銷售培訓(xùn)系列之-細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識

1、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識中生生物科技：Gibco品牌價值和信任的歷史GIBCO自1962年開始生產(chǎn)用于細(xì)胞培養(yǎng)的動物，是此行業(yè)的開創(chuàng)者。在四十年的歲月里，一直保持在技術(shù)和品質(zhì)方面的領(lǐng)先水平。和培養(yǎng)基的市場占有率常年蟬聯(lián)全球第一。GIBCO生產(chǎn)的縱向整體化管理從血液收集到最終產(chǎn)品檢驗和稽核的每一個步驟，GIBCO都采用設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)操作程序。這種嚴(yán)格的控制可保證產(chǎn)品的高品質(zhì)和最低的批間差?？勺粉櫺裕浩焚|(zhì)的GIBCO收集并保留從采血、處理、檢測到發(fā)運的全部文件供追蹤之用。2Invitrogen Proprietary &細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)設(shè)備CO2培養(yǎng)箱，水浴，離心機，液氮罐，顯微鏡3Invitrogen Prop

2、rietary &細(xì)胞培養(yǎng)基本流程基礎(chǔ)培養(yǎng)基+FBS+添加劑+抗生素去除Media用PBS加入Trypsin以分離貼壁細(xì)胞將部分細(xì)胞傳代到新的Media中4Invitrogen Proprietary &1.細(xì)胞培養(yǎng)主要成分 基本培養(yǎng)基 細(xì)胞培養(yǎng)試劑（抗生素、細(xì)胞解離，生長因子等） 平衡鹽溶液 真核細(xì)胞5Invitrogen Proprietary &培養(yǎng)基必須提供所有基本的營養(yǎng)6Invitrogen Proprietary &經(jīng)典培養(yǎng)基的應(yīng)用BME( Basal Medium Eagle):是由Eagle發(fā)明的，是最簡單的培養(yǎng)基，只有11種氨基酸和鹽及一些維生素。最先用于培養(yǎng)小鼠的L 細(xì)胞和

3、人類HeLa細(xì)胞，現(xiàn)在廣泛用于各種細(xì)胞的培養(yǎng)EMEM or MEM(Eagles Minimum Essential Medium):是BME的升級版，氨基酸濃度是BME的兩倍，適用于的細(xì)胞DMEM or DME是(Dulbeccos Modification of Eagles Medium)改進(jìn)的 EM. 氨基酸和維生素濃度是BME的4倍.最先葡萄糖的濃度是 1g/L，稱為低糖DMEM,后來增加到4.5g/L，稱為高糖DMEM，廣泛用于各種細(xì)胞培養(yǎng)。7Invitrogen Proprietary &經(jīng)典培養(yǎng)基的應(yīng)用M 199 (Medium 199):是一種比較古老的，配方復(fù)雜的，含有核苷

4、酸，核酸等成分的培養(yǎng)基。最初用于雞胚肌細(xì)胞的培養(yǎng)，還用于各種細(xì)胞的維持和生產(chǎn)RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute # 1640):是 McCoys 5A 的改進(jìn)版，含有高濃度的肌醇。廣泛用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。如人類白細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞等血液來源的細(xì)胞Hams F10 (Hams Nutrient Mixture F10):由Ham發(fā)明，用于人類2倍體細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞的培養(yǎng)。Hams F12 (Hams Nutrient Mixture F12):F10 的升級版，含有的維生素，肌醇，氨基酸。用于培養(yǎng)大鼠，兔子和雞胚細(xì)胞，還用于中國倉鼠細(xì)胞以

5、及肺細(xì)胞的培養(yǎng)8Invitrogen Proprietary &基本培養(yǎng)基用途9Invitrogen Proprietary &GIBCO培養(yǎng)基的4種形式即用型(1X) 液體培養(yǎng)基 :直接用培養(yǎng)基濃縮液(10X or 50X ): 用前需要稀釋成1 干粉培養(yǎng)基 DPM (Dryder Media):需要在水中溶解, 加入碳酸氫鈉,調(diào)值, 然后過濾才可以用高級顆粒技術(shù)培養(yǎng)基 AGT (Advanced Granulation TechnologyTM):比DPM形式的培養(yǎng)基更容易溶解的顆粒狀的培養(yǎng)基.AGT 是完全為工業(yè)產(chǎn)量的用戶開發(fā)的,提前混合好了,只需要加水溶解和過濾。提前調(diào)好了,所有的成分

