E-cadherin在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響開題報告

1、資料開題報告課題名稱： E 鈣黏蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響課題負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)人所在單位： * 醫(yī)學(xué)院填表日期： 20* 年 7 月選題的來源、目的、意義和基本內(nèi)容選題來源胃癌 ( gastric cancer) 是一個全球性的疾病， 在癌癥相關(guān)死亡中列第 2 位1 ，近年來全球新增患者約 870, 000 例，死亡人數(shù)超過630, 000 例2 。胃癌嚴(yán)重危害著我國國民的健康， 高居消化道惡性腫瘤發(fā)病率、 死亡率之首， 而且是我國癌癥患者死亡的主要疾病之一。 經(jīng)過醫(yī)學(xué)界幾代人數(shù)十年的不懈努力， 尤其是近10 年來影像學(xué)診斷及綜合治療手段不斷提高， 胃癌的療效已獲得了明顯的進步，但不可否認(rèn)， 其總體

2、治愈率仍難以令人滿意， 死亡率居高不下， 大多數(shù)患者仍死于胃癌的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 3,4 。究其原因，一方面是與我國國民經(jīng)濟水平不高、 大眾保健意識薄弱等原因?qū)е碌脑缙谖赴z出率低有關(guān)， 另一方面也表明現(xiàn)有的進展期胃癌的治療方式包括擴大切除范圍及淋巴結(jié)清掃范圍、 術(shù)后化療均無法使 5 年以上生存率顯著提高， 對于病期較晚的進展期胃癌， 腫瘤給機體帶來的往往已不再是一個局部問題 ,學(xué)術(shù)界對此初步達(dá)成了兩個共識： 單純外科手術(shù)無法達(dá)到生物學(xué)意義上的根治， 即便擴大切除和淋巴結(jié)清掃范圍， 仍然如此； 未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者， 姑息切除的效果較之未手術(shù)者好。 能否根治性切除是胃癌患者最重要的預(yù)后因

3、素之一，直接影響預(yù)后 5 ， 6 。但是手術(shù)對于進展期胃癌的治療效果并不理想，術(shù)后 5年生存率往往較低，特別是對于田B和IV期的晚期胃癌患者，往往只能進行姑息性手術(shù)， 術(shù)后局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生率仍可高達(dá) 60% 以上 7 ，是治療失敗的主要原因。大量事實證明，惡性腫瘤病變初期的治愈率是相當(dāng)高的 8 。所以治愈腫瘤的關(guān)鍵是早期診療技術(shù)的成熟和實施。分子生物學(xué)理論和技術(shù)在胃癌研究工作中的應(yīng)用， 使得人們從基因分子水平對胃癌的發(fā)生、診斷、治療有了新的思路。因此，從分子水平上探究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機制，提高早期胃癌的檢測水平，具有重要的學(xué)術(shù)價值和臨床意義。最近的研究表明， 腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個涉及多基因、

4、多分子水平改變的復(fù)雜過程,包括瘤細(xì)胞的脫落、遷移、粘附、生長等不同步驟。從原發(fā)部位脫落和向它處遷移,需要瘤細(xì)胞間粘附力降低9,10 。 細(xì)胞粘附分子家族是介導(dǎo)細(xì)胞粘附作用的一大類分子,尤以上皮鈣粘蛋白 (epithelial-cadherin,E-cad) 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用令人矚目。 上皮型鈣粘蛋白 (E-cad) 廣泛分布于上皮組織， 是基因 CDH1 編碼的一類介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間相互粘附、具有維持組織結(jié)構(gòu)完整性和極性的鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)同種細(xì)胞間粘附反應(yīng)。相對分子量為 120 KD ，基因定位于染色體16q22.1 。 E-cad 的前體是 135 KD 的多肽， 合成后很快

