8 細(xì)胞骨架的觀察

1、實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞骨架微絲的 光學(xué)顯微觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康母攀鰧?shí)驗(yàn)原理儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題下一次實(shí)驗(yàn)預(yù)告1 實(shí) 驗(yàn) 目 的掌握用考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察植物細(xì)胞內(nèi)微絲的方法。 細(xì)胞骨架的觀察2微絲概述細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，包括微絲（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）、中間纖維（intermediated filament，IF）。細(xì)胞（特別是真核細(xì)胞）中的骨架系統(tǒng)，不僅僅是活細(xì)胞的支撐結(jié)構(gòu)，決定細(xì)胞的形狀，

2、而且與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)、細(xì)胞分化、極性生長(zhǎng)等生命活動(dòng)密切相關(guān)。觀察骨架方法？3實(shí) 驗(yàn) 原 理 本實(shí)驗(yàn)觀察由微絲平行組成的纖維束，當(dāng)細(xì)胞充分鋪展時(shí)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色可看到沿細(xì)胞一定方向伸展的纖維束?？捡R斯亮藍(lán)R250可以染各種蛋白，并非特異染微絲，實(shí)驗(yàn)中用1%Triton X-100抽提掉胞質(zhì)中的蛋白（除骨架蛋白外），能清楚地顯示微絲束呈深蘭色。（？） Mg2+ 高濃度Na+ K+誘導(dǎo) G-actin F- actin 含ATP Ca2+ 低Na+ K+ 細(xì)胞骨架的觀察4儀器、材料與試劑儀器：光學(xué)顯微鏡材料：植物洋蔥每二人一套的用具:平皿或試管，

3、鑷子 、吸管；每人一套的用具:載玻片（為區(qū)別細(xì)胞的正反面，作個(gè)標(biāo)記 ) 蓋玻片、吸水紙等。試劑 (1) 磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH .）， (2) 0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）， (3) M-緩沖液， (4) 1Triton X-100（用M-緩沖液配） (5) 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250， (6) 3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制） 細(xì)胞骨架的觀察5M緩沖液配方咪唑（Ph6.7） 3.4gKCl 3.73gMgCl26H2O 0.10gEGTA 0.38gEDTA2H2O 0.04g巰基乙醇 70l甘油 294.8ml水定容 1000ml6 實(shí) 驗(yàn) 步

4、驟 1）取PBS液4ml培養(yǎng)皿中,再駁取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約1cm2若干片，放入盛有磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中（每二人用一個(gè)容器）。 2）吸去緩沖液，用1%TritonX-100 4ml處理洋蔥表皮25-40 min。 3）除去TritonX-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約10 min 4）加3.0%戊二醛固定液4ml（用0.2 mol/L的磷酸緩沖液pH 6.8配制） 固定0.5h 。 5）用PBS洗3次，濾紙吸去殘留液體。 6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。 7）用蒸餾水洗數(shù)遍，降低背景。 8）將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。 9）結(jié)果：微絲束呈深藍(lán)色 細(xì)胞骨架的觀察7實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 及 思 考 題1 畫(huà)出所觀察到的微絲圖像。2 說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)中1%TritonX-100處理細(xì)胞的作用是什么？3 說(shuō)明M-緩沖液的作用是什么？ 細(xì)胞骨架的觀察8 光