6、都10Invitrogen Proprietary &特性:干粉狀形式節(jié)省空間需要在超純水中溶解需要加入碳酸氫鈉 需要調(diào)節(jié)優(yōu)點:節(jié)省空間缺點:耗時干粉培養(yǎng)基需要用0.22um的濾膜過濾費空間高價格什么東西都不需要自己準(zhǔn)備液體形式液體培養(yǎng)基直接可以使用不需要另外加入其他成分 不需調(diào)高價值不需調(diào) 不需過濾11Invitrogen Proprietary &培養(yǎng)基的保存及干粉：2年液體：10個月濃縮液體：12個月所有的培養(yǎng)基都必須在28，避光保存，不能冷凍，干粉培養(yǎng)基可在室況下。12Invitrogen Proprietary &培養(yǎng)基的保質(zhì)期含有 L-Glutamine的液體培養(yǎng)基 12 個月不含

7、L-Glutamine的液體培養(yǎng)基 18個月干粉培養(yǎng)基，3年13Invitrogen Proprietary &GIBCO培養(yǎng)基的類型傳統(tǒng)培養(yǎng)基要添加(5-10%)的培養(yǎng)基（Advanced medium）高級培養(yǎng)基濃縮了營養(yǎng)物質(zhì)和其他成分的培養(yǎng)基,只需要 2% 的(減少50-90%)的麻煩,節(jié)省時間和花費減少不同批次帶來的差異和試培養(yǎng)基(無培養(yǎng)基/無蛋白培養(yǎng)基/化學(xué)定義的培養(yǎng)基), 主要用于生物產(chǎn)品生產(chǎn),干細(xì)胞研究等無使用時無須再填加培養(yǎng)基針對角質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、各類昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、羊水細(xì)胞等的無培養(yǎng)基14In

8、vitrogen Proprietary &的作用附著因子纖連蛋白，提高粘性增殖、分化所需的激素和生長因子調(diào)節(jié)膜的滲透性生長因子、脂類、酶和微量元素的載體緩沖液毒素滅活作用保護(hù)作用:波動,蛋白酶,試劑,機械損傷15Invitrogen Proprietary &GIBCO動物的種類(FBS):胎牛-原產(chǎn)地（；澳大利亞；巴西；新西蘭等）經(jīng)過鑒定的(certified) vs 質(zhì)量有保證的(qualified)(NBS):新生牛-出生少于十四天:小牛-出生少于一年:捐獻(xiàn)-特殊飼養(yǎng)的，專門用來進(jìn)行提取的牛:其他-horse, chicken, goat, lamb（羊）, porcine（豬）, r

9、abbit16Invitrogen Proprietary &的類型熱滅活:(在56水浴30min)熱滅活一些可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)（補體等）在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中需要透析:透析掉小分子量的物質(zhì)離子，氨基酸用于標(biāo)記低IgG:有自己獨特的層析技術(shù)去除球蛋白經(jīng)過處理將IgG去除用于免疫學(xué)研究及其生產(chǎn)生物制品胚胎干細(xì)胞:胚胎/間充質(zhì)干細(xì)胞維持干細(xì)胞處于為分化狀態(tài)-射線照射處理的(客戶訂制)17Invitrogen Proprietary &Certified FBS Vs Qualified FBSCertified FBS 和 Qualified FBS都通過以下測試無菌，醋酸素介質(zhì)

