇（二）緩沖液的選擇第五十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、緩沖液pH的選擇 要求： 起始緩沖液能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，洗脫液能使有效成分從離子交換劑上解離下來(lái)。 pH值與目標(biāo)物pI的關(guān)系（pH=pI1） 選用弱陽(yáng)離子交換劑時(shí)，pH高于其pK； 選用

26、弱陰離子交換劑時(shí)，pH低于其pK；第五十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、緩沖液離子組成的選擇采用陽(yáng)離子交換劑應(yīng)選用陰離子緩沖液，如：磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽采用陰離子交換劑應(yīng)選用陽(yáng)離子緩沖液，如：Tris緩沖液離子不影響被分離物的活性、測(cè)定、溶解度。第五十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、緩沖液離子強(qiáng)度的選擇起始緩沖液能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，一般小于0.1 mol/L。洗脫液能使有效成分從離子交換劑上解離下來(lái)，一般0.15 mol/L（或采用pH洗脫）。第五十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 原則： 所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離

27、子或基團(tuán) 改變pH或離子強(qiáng)度 增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力 降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力 洗脫方式：梯度洗脫(三)洗脫劑的選擇第六十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、應(yīng)用 分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及他帶電的生物分子。第六十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、離子交換層析的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍廣：20種氨基酸中，大部分帶正電或負(fù)電。處理量大，附載系數(shù)高，一步縮小樣品體積很多。去除雜質(zhì)能力強(qiáng)，如對(duì)核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及電荷性有差別的蛋白均可去除。分離能力強(qiáng)?？煞旁诩兓に嚨娜魏我徊?。第六十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月III. Affini

28、ty Chromatography (AC)親 和 層 析第六十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月親和層析ACAffinity chromatography is a technique of liquid chromatography which separates biomolecules through biospecific interactions.基本原理分離過(guò)程特點(diǎn)應(yīng)用第六十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、原理生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析通過(guò)將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶

29、性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。第六十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶： 基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體： 抗原，病毒，細(xì)胞細(xì)胞： 細(xì)胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸： 互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶， 結(jié)合 蛋白激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞具有專一性親和力的生物分子對(duì)第六十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Definitions in Affinity ChromatographyMatrix (基質(zhì)或載體): an inert gel to which a ligand can be

30、coupledLigand (配基): a component which interacts specifically with the targetCoupling (偶聯(lián)): covalent attachment of the ligand to the matrixBinding (結(jié)合): association between the ligand and the targetMatrixSpecific ligand第六十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一） 載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏

31、松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液體流動(dòng)性（3）化學(xué)和機(jī)械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕第六十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、常用載體（1）纖維素 特點(diǎn)：價(jià)廉、來(lái)源充足 纖維性、非均一性限制大分子的摻入 非專一性吸附嚴(yán)重 用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠 特點(diǎn)： 化學(xué)及物理性質(zhì)穩(wěn)定 多孔性比瓊脂糖低第七十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （3）瓊脂糖凝膠濃度 商品2 Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B 凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松即多孔性越高機(jī)械強(qiáng)度越低第七十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于202

32、2年6月（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃 特點(diǎn)：不受微生物的侵蝕 耐酸、堿、有機(jī)溶劑 表面非專一性吸附特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng) 可供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基較多第七十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）配基的選擇1、對(duì)于欲純化的物質(zhì)應(yīng)有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團(tuán)3、配基偶聯(lián)的位置，需不影響與大分子連接的部位。4、親和柱制備首選大分子配基。第七十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月以酶和底物為例：E+L ELKL =EL/EL=E0-ELL0-EL/ELE0、L0：起始濃度當(dāng)L0E0時(shí)KL =E0-ELL0/ELEL=E0-ELL0/

33、KLKd=結(jié)合酶/游離酶=EL/E0-EL=L0/ KLKLKL：解離常數(shù) E： 酶 L： 底物EL：復(fù)合物第七十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）固相化將配體以共價(jià)鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑載體的排斥效應(yīng)小孔經(jīng)凝膠會(huì)明顯阻止大分子物與配基結(jié)合載體的空間障礙載體影響了配基的空間，特別是小分子配基。需加碳?xì)滏湣笆直邸?，長(zhǎng)度需適中。第七十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、親和層析的過(guò)程1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無(wú)效洗脫吸附效率不高有效吸附第七十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響吸附的因素 1、緩沖液離子成份強(qiáng)度、pH、溫度等都

34、有影響。 2、流速盡可能慢，10ml/cm2/小時(shí) 3、上柱樣品用平衡層析柱緩沖液溶解，濃度約20mg蛋白/ml. 4、上樣體積取決于親和力，低則上樣量減少，一般柱床體積的5。 第七十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （1）非特異性洗脫法：需改變緩沖液的pH，離子濃度，介電常數(shù)和溫度。 a分段洗脫法：在惰性蛋白質(zhì)流出后，更換緩沖液，包括組成，pH、離子濃度或溫度的改變 b梯度洗脫法：連續(xù)改變緩沖液濃度，使洗脫能力逐漸加強(qiáng)（2）特殊洗脫： 當(dāng)?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會(huì)引起失活，可用專一的化學(xué)方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。洗脫方法 第七十八張，PPT共一