5、在高爾基體上加入碳水化合物成為成熟的多肽并被釋放到細(xì)胞表面并迅速定位于細(xì)胞接觸， 從而介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的同種連接。 在細(xì)胞外鈣離子參與下介導(dǎo)同種親和性細(xì)胞間的粘附和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附， 保證上皮細(xì)胞緊密有序聚集， 抑制移動。當(dāng)其表達(dá)下調(diào)或功能障礙時，將使同種細(xì)胞失去粘附，對于上皮源性腫瘤而言，則意味著腫瘤細(xì)胞具備侵襲性生長的特點， 并容易從原發(fā)病灶脫落分離， 向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 11,12 。DNA 甲基化是指DNA 雙螺旋中胞嘧啶核苷的嘧啶環(huán)5 位碳原子發(fā)生甲基化，并與其3端的鳥嘌呤形成CpG ，且在雙鏈對稱出現(xiàn)， 60% 的表達(dá)基因的啟動子內(nèi)含有CpG 重復(fù)序列，這種富含 CpG

6、 序列的 DNA 片段即被稱為 CpG島。近來研究出甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP) 方法 ,其原理是用亞硫酸氫鹽對DNA進行處理后，DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,而如果被檢測資料. 資料基因已經(jīng)發(fā)生CpG 島甲基化，則不能發(fā)生這種轉(zhuǎn)化，設(shè)計不同的引物做PCR,即可檢測出這種差別，從而確定目的基因有無 CpG 島甲基化，此方法 DNA 需要量極少， 敏感性高， 為基因 CpG 島甲基化研究提供了有效的方法。 目前認(rèn)為：基因表達(dá)與CpG 島甲基化程度呈負(fù)相關(guān)13,14 。DNA 甲基化異常分為甲基化增強和甲基化減弱兩種類型，可引起與細(xì)胞增殖和分化等有關(guān)的基因

7、表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞惡變，最后形成腫瘤。 DNA 異常甲基化導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的可能機制如下 15 ， 16 ： 首先， 在正常情況下非甲基化的 CpG島的高甲基化，可以導(dǎo)致腫瘤抑制基因的失活。其次， DNA 甲基化可以促進腫瘤相關(guān)基因的突變， 是腫瘤相關(guān)基因甲基化促進細(xì)胞惡變的一種機制。 另外， 癌基因的低甲基化也可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)17 。 DNA 異常甲基化在腫瘤發(fā)生中起著極為重要的作用， 它主要表現(xiàn)為抑癌基因高甲基化所致的基因失活和原癌基因低甲基化所致的基因激活， 引起與細(xì)胞增殖、 分化相關(guān)基因的表達(dá)異常， 造成細(xì)胞惡性變形成腫瘤18 ， 19 。 由于 DNA 局部甲基化增強在腫瘤中最常見，

8、與腫瘤的關(guān)系比較明確， 被認(rèn)為是腫瘤抑制基因失活的重要途徑， 研究取得的進展也報道的最多。1.2 研究目的：從 DNA 、 RNA 和蛋白水平綜合分析胃癌中 E- cadherin 基因表達(dá)2） 闡明 E- cadherin 在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制（ 3）分析胃癌患者臨床病理資料，探討E- cadherin 對胃癌預(yù)后的影響。 。研究意義：目前為止，E-鈣粘蛋白在多種癌組織中表達(dá)不穩(wěn)定或低表達(dá)，并且與月中瘤細(xì)胞低分化相關(guān)已得到證實。 但在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用及其分子調(diào)控機制也尚不清楚。聯(lián)合檢測 DNA 水平、 mRNA 水平及蛋白水平的表達(dá)，探討E-cadherin 與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的

9、相互關(guān)系，國內(nèi)外報道較少。本課題通過研究癌旁正常組織和胃癌中 E- cadherin 的 DNA 、 RNA 和蛋白水平的表達(dá)，來探討E-cadherin 在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移構(gòu)成中的作用機制和調(diào)控機制，同時針對臨床病理特征的相關(guān)性及它們間的相互關(guān)系的研究， 來探討 E- cadherin 在胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用。 以期為胃癌的早期診斷和早期治療提供理論依據(jù)， 從而指導(dǎo)臨床工作。基本內(nèi)容：1）分別應(yīng)用免疫組化 SP 法檢測 60 例胃癌組織和癌旁組織中的 E-cad 蛋白表達(dá)。2）應(yīng)用MSP 法檢測 60 例胃癌組織和癌旁組織中 E-cadDNA 甲基化水平3）原位雜交檢測60 例胃癌組織和癌