10、中的電泳圖譜，滲透壓，值，總蛋白，檢測，內(nèi)毒素和支原體對Certified 胎牛噬菌體檢測；生物化學(xué)檢測（堿性磷酸酶等21項內(nèi)容）；激素檢測（雌二醇等5項內(nèi)容）；Sf9細(xì)胞生長，除以上檢測外，還進(jìn)行如下檢測：18Invitrogen Proprietary &可追蹤性：品質(zhì)的GIBCO收集并保留從采血、處理、檢測到發(fā)運的全部文件供追蹤之用通常具有3-5年的保質(zhì)期的性能可能會隨著每批，和季節(jié)的不同而不同在拿到每一批前應(yīng)該進(jìn)行驗證通常,最好足夠1-2年使用，確保每一瓶都一樣，一次而不需要每次都進(jìn)行驗證19Invitrogen Proprietary &培養(yǎng)效能檢測，GIBCO都進(jìn)行以下培養(yǎng)效能檢測

11、。選擇胎牛對所有的胎牛的最重要的標(biāo)準(zhǔn)是其通過嚴(yán)格的品質(zhì)控制，GIBCO 也同時在支持特殊的細(xì)胞生長的能力，因此，除了保證條件下對的三個重要的培養(yǎng)效能進(jìn)行檢測：集落效率檢定：分析每一批胎牛促成單一細(xì)胞集落的能力，及促進(jìn)老鼠骨髓瘤細(xì)胞及其衍生的融合瘤細(xì)胞的生長能力。實際應(yīng)用在低密度非貼附性細(xì)胞的集落形成、融合瘤發(fā)育以及單克隆抗體的制造。貼附效率檢定：利用一貼附的、已的人類細(xì)胞株來檢測每一批促使低密度細(xì)胞貼附及的能力。實際應(yīng)用在低密度或正常密度、細(xì)胞株及細(xì)胞株的繁殖。二倍體成細(xì)胞生長促進(jìn)檢定：評估每一批能維持難培養(yǎng)的貼附細(xì)胞長期生長的能力。培養(yǎng)數(shù)代WI-38人類二倍體成細(xì)胞，計算每一代培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)

12、。此項檢測所挑選出的胎牛批號能維持難以生長的細(xì)胞、貼附性細(xì)胞、正常的細(xì)胞株的生長及存活。也進(jìn)行昆蟲細(xì)胞生長促進(jìn)檢定：評估每一批Certified等級胎此外，對部分胎牛，及特定批號的Qualified等級的胎牛其促進(jìn)SF9昆蟲細(xì)胞生長的能力。此項測最佳指標(biāo)。牛試為選擇適合昆蟲細(xì)胞生長及BEVS實驗的胎牛20Invitrogen Proprietary &其它檢測對Certified胎牛噬菌體檢測；利用適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，例如K12，進(jìn)行噬菌體溶菌斑記數(shù)分析。此檢測可以了解，除以上檢測外，還進(jìn)行如下檢測：胎牛收集與制造過程的產(chǎn)品質(zhì)量，噬菌體濃度高表示胎牛的原料處理有問題。生物化學(xué)檢測（堿性磷酸酶等21

13、項內(nèi)容）；激素檢測（雌二醇等5項內(nèi)容）；血紅蛋白檢測其它對ES cell-Qualified FBS,要進(jìn)行特殊檢測以確定對胚胎干細(xì)胞未分化的細(xì)胞形態(tài)的維持能力。進(jìn)行其對VERO細(xì)胞生長的支持能力的檢測；對小牛和新生牛，進(jìn)行其對Sp2/O-Ag14細(xì)胞生長的支持能力的檢測；對馬，對部分，也進(jìn)行細(xì)胞毒性的檢測。21Invitrogen Proprietary &有關(guān)的常見問題22Invitrogen Proprietary &保存最好的方法?建議應(yīng)保存在-5至-2O。然而，若存放于4時，超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。如何解凍才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

14、建議您將從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于中脂蛋白的變性所造成，而血蛋白(形成凝血的蛋白之一)在，也會存在于中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響本身的質(zhì)量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將 分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。 不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。有關(guān)的常見問題23Invitrogen Proprietary &為什么要熱滅活?加

15、熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，使用熱滅活。有必要做熱滅活嗎?實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活 ，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的 對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了 的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的 ，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是 污染，而把 放在37環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的 擴(kuò)增。因此 建議您，若非必須，您可