35、百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （3）專一洗脫技術(shù) a. 競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)：用與固定配基相同的游離配基進(jìn)行洗脫。 b. 陰性洗脫：在雙底物或多底物存在的親和系統(tǒng)中，如果撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。 例：在前導(dǎo)底物100uM NADH存在下，乳酸脫氫酶強(qiáng)烈吸留在固定的丙酮酸類似物上，在洗脫液中不含NADH時(shí)，脫氫酶被迅速洗脫。第七十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 已使用過(guò)的柱，經(jīng)過(guò)再生，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復(fù)使用。 再生步驟：起始緩沖液重復(fù)平衡一次用高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度溶液處理用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：第八十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

36、月三、特點(diǎn)1、只需一步純化步驟，非常簡(jiǎn)單2、產(chǎn)物非常純95%第八十一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、特點(diǎn)3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、還可去除已變性或部分降解物質(zhì)5、但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制6、載體較昂貴，機(jī)械強(qiáng)度低，配基制備困難，有的配基本身要經(jīng)過(guò)分離純化第八十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、應(yīng)用1、分離和純化2、分辨化學(xué)或遺傳學(xué)上修飾的酶3、純化親和標(biāo)記的活化中心肽段和 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)5、解釋酶作用機(jī)理第八十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2

37、022年6月IV. Hydrophobic interaction chromatography（HIC）疏水層析第八十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理操作介質(zhì)的選擇配基的選擇疏水層析的影響因素疏水層析的優(yōu)點(diǎn)疏水層析第八十五張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 疏水層析亦稱疏水作用層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，它也屬于吸附層析一類, 通過(guò)表面疏水性的差異來(lái)分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。一、疏水層析的原理第八十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強(qiáng)弱、分布及

38、空間位阻效應(yīng)各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。 在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強(qiáng)弱順序?yàn)門(mén)yr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。第八十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）疏水作用蛋白質(zhì)與固定相結(jié)合原理蛋白質(zhì)表面存在的疏水補(bǔ)丁蛋白質(zhì)發(fā)生（局部可逆性）變性時(shí)，原本隱藏于分子內(nèi)部的疏水殘基暴露至分子表面疏水層析的特性：即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水殘基容易與疏水性固定相結(jié)合洗脫原理 通過(guò)降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，將結(jié)合于固定相的物質(zhì)按結(jié)合能力的大小依次洗脫下來(lái)（疏水作用弱的物質(zhì)先被洗脫下

39、來(lái)，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，結(jié)合能力強(qiáng)的物質(zhì)也被逐漸洗脫）第八十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）吸附劑根據(jù)基質(zhì)的性質(zhì)不同分為：1.親水性吸附劑：目前這類吸附劑主要是交聯(lián)瓊脂糖（Sepharose）, 配體有苯基和辛基化合物。二者耦合而成特點(diǎn)：不耐壓，一般僅用于常壓層析系統(tǒng)2.非親水性吸附劑：這類吸附劑的基質(zhì)有硅膠、樹(shù)脂等，配體為苯基、辛基和烷基等，二者通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合特點(diǎn)：耐壓，機(jī)械性能好。不僅適用于常壓層析，特別適用于高壓層析（如HPLC等）第九十張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、操作1.制備層析柱2.加樣與洗脫3.層析柱再生第九十一張，PPT共一百一十頁(yè)，

40、創(chuàng)作于2022年6月Equilibration1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionEquilibrate the column and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules第九十二張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Sample application1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrix

41、ProteinsHydrophobic groups 第九十三張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Washing out unbound material1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteins第九十四張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Elution1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbs第九十五張，PPT共一百一十頁(yè)

42、，創(chuàng)作于2022年6月ElutionConc. saltAbs1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionMore strongly bound proteins第九十六張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣品的準(zhǔn)備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)到與平衡液基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件 。HIC的樣品體積受樣品中組分濃度和介質(zhì)的結(jié)合容量的影響，對(duì)于稀釋樣品無(wú)需濃縮可以直接加樣 第九十七張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月洗脫的方式： 采用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫（最常用

43、）；通過(guò)往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑 ，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫 （溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)）往流動(dòng)相中添加去污劑等 ，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來(lái)（分離膜蛋白）第九十八張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月洗脫理論：疏溶劑理論：1976年由Sinanoglu等人提出，認(rèn)為由于溶質(zhì)分子有減少其與水接觸的非極性表面的傾向，而增加了與疏水配基結(jié)合的概率。自由能分離理論：1979年Vanoss等人提出，認(rèn)為生物體界面自由能比水低，與配基產(chǎn)生范德華力，這個(gè)引力隨溶液鹽析能力的改變而改變。熵分離理論：1984年Regnier提出，認(rèn)為高鹽溶

44、液中，蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的鄰近分子是有序排列，疏水部分易于配基結(jié)合，減弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥開(kāi)，使體系熵增加。第九十九張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、 介質(zhì)的選擇主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用最廣泛的疏水介質(zhì)； 近年來(lái)研制超大瓊脂糖(superporous) ，在擴(kuò)散孔的基礎(chǔ)上增加了對(duì)流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率；殼聚糖具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來(lái)在疏水層析中也得到了應(yīng)用。 第一百?gòu)垼琍PT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月介質(zhì)的再生、貯存 再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進(jìn)行清洗，NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時(shí)還能使微生物鈍化失活起到消毒的效果。此外，促溶鹽類的水溶液也是良好的清洗劑。貯存：一般懸浮在20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。 第一百零一張，PPT共一百一十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。 四、 配基的選擇偶聯(lián)至基質(zhì)的常見(jiàn)配基類型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新