分子生物學技術

1、分子生物學技術Technology of molecular biology課程編號：09061適用專業(yè)：動物醫(yī)學(含本碩)學時數(shù)：32學時 （理論12學時，實驗20學時）總學分：2學分大綱主撰人：李 強內(nèi)容簡介分子生物學技術作為一門獸醫(yī)專業(yè)的選修課，是在分子生物學理論研究基礎上，提出如何研究基因和蛋白質(zhì)的方法。不但具有重要的理論意義，而且更具有重要的應用價值。該課程重點在核酸提取和純化，PCR技術、DNA測序技術、DNA重組技術，基因組和蛋白質(zhì)學技術；以及生物信息學技術等。教學大綱一、課堂講授部分（12學時）（一）各章節(jié)要點及授課時數(shù)第一章 核酸提取技術 2學時第二章 PCR技術： 2學時第

2、三章 DNA測序技術： 2學時第四章 DNA重組技術： 2學時第五章 基因組和蛋白質(zhì)組學技術： 2學時第六章 生物信息學技術： 2學時（二）教材及主要參考書1教材：實用分子生物學技術 趙曉瑜 李繼剛主編 化學工業(yè)出版社2 主要參考書：分子克隆實驗指南 科學出版社精編分子生物學實驗指南 科學出版社二、實驗部分1實驗簡介分子生物實驗技術是一門理論與實驗技術相結合的重要專業(yè)基礎課。理論課講授核酸提取、PCR、DNA測序技術、DNA重組技術，基因組和蛋白質(zhì)學技術；以及生物信息學技術等。實驗采用現(xiàn)代實驗的方法與手段驗證理論的正確性，并用綜合實驗培養(yǎng)學生發(fā)散思維、跳躍思維向辯證思維的過渡。實驗內(nèi)容涉及了質(zhì)

3、粒DNA的提取及限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒分析；應用多聚酶鏈式反應（PCR）體外基因擴增及產(chǎn)物鑒定；PCR產(chǎn)物凝膠回收。2實驗教學目標及基本要求本課程教學目標是培養(yǎng)學生動手能力、觀察能力、分析問題和解決問題的能力，同時培養(yǎng)學生實事求是的作風和嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度，為以后的科研工作打好堅實的基礎。通過對本門課程的學習使學生加深和鞏固對分子生物實驗技術基本知識和基本理論的學習和理解；學會運用分子生物學技術原理和方法來解決科研和生產(chǎn)中的問題；深入了解現(xiàn)代分子生物學的實驗技術與儀器設備。3考核辦法：實驗操作過程和實驗報告完成情況各占50% ，總成績以百分計算。4開出實驗個數(shù)：3（綜合實驗1個，驗證實驗2個）6應開

4、實驗學期：3（4）二、學時分配章 次標 題實驗學時每組人數(shù)備 注實驗一堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測62綜合實驗實驗二質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定62驗證實驗實驗三PCR技術體外擴增DNA擴增、產(chǎn)物回收及電泳檢測82驗證實驗實驗一 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗特點實驗類型：綜合 實驗類別：專業(yè)基礎 計劃學時：6 每組人數(shù)：2 二、實驗目的1、掌握堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA和試劑盒提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。 2、掌握瓊脂糖凝膠的制備及外源DNA的檢測原理。3、了解質(zhì)粒DNA的粗略定量方法。三、實驗內(nèi)容提要1、將單菌落接種于3m1含相

5、應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖菌過夜；2、12,000rpm離心30sec，收集菌體；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振蕩懸浮菌體；4、加200ul新配制的溶液II，顛倒混勻；5、溶液澄清后立即加入預冷的200u1溶液III混勻后冰上放置510 min；6、4、12,000rpm離心15min，取上清，加0.7倍異丙醇混勻，室溫靜置5min；7、12,000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量水或TE，-20保存?zhèn)溆谩?、取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100加熱溶解；9、平衡凝膠槽：放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好

6、梳子與底板的距離（一般高出底板0.51mm）；10、鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50左右倒入凝膠槽，膠厚一般為58mm；11、待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負極端，DNA由負極向正極移動），使液面高出凝膠23mm，小心拔出梳子；12、DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）；13、打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關，一般使用電壓不超過5v/cm；14、據(jù)指示染料移動的位置，確定電泳是否終止；15、電泳完畢關閉電源，將凝膠放紫外燈下觀察并拍照，觀察質(zhì)粒狀態(tài)并記錄結果。實驗儀

7、器設備搖床、臺式高速離心機、微量移液器、微量EP管、低溫冰箱、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。實驗操作要點1、熟練掌握質(zhì)粒DNA的提取過程和注意事項。2、熟練掌握瓊脂糖凝膠的制備過程和電泳檢測DNA的方法及注意事項。實驗二 質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定實驗特點實驗類型：驗證 實驗類別：專業(yè)基礎 計劃學時：6 每組人數(shù)：2 二、實驗目的1、掌握限制性內(nèi)切酶的特性。2、掌握對重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法。三、實驗內(nèi)容提要1、用微量移液槍向滅菌的EP管中分別加入DNA 1ug和相應的限制性內(nèi)切酶反應10緩沖液2 u1， 再加入去離子水使總體積為19 u1將管內(nèi)溶液

8、混勻后加入1 u1酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底；2、混勻反應體系后，將EP管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3小時，使酶切反應完全，置于冰箱中保存?zhèn)溆茫?、制備瓊脂糖凝膠并電泳（選擇合適的DNA分子量標準作為酶切產(chǎn)物的大小對比），分析酶切產(chǎn)物的正確性并記錄結果，電泳方法見實驗一質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳。四、實驗儀器設備微量移液器、微量EP管、加熱塊、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。實驗操作要點1、熟練掌握酶切體系的配置及注意事項。2、熟練掌握用DNA分子量標準標定酶切產(chǎn)物的大小。實驗三 多聚酶鏈式反應（PCR）體外DNA擴增、

9、產(chǎn)物回收及電泳分析實驗特點實驗類型：驗證 實驗類別：專業(yè)基礎 計劃學時：8 每組人數(shù)：2二、實驗目的1、了解PCR基因擴增技術在DNA操作中的重要性及應用范圍。2、熟悉PCR基因擴增的基本原理。3、掌握PCR基因擴增技術的具體操作過程。4、掌握DNA回收的基本原理和操作過程。三、實驗內(nèi)容提要1、在一個無菌的0.5ml EP離心管內(nèi)加入PCR混合液50ul混勻（包括模板1ul、反映緩沖液5ul、F1引物1ul、R1引物1ul 、dNTP1ul、Tag聚合酶1ul、ddH2O401ul）；2、將Eppendorf離心管放入PCR儀反應倉中；3、設置PCR反應條件為：94變性5min后開始以下循環(huán)，94變性反應45sec；65退火反應45sec；72延伸反應1 min；進行30個循環(huán)；最后72反應7min；4 冷卻恒定；4、PCR產(chǎn)物分析：采用1.0瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴增的特異性，根據(jù)標準DNA的大小粗略計算PCR產(chǎn)物的大小，記錄結果，電泳方法見實驗