16、以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時間，更確保 的質(zhì)量!有關(guān)的常見問題24Invitrogen Proprietary &為什么在冰箱中的胎牛會出現(xiàn)沉淀?GIBICO的胎牛沒有預(yù)老化，在28時，中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、蛋白原、玻粘連蛋白等）可能而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響的質(zhì)量。在20胎牛，避免反復(fù)凍融。如何避免沉淀物的產(chǎn)生?建議您在使用的時候，注意下列的操作:解凍時，請按照所建議的逐步解凍法(-20至4至室溫)，若解凍時改變的溫度太大(如-20至37)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。解凍時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。將置于37太久

17、。若在37放置太久，會變得混濁，同時中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響的質(zhì)量。的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做的熱滅活，請遵守56，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多?；九囵B(yǎng)基如何選擇DMEM或者RPMI-培養(yǎng)基25Invitrogen Proprietary &懸浮細(xì)胞培養(yǎng)不含鈣離子低CO2壓力Hs 平衡鹽高CO2壓力Earles 平衡鹽長時間培養(yǎng)？GlutaMAX激素作用/比色分析？無酚紅高細(xì)胞密度？額外的營養(yǎng)物質(zhì)低CO2/ 無？HEPES高代謝率/高細(xì)胞密度？高葡萄糖固有非目的細(xì)胞過度生

18、長下游處理殘留蛋白的抗原性中和抗體的存在造成產(chǎn)量下降增加污染的可能引起細(xì)胞分化26Invitrogen Proprietary &Serum-Free Medium（SFM）專門針對角質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、各類昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、羊水細(xì)胞的無培養(yǎng)基27Invitrogen Proprietary &WHY?成分更加清晰消除因批次不同而帶來的不確定性 保持實驗的連續(xù)性易于純化和下游處理優(yōu)化特殊細(xì)胞及其功能的培養(yǎng)條件越來越多的無培養(yǎng)基 用非動物/人來源的原料制造有利于精確闡述細(xì)胞功能提高生產(chǎn)力更好控制生理反應(yīng)SFM, PFM

19、 和CDM 培養(yǎng)基的區(qū)別Serum-Free Media (SFM)無需加入可能包含降解的蛋白或者蛋白塊蛋白含量保持在易于純化的最小狀態(tài)優(yōu)化特殊細(xì)胞培養(yǎng)條件Protein-Free Media (PFM)無蛋白 (不同的廠商有不同的說明)包含于動物或者植物的不明確的提取物Chemically-Defined Media (CDM)無蛋白和不明確的成分所有的成分都有一個明確的結(jié)構(gòu) ，可以提供性能一致的產(chǎn)品,減少批次間的差別28Invitrogen Proprietary &平衡鹽溶液的選擇s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是H什么？Hs 平衡鹽溶液（HBS）和Ear

20、les平衡鹽溶液（EBS）本質(zhì)的功能差別？-HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles(2.2g/L)中比在Hs (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的值。- Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hs液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清的組織，用Hs液就可以。洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中29Invitrogen Proprietary &enol Red酚紅：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為黃色，堿性時為紫色。值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為什么時候選擇不含酚紅的培養(yǎng)基？

21、酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）由于酚紅干擾檢測，在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。30Invitrogen Proprietary &細(xì)胞培養(yǎng)試劑31Invitrogen Proprietary &Supplement: 添加劑L-Glutamine在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的和核酸代謝。L谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞性。而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液具中會自發(fā)降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；過多的追加

22、L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。32Invitrogen Proprietary &替代品：GlutaMAXGlutaMax是由丙氨酸和L-谷氨酰胺縮合形成的二肽與L-Glutamine（L-谷氨酰胺）相比，含有Glutamax的培養(yǎng)基1. GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX- I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L谷氨酰胺幾乎完全降解。2. 由于穩(wěn)定性增加，因此無需反復(fù)添加，使用更方便；3.可以防止L-谷氨酰胺降解而產(chǎn)生利于細(xì)胞生長。性氨的累積，因而有33Invitrogen Proprietary &Stability of Gl

