谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性檢測

1、 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定一、實驗目的1.掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的臨床意義。1二、基本原理 血清中的谷-丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），在37、pH7.4的條件下，可催化基質(zhì)（底物）液中的丙氨酸與-酮戊二酸反應生成谷氨酸和丙酮酸： 2生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關系。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標準液相比較，便可算出或通過標準曲線查出血清中A

2、LT的活性。34* 儀器1. 515cm試管、刻度吸量管。2. 恒溫水浴、離心機、721型分光光度計。* 試劑1.0.1mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取Na2HPO414.22g或Na2HPO42H2O17.8g溶 解于蒸餾水中，并稀釋至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀釋至1000ml, 4保存。將0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液80ml混和即 為0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。加氯仿數(shù)滴，4保存。三、儀器與試劑 52. 標準丙酮酸（含丙

3、酮酸2.0mol/mL） 取標準丙酮酸鈉10mg，用上述緩沖液準確定容為50mL。此液須當日用當日配。3. ALT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml) 取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用試劑1溶成100ml，在稀釋到刻度前，以1mol /L NaOH調(diào)pH至7.4（因為轉(zhuǎn)氨酶在pH7.3以下或7.6以上的環(huán)境中酶活性下降），加數(shù)滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。4. 2.4二硝基苯肼溶液 取分析純2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol /L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。5. 0.4mol/L NaOH溶液 常規(guī)配制。61、血清樣品制

4、備 取雞血100mL于4oC靜置10hr，后經(jīng)離心分離得到血清， 保存于冰箱中待用(由于血細胞中轉(zhuǎn)氨酶活性較血清中 高，故應防止溶血；若血清中此酶活性過高，則可適 當稀釋后再用) 。2、標準曲線制作 取6支干燥潔凈的試管，按下表操作，得出實驗結(jié)果。 以吸光度值為縱坐標，酶活力單位數(shù)為橫坐標，在坐標 紙上繪制標準曲線。四、實驗操作 783、血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定 取4支干燥潔凈試管，按下表操作（血清和底物溶液 事先保溫10min）：9五、實驗結(jié)果 1、將得出的吸光值在標準曲線上查得酶活性2、計算： 丙酮酸物質(zhì)的量（mol） SGPT活性單位/100mL= 1000 時間（min）101.

5、在測定SGPT時，應事先將底物、血清在37水浴中 保溫，然后在血清管中加入底物，準確記時。2. 標準曲線上數(shù)值在20500U是準確可靠的，超過 500U時，需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于L氨基酸，對D氨基酸無 作用。實驗室多用DL氨基酸（較L氨基酸 價廉），若用L氨基酸，則用量減半。4. 溶血標本不宜使用，因血細胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高， 會影響測定效果。5. 血清樣品的測定需在顯色后30分鐘內(nèi)完成。六、注意事項 116.丙酮酸標準液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開封后易 變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標準液的有效濃度而不 易察覺。建議使用質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標準液。7.每批試劑的空白管吸光度

6、上下波動不應超過0.015A，若有 超出，應仔細檢查試劑與儀器方面的問題。8.嚴重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標本 可增加測定的吸光度，測定這類標本應做血清標本對照管12* 1個卡門氏單位的定義是：在溫度25，pH7.4，波長340nm，光徑1cm 的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性。* 國際單位：在最適溫度（25）下，1分鐘產(chǎn)生1mol丙酮酸的酶量為1個活性單位，即1IU=1umol/min。* King法單位定義是：每1ml血清在37條件下與底物作用60 min，生 成1mol丙酮酸稱為一個單位。 * Mohun 法單位定義是：每毫升血清在pH=

7、7.4，37條件下與底物作用 30 min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。七、酶活性單位的定義 13六、臨床意義 化驗介紹: 正常時，谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于組織細胞內(nèi)，以肝細胞含量最多，心肌細胞中含量其次，只有極少量釋放血中。所以血清中此酶活力很低。當肝臟、心肌病變、細胞壞死或通透性增加時，細胞內(nèi)各種酶釋放出來，使血清中此酶活性升高。所以測定血清中此酶的含量可作為診斷、鑒別診斷及預后觀察的依據(jù)。 臨床意義: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的增高意義較大，其增高程度可反映肝細胞損害和壞死的程度。 14（1）肝膽疾?。杭毙圆《拘愿窝?，ALT是最為敏感的指標之一，會出現(xiàn)明顯升高。慢性肝炎血清ALT升高一般不超過參考值的3倍，而且有時可降至正常。慢性活動性肝炎血清ALT可升高至參考值的35倍以上?；顒有瓦M行性肝硬化時ALT可中輕度升高，但在代償期可正?；蛏栽龈??；荚l(fā)性肝癌時，ALT可正?；蛑休p度升高。膽道疾病如膽石癥引起梗阻時，雖無肝細胞病變，但ALT可稍升高。 （2）其他疾?。盒募」Ｈ靶墓δ懿蝗珜е赂斡傺墒笰LT明顯升高。骨骼疾病、多發(fā)性肌炎、肌營養(yǎng)不良