分子生物學(xué)技術(shù)

1、分子生物學(xué)技術(shù)Technology of molecular biology課程編號：09061適用專業(yè)：動(dòng)物醫(yī)學(xué)(含本碩)學(xué)時(shí)數(shù)：32學(xué)時(shí) （理論12學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)20學(xué)時(shí)）總學(xué)分：2學(xué)分大綱主撰人：李 強(qiáng)內(nèi)容簡介分子生物學(xué)技術(shù)作為一門獸醫(yī)專業(yè)的選修課，是在分子生物學(xué)理論研究基礎(chǔ)上，提出如何研究基因和蛋白質(zhì)的方法。不但具有重要的理論意義，而且更具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該課程重點(diǎn)在核酸提取和純化，PCR技術(shù)、DNA測序技術(shù)、DNA重組技術(shù)，基因組和蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)；以及生物信息學(xué)技術(shù)等。教學(xué)大綱一、課堂講授部分（12學(xué)時(shí)）（一）各章節(jié)要點(diǎn)及授課時(shí)數(shù)第一章 核酸提取技術(shù) 2學(xué)時(shí)第二章 PCR技術(shù)： 2學(xué)時(shí)第

2、三章 DNA測序技術(shù)： 2學(xué)時(shí)第四章 DNA重組技術(shù)： 2學(xué)時(shí)第五章 基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)： 2學(xué)時(shí)第六章 生物信息學(xué)技術(shù)： 2學(xué)時(shí)（二）教材及主要參考書1教材：實(shí)用分子生物學(xué)技術(shù) 趙曉瑜 李繼剛主編 化學(xué)工業(yè)出版社2 主要參考書：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 科學(xué)出版社精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 科學(xué)出版社二、實(shí)驗(yàn)部分1實(shí)驗(yàn)簡介分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)是一門理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的重要專業(yè)基礎(chǔ)課。理論課講授核酸提取、PCR、DNA測序技術(shù)、DNA重組技術(shù)，基因組和蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)；以及生物信息學(xué)技術(shù)等。實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)的方法與手段驗(yàn)證理論的正確性，并用綜合實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生發(fā)散思維、跳躍思維向辯證思維的過渡。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及了質(zhì)

3、粒DNA的提取及限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒分析；應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體外基因擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定；PCR產(chǎn)物凝膠回收。2實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)及基本要求本課程教學(xué)目標(biāo)是培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力、觀察能力、分析問題和解決問題的能力，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生實(shí)事求是的作風(fēng)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度，為以后的科研工作打好堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過對本門課程的學(xué)習(xí)使學(xué)生加深和鞏固對分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)基本知識和基本理論的學(xué)習(xí)和理解；學(xué)會運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)原理和方法來解決科研和生產(chǎn)中的問題；深入了解現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與儀器設(shè)備。3考核辦法：實(shí)驗(yàn)操作過程和實(shí)驗(yàn)報(bào)告完成情況各占50% ，總成績以百分計(jì)算。4開出實(shí)驗(yàn)個(gè)數(shù)：3（綜合實(shí)驗(yàn)1個(gè)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)2個(gè)）6應(yīng)開

4、實(shí)驗(yàn)學(xué)期：3（4）二、學(xué)時(shí)分配章 次標(biāo) 題實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)每組人數(shù)備 注實(shí)驗(yàn)一堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測62綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定62驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA擴(kuò)增、產(chǎn)物回收及電泳檢測82驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)類型：綜合 實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計(jì)劃學(xué)時(shí)：6 每組人數(shù)：2 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA和試劑盒提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。 2、掌握瓊脂糖凝膠的制備及外源DNA的檢測原理。3、了解質(zhì)粒DNA的粗略定量方法。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要1、將單菌落接種于3m1含相

5、應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖菌過夜；2、12,000rpm離心30sec，收集菌體；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振蕩懸浮菌體；4、加200ul新配制的溶液II，顛倒混勻；5、溶液澄清后立即加入預(yù)冷的200u1溶液III混勻后冰上放置510 min；6、4、12,000rpm離心15min，取上清，加0.7倍異丙醇混勻，室溫靜置5min；7、12,000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量水或TE，-20保存?zhèn)溆谩?、取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100加熱溶解；9、平衡凝膠槽：放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好

6、梳子與底板的距離（一般高出底板0.51mm）；10、鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50左右倒入凝膠槽，膠厚一般為58mm；11、待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負(fù)極端，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)），使液面高出凝膠23mm，小心拔出梳子；12、DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）；13、打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關(guān)，一般使用電壓不超過5v/cm；14、據(jù)指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止；15、電泳完畢關(guān)閉電源，將凝膠放紫外燈下觀察并拍照，觀察質(zhì)粒狀態(tài)并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)儀

7、器設(shè)備搖床、臺式高速離心機(jī)、微量移液器、微量EP管、低溫冰箱、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)1、熟練掌握質(zhì)粒DNA的提取過程和注意事項(xiàng)。2、熟練掌握瓊脂糖凝膠的制備過程和電泳檢測DNA的方法及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)類型：驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計(jì)劃學(xué)時(shí)：6 每組人數(shù)：2 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握限制性內(nèi)切酶的特性。2、掌握對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切的原理和方法。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要1、用微量移液槍向滅菌的EP管中分別加入DNA 1ug和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10緩沖液2 u1， 再加入去離子水使總體積為19 u1將管內(nèi)溶液

8、混勻后加入1 u1酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底；2、混勻反應(yīng)體系后，將EP管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全，置于冰箱中保存?zhèn)溆茫?、制備瓊脂糖凝膠并電泳（選擇合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作為酶切產(chǎn)物的大小對比），分析酶切產(chǎn)物的正確性并記錄結(jié)果，電泳方法見實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳。四、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備微量移液器、微量EP管、加熱塊、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)1、熟練掌握酶切體系的配置及注意事項(xiàng)。2、熟練掌握用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定酶切產(chǎn)物的大小。實(shí)驗(yàn)三 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體外DNA擴(kuò)增、

9、產(chǎn)物回收及電泳分析實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)類型：驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ) 計(jì)劃學(xué)時(shí)：8 每組人數(shù)：2二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解PCR基因擴(kuò)增技術(shù)在DNA操作中的重要性及應(yīng)用范圍。2、熟悉PCR基因擴(kuò)增的基本原理。3、掌握PCR基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程。4、掌握DNA回收的基本原理和操作過程。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要1、在一個(gè)無菌的0.5ml EP離心管內(nèi)加入PCR混合液50ul混勻（包括模板1ul、反映緩沖液5ul、F1引物1ul、R1引物1ul 、dNTP1ul、Tag聚合酶1ul、ddH2O401ul）；2、將Eppendorf離心管放入PCR儀反應(yīng)倉中；3、設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：94變性5min后開始以下循環(huán)，94變性反應(yīng)45sec；65退火反應(yīng)45sec；72延伸反應(yīng)1 min；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72反應(yīng)7min；4 冷卻恒定；4、PCR產(chǎn)物分析：采用1.0瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴(kuò)增的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA的大小粗略計(jì)算PCR產(chǎn)物的大小，記錄結(jié)果，電泳方法見實(shí)驗(yàn)