23、utaMAX-I vs. L-glutamine in DMEMD-MEM waaliquotedpplemented with GlutaMAX-I or L-glutamine,o vials and stored at 37C. Sles were taken dailyand frozen at -20C. Levels of GlutaMAX-I and L-glutamine were determined by HPLC.34Invitrogen Proprietary &Ammonia Levels in Supplemented MediaD-MEM waaliquotedp

24、plemented with GlutaMAX-I or L-glutamine,o vials and stored at 37C. Sles were taken daily andfrozen at -20C. Levels of ammonia were determined by HPLC.35Invitrogen Proprietary &酸鈉：Pyruvate培養(yǎng)基中酸鈉的作用是什么？酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源。但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝酸鈉。36Invitrogen Proprietary &胰酶：Trypsin（1）.胰蛋

25、白酶.；（2）.胰蛋白酶.。（3）0.25% 胰蛋白酶缺點：使用或酶失活需-20度保存37Invitrogen Proprietary &細(xì)胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca+, Mg+離子和8.0 , 溫度 37 oC 其作用等有關(guān)。通常情況下，能力最強。另外，鈣、鎂離子及均能大大降低其消化能力。每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hs液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：（1）.胰蛋白酶.；（2）.胰蛋白酶.。（3）0.25% 胰蛋白酶溶液.

26、；使用液配制。多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用.胰蛋白酶.38Invitrogen Proprietary &胰酶（Trypsin） 替代品TrypLE= Trypsin Like Enzyme非動物來源的,純化的重組蛋白酶,其純度比傳統(tǒng)的胰蛋白酶更高對細(xì)胞的作用溫和室溫下穩(wěn)定,不怕反復(fù)凍融消化細(xì)胞之前不需要用緩沖液洗滌以去除都能用)稀釋失活無需胰蛋白酶抑制劑經(jīng)濟(jì)方便 (避免Trypsin的分裝和解凍等操作)無酚紅的TrypLE (避免雌激素模擬作用)(在含和不含的情況下代Trypsin直39Invitrogen Proprietary &平衡鹽溶液DPBS（Dulbeccososate-Buffere

27、d Salines）Earles 平衡鹽Hs平衡鹽磷酸鹽緩沖液40Invitrogen Proprietary &平衡鹽溶液的選擇s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因H是什么？Hs 平衡鹽溶液（HBS）和Earles平衡鹽溶液（EBS）本質(zhì)的功能差別？-HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles(2.2g/L)中比在H衡，以維持溶液的s (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平值。- Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hs液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。

28、如果的組織，用Hs液就可以。僅僅是將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中41Invitrogen Proprietary &FAQs1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始。2. 何時須更換培養(yǎng)基？視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞

29、無法存活。42Invitrogen Proprietary &4 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2 ；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。5.冷凍管應(yīng)如何解凍？取出冷凍管后， 須立即放入37 C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另

30、冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。43Invitrogen Proprietary &6.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？欲回收動物細(xì)胞， 其離心速率一般為300 xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞。7. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？動物細(xì)胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。4

31、4Invitrogen Proprietary &8.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。9.之細(xì)胞冷凍管經(jīng)，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？研究在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。45Invitrogen Proprietary &10.之細(xì)胞或細(xì)胞存活率不佳可能原因？研

32、究在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。使用錯誤或的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于80 C 太久。11. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？酚紅在培養(yǎng)基中用作值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究用加有酚紅的培養(yǎng)基。在做流式細(xì)胞檢測時，不使46Invitrogen Proprietary &細(xì)胞培養(yǎng)基47Invitrog

33、en Proprietary &神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基NEUROBASALTM Media NEUROBASALTM-A MediaSerum-free mediumSerum-free Supplement: N2orB27For NSC：B27 without Vitamine Ano unwanted differentiation48Invitrogen Proprietary &昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf9/Sf21需要添加10% Grace medium（兩種：有無添加物）無培養(yǎng)基 Sf9 SFM49Invitrogen Proprietary &培養(yǎng)基 SFM無角質(zhì)細(xì)胞淋巴細(xì)胞造血細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞肝

