凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1、 實(shí)驗(yàn)三 凝膠過(guò)濾層析法 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 【目的要求】掌握凝膠層析的基本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)技能 【原理】 凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離的技術(shù)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動(dòng)，因此流程較短，移動(dòng)速度快；所以首先流出。相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，因此流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們?cè)谀z顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所

2、以它們流出的時(shí)間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。圖3 -1 凝膠層析分離原理示意圖 【基本概念】外水體積、內(nèi)水體積、柱床體積 、洗脫體積 外水體積（Vo）是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積（Vi）是指凝膠顆粒中孔穴的體積。柱床體積 是（Vt）凝膠柱所能容納的總體積?！净靖拍睢?洗脫體積（Ve）是指將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。它包括自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。 對(duì)于完全排阻的大分子由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，

3、 故其洗脫體積 Ve Vo 對(duì)于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故其洗脫體積 Ve Vt 分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。 圖3 -3 凝膠層析柱洗脫曲線示意圖 完全排阻的大分子 中等分子 完全滲透的小分子 洗脫體積的測(cè)定 外水體積（Vo）：可以通過(guò)測(cè)定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來(lái)測(cè)定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。 內(nèi)水體積（Vi）：可以通過(guò)測(cè)定完全滲透的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）的洗脫體積來(lái)測(cè)定 即 VeVoVi 推出 Vi Ve Vo 柱床體積（Vt）： 1)可用下式計(jì)算： Vt（D/2）2h 2）根據(jù) VtVoVi 可以

4、得到 3）加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測(cè)量水的體積。分配系數(shù)表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。 Vo 和Vt可以通過(guò)測(cè)定得到，測(cè)定了某個(gè)組分的Ve 就可以得到這個(gè)組分的分配系數(shù)。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。 大分子先從柱中流出Ve值小Kav值小 小分子后從柱中流出Ve值大Kav值大Kav Ve VoVt Vo Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)。 對(duì)于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 對(duì)于完全滲透的小分子 Ve Vt 故 Kav 1 Kav是判斷分離效果的一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)也是測(cè)定蛋白

5、質(zhì)分子質(zhì)量的一個(gè)依據(jù)。 對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系： Kav blgMr+c 由于Ve 和Kav也成線性關(guān)系所以同樣有： Ve blgMr+c 通過(guò)將一些已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定Ve 或Kav，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下測(cè)定未知樣品的Ve 或Kav，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子質(zhì)量。吸水率和床體積吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。Sephadex G-25200 數(shù)字是吸水率10 例如Sephadex

6、 G-75 吸水率 7.5ml/g 床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積 例如SephadexG-75 床體積 1215 ml/g 干膠用量(g) = 柱(ml)床體積/凝膠床體積(ml/g)【應(yīng)用】生物大分子的純化分子量測(cè)定脫鹽及去除小分子雜質(zhì)去熱源物質(zhì) 溶液的濃縮【操作方法】一、凝膠的選擇和處理量取110mL Sephadex G-75于250 mL燒杯中，加入洗脫液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆?？障吨械目諝?。 二、裝柱 1）取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。 2）凝膠柱床總體積（Vt）的測(cè)定：在距柱上端約5處作一記號(hào)，關(guān)閉柱出水口，加入蒸餾水，打開(kāi)出水口

7、，液面降至柱記號(hào)處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接收柱中蒸餾水，讀出的體積即為柱床總體積Vt 。 3）向柱內(nèi)加入約1/4柱體積的洗脫液，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約23高度后打開(kāi)出水口，待膠面上升到柱記號(hào)處時(shí)則裝柱完畢。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲(chǔ)液瓶連接，調(diào)流速36mL/10min，用 23倍柱床體積的洗脫液平衡。三、Vo 的測(cè)定打開(kāi)柱上端的塞子，待柱內(nèi)洗脫液下降至與凝膠膠面相切時(shí)，關(guān)閉出水口。用細(xì)滴管吸取1 mL藍(lán)色葡聚糖-2000液，小心地繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入，打開(kāi)出水口（開(kāi)始收集），待溶液完全滲入柱床后，關(guān)閉出

8、水口，取1mL洗脫液沿管壁洗柱一次，等溶液完全滲入柱床，柱上端再加入幾毫升洗脫液，將柱上端接口與儲(chǔ)液瓶連接，打開(kāi)出水口，開(kāi)始洗脫。收集藍(lán)色葡聚糖-2000洗脫峰，測(cè)出洗脫體積Ve ，得出Vo值。 1）用洗脫液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（牛血清蛋白、雞卵清蛋白、溶菌酶）。 2）按上述方法加入1mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液，以3mL/10min 的速度洗脫并收集洗脫液體積。 3）分別收集各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫峰（靈敏度），測(cè)量它們的洗脫體積Ve。代入公式計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Kav值。 4）以Kav值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)lgMr為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 五、未知樣品蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定將待測(cè)待測(cè)雞卵粘蛋白樣品配制成5mg/mL溶液,以下步驟完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。根據(jù)紫外檢測(cè)的洗脫峰位置，量出洗脫體積Ve ，代入公式計(jì)算待測(cè)蛋白的Kav值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得lgMr，其反對(duì)數(shù)便是未知樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。樣品Mr1gMre VtKav牛血清蛋白67，0004.8261雞卵清蛋白45，0