10、旁組織中的 E-cad mRNA 表達(dá)4）分析臨床病理資料，探討E- cadherin 在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及對預(yù)后的影響。2 研究方案：研究材料選取 * 醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收集胃癌手術(shù)新鮮標(biāo)本* 例（每例標(biāo)本取材均包括癌組織和癌旁組織，癌旁組織選取距癌6-8cm 、肉眼觀相對正常處，術(shù)前均未行放、 化療， 離體時間不超過30 分鐘） ， 所有癌旁組織標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤。主要試劑鼠抗人E-鈣粘蛋白單克隆抗體、SP試劑盒，組織基因組DNA提取試劑盒,TaqDNA 聚 合 酶 、 DNAMarker 。 亞 硫 酸 氫 鈉 ( sodiumbisulfite ) 、 氫 醌( hydrogui

11、none ) 。研究方法(1)甲基化檢測:進行 DNA 修飾及純化。甲基化特異性引物( M )上游引物： 5 GGT GAA TTT TTA GTT AAT TAG CGG TAC 3；下游引物：5CATAAC TAA CCG AAA ACG CCG 3。非甲基化特異性引物(U)上游引物：5 GGT AGG TGA ATT TTT AGT TAA TTA GTG GTA 3，下游引物：5ACCCAT AAC TAA CCA AAA ACA CCA 3 。甲基化特異PCR反應(yīng):反應(yīng)體系25此 反應(yīng)條件：95C預(yù)變性5 min, 94 c變性30s,54 c退火30s,72 c延伸70分鐘，終末延

12、伸72 c延伸7min。取10仙1PCFT物，力口 2小止樣緩沖液，混勻加入上樣孔中，將同標(biāo)本的甲基化與非甲基化 PCR 產(chǎn)物放同一組進行電泳。電泳條件： 80V ，室溫下電泳30 分鐘，觀察結(jié)果并攝影。(2)原位雜交檢測：石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，固定后加雜交液恒溫箱3842 c過夜，洗滌后，滴加鼠抗地高辛及SABC-AP 后染色， 37 顯色 20 分鐘，充分水洗，核固紅復(fù)染。(3)免疫組化染色：常規(guī)3叩連紋切片、脫蠟，并嚴(yán)格按試刑盒推薦的程序進行DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明并封片。用PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。( 4 )結(jié)果判定：E-cadherin 甲基化特異性引

13、物擴增出相應(yīng)長度(204bp)的片段，判斷甲基化陽性；E- cadherin 非甲基化特異性引物相應(yīng)長度(211bp)的片段，判斷甲基化陰性。E-cadmRNA 均采用不加探針標(biāo)本作陰性對照，采用博士德公司贈送的陽性切片做陽性對照。E-cadmRNA 的細(xì)胞漿著色呈藍(lán)色。E-cad 蛋白采用 PBS 代替一抗作為陰性對照，采用已知的陽性標(biāo)本作為陽性對照。染色強度計分與陽性細(xì)胞百分比乘積3者為陽性染色結(jié)果，由兩名病理科醫(yī)師采用雙盲原則評定。（ 5）隨訪：采用信函和電話調(diào)查的方式進行術(shù)后隨訪，隨訪時間5 年，隨訪調(diào)查問卷內(nèi)容包含有術(shù)后復(fù)查情況、 有無術(shù)后放化療， 有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移， 有無新發(fā)疾病及合并

14、癥等，所有患者每3 個月查腫瘤標(biāo)記物，每6 個月行 CT 檢查，每年 1 次內(nèi)鏡檢查。3 研究時間安排2007.7-2008.4 準(zhǔn)備階段： 查閱文獻(xiàn)資料， 了解研究動態(tài)， 確定研究內(nèi)容，完成開題報告，采集胃癌組織及癌旁組織病理標(biāo)本。2008.4-2009.4 制定研究方案，確定研究方法，開展研究工作。2009.4-2013.7完善研究工作，匯總資料、整理數(shù)據(jù)，分析取得研究結(jié)果。2013.7-2014.5撰寫研究報告、論文；準(zhǔn)備成果鑒定、上報等。4 參考文獻(xiàn)Parkin DM, Bray F, Ferlay J , et a1 . Global cancer statistics, 2002

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