34、細(xì)胞CHO細(xì)胞293細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞羊水細(xì)胞50Invitrogen Proprietary &Stem Cell51Invitrogen Proprietary &Stem Cell Media造血干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞Culture Media for Four Stem Cell Types52Invitrogen Proprietary &胚胎干細(xì)胞Products for Embryonic Stem Cell (ESC)ResearchESC Culture ProductsKnockOut Serum Replacement (KSR)KnockOut DMEM (KO-DM

35、EM)DMEM/F-12 Low OsmolalityES Cell-Qualified FBSESC AntibodiesSSEA-1SSEA-3SSEA-4Tra-1-60Tra-1-81ESC Growth FactorsFGF-BASIC (full length) REC HUNoggin REC HUSonic Hedgehog (25-198) REC MS53Invitrogen Proprietary &KnockOut Products -The “Gold Standard” for serum free ESC CultureUsed together, KSR and

36、 KO-DMEM significantly reduce ESCdifferentiation compared to ESC-qualified FBS and traditional DMEM54Invitrogen Proprietary &55Invitrogen Proprietary &56Invitrogen Proprietary &Stem Cell Media胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞Culture Media for Four Stem Cell Types57Invitrogen Proprietary &間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesen

37、chymal stem cells,MSCs)是骨髓中的非造血干細(xì)胞,早期分離培養(yǎng)時, 其外觀呈成細(xì)胞樣而被稱為成細(xì)胞集落形成單位(Colonyforming unit-fibroblastic, CUF-F)“Pluripotent stem cells： 可分化成 骨、軟骨、脂肪、細(xì)胞、肝細(xì)胞成肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成58Invitrogen Proprietary &Today59Invitrogen Proprietary &The structure of Bone1968-1970骨髓臍帶脂肪胎盤羊水牙齒Where Do MSCs Come From?間充質(zhì)干細(xì)胞Traditiona

38、l Basal Culture MediaDMEM 低糖+10-20 % FBS缺點：高用量批次間差異大需預(yù)篩選適于生長的批次費用高60Invitrogen Proprietary &Products for Mesenchymal Stem CellMSC Culture ProductsMesenPRO RS MediumMSC-Qualified FBSMSC AntibodiesSTRO-1CD73CD90CD11bCD14MSC Growth FactorsFGF-BASIC (full length) REC HUBone morogenic protein-2 (BMP-2) R

39、EC HUdermal growth factor (EGF) REC HU61Invitrogen Proprietary &MesenPRO RS Medium- Reduced Serumreduced serum formulation containing 2% FBS62Invitrogen Proprietary &MesenPRO RS MediumMesenPRO RS Medium- ReducedSerumEliminates need to spend time and money pre-Mquaayinsg mFBuSltilo-ltinseage differen

40、tiation capabilitiesbonefatcartilage63Invitrogen Proprietary &MesenPRO RS MediumGene expresmediaprofiles match classicalReduced serum (2%) for consistency and variability compared to 10-20% serum mediacartilage64Invitrogen Proprietary &MesenPRO RS MediumVersatile Mediumt iitable for:MSCs derived fro

41、m Bone Marrow / Human Cord Blood /AdieMSCs derived from Human, Mouse and SheephMSC P2mMSC P165Invitrogen Proprietary &MesenPRO RS Medium66Invitrogen Proprietary &pre-qualified FBS for MSCsMSC-Qualified FBSQualified specifically for thegrowth of MSCsAttain enhanced MSC clonalefficiencyImproves expano

42、f MSCsMaains multi-lineagedifferentiation capabilitiesEliminates the need to spend time and money pre-qualifying FBS lots67Invitrogen Proprietary &Stem Cell Media胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞Culture Media for Four Stem Cell Types68Invitrogen Proprietary &神經(jīng)干細(xì)胞Neural Stem Cell69Invitrogen Proprietary &Products for Neural Stem CellNEUROBASALTM Media NEUROBASALTM-A MediaSerum-free mediumSerum-free Supplement: N2orB27For NSC：B27 without Vitamine Ano unwanted differentiatio