組織切片技術(shù)

1、組織切片技術(shù)第一章組織制片概述組織制片技術(shù)是觀看細(xì)胞、組織的生理和病理形態(tài)變化的一種主要的方法。組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交技術(shù) 都是以組織制片為基礎(chǔ)的。一、制片前的預(yù)備工作1 ,染色缸和標(biāo)本瓶的清洗用毛刷沾去污粉將染色缸和標(biāo)本瓶里外擦洗，自來(lái)水沖洗潔凈備用。金屬銀或組織化學(xué)染色時(shí)，器皿更要 徹底清洗。先去污粉洗，再洗液浸泡過(guò)夜，再自來(lái)水和蒸儲(chǔ)水沖洗。洗滌液的配制：重倍酸鉀300克 濃硫酸300毫升 蒸儲(chǔ)水3000毫升2.載玻片和蓋玻片及其清洗載玻片簡(jiǎn)稱為玻片或載片，一般尺寸為76毫米義26毫米，厚度為5毫米。蓋玻片一般為正方形或長(zhǎng)方形，厚度為0.15-0.5毫米。最常用的規(guī)格為18X18毫米、20

2、X20毫米，還有 其它規(guī)格的。煮沸洗滌法：新舊玻片均可采納。洗衣粉水浸沒(méi)玻片，加熱煮沸15-20分鐘，冷卻，自來(lái)水沖洗，潔凈的 白棉布或紗布擦干，保存?zhèn)溆?。酒精浸泡擦拭：新的玻片或載片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存?zhèn)溆?。洗液浸泡法：要求?yán)格的玻片，可在洗液浸泡后在沖洗潔凈。二、制片方法的種類（一）非切片法不用切片機(jī)、沒(méi)有切片手續(xù)而制成切片的方法。常用的有以下幾種:.整體封藏法 待制作的材料一般很小或?yàn)橐槐∑瑺睿鐭o(wú)脊椎動(dòng)物的水蛆和草履蟲(chóng)等，脊椎動(dòng)物的雞胚 和蛙胚等。這些材料取下后經(jīng)固定、脫水和染色就可以封藏在玻片內(nèi)。.涂片法 主要是液體或半流淌性的材料，如血液、精液、細(xì)胞學(xué)檢查、微生物等,直接將

3、材料涂在玻片 上，再經(jīng)固定和染色制成標(biāo)本。血液涂片的制作與染色：取一潔凈載玻片，用左手拇指和食指夾住，然后取一小滴動(dòng)物血置于載玻片右端， 再取另一張邊緣光滑的載玻片，斜置于血滴左側(cè)，先向右稍移動(dòng)輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端綻開(kāi)成線狀，兩 玻片的角度以3040。為宜（角度過(guò)大血膜較厚，角度小那么血膜?。p輕將載玻片向左推動(dòng)，即涂成血液薄膜，推 動(dòng)時(shí)速度要全都，否那么血膜成波浪形，厚薄不勻.待涂片在空氣中完全干燥后，將血涂片靠近中心局部的兩邊（與 載玻片短邊平行的邊）用玻璃鉛筆圈上并平放在染色架上進(jìn)行染色。滴加數(shù)滴瑞特氏姬姆薩（Wright，s.Giemse） 混合染液掩蓋已圈血膜，同時(shí)記住滴數(shù)

4、，染3-5分鐘。滴加等量的蒸儲(chǔ)水后稍加晃動(dòng)玻片連續(xù)染色5-10分 鐘。用蒸儲(chǔ)水或自來(lái)水沖去染液（留意還要直接沖洗己圈部位），吸水紙吸干或涼干即可觀看。.撕片法疏松結(jié)締組織和腸系膜等就是采納這種方法。.磨片法主要用于含鈣鹽較多的堅(jiān)硬的材料，如脊椎動(dòng)物的牙齒和骨。.撕碎法.壓碎法.印片或觸片法（二）切片法使用切片機(jī)切片而制成切片的方法。常用的有以下兒種：.石蠟切片法、冰凍切片法、振動(dòng)切片法、超薄 切片法第二章石蠟切片技術(shù)第一節(jié)取材和固定制作切片的第一步就是把動(dòng)物殺死，取下需要制作切片的材料動(dòng)物殺死的方法許多。依據(jù)動(dòng)物的大小、 種類及觀看目的而定。例如，青蛙和小鼠等較小的動(dòng)物可用斷頭法。一些較大的動(dòng)

5、物如兔子和貓等可用空氣栓 塞法，從耳靜脈注射入空氣，使動(dòng)物心臟發(fā)生急性空氣栓塞，循環(huán)障礙，痙攣而死。此種方法各臟器易瘀血。 也可采納撲殺法。無(wú)論那種方法都應(yīng)當(dāng)使動(dòng)物快速死亡。動(dòng)物殺死后馬上取材和固定，否那么組織會(huì)因失水變形和發(fā)生死后變化。一、取材.動(dòng)物屠宰前應(yīng)寫(xiě)好程序，預(yù)備好刀子、剪子、鏡子、線、注射器、生理鹽水、固定液等。固定液的量一 般為材料的10-15倍或稍多。.取材留意事項(xiàng) 取材的刀、剪要銳利；動(dòng)作要輕，不行來(lái)回切割，不要擠壓組織以免損傷內(nèi)部，先用鐐 子輕輕夾住，再用剪子或刀子切下，被躡子夾過(guò)的局部不要；松軟的組織可取稍大些，固定數(shù)小時(shí)后再切成小 的組織塊，連續(xù)固定；取材要快；切取的材

6、料應(yīng)依據(jù)需要觀看的部位進(jìn)行選擇，考慮好切面的方向。.取材的挨次 先取簡(jiǎn)單自溶的組織，骨骼和肌肉后取，依次為心臟、肺、肝、脾、腎、小、大腸、腎上 腺、睪丸、卵巢、子宮、腦垂體等。取腸時(shí)可用生理鹽水輕輕沖洗腸內(nèi)容物，然后結(jié)扎一端，注入固定液，再結(jié)扎另一端，固定3小時(shí)后再切 成小段。肺臟可用少量固定液自氣管或支氣管注入，約20分鐘后略膨脹再切成薄片固定。.取材的大小取材的大小一般為0.5義0.5（）.3厘米，1乂1*（）.3厘米，最厚不超過(guò)0.5厘米。 取材很關(guān)鍵，應(yīng)新奇、快速。二、固定將取下的材料，馬上投入固定劑內(nèi)，借助藥品的作用，使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存起來(lái)。（-）固定的目的.防止組織的溶解和腐

7、敗。.使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪，糖、酶類等各種物質(zhì)沉淀下來(lái)，保存組織細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)。.固定劑兼有硬化作用，使組織硬化、增加硬度，使組織不易變形，有利于以后的處理。（二）固定劑的種類種類許多，一般分為單純固定劑和混合固定劑。單純固定劑是用一種藥品作為固定劑的如乙醇、甲醛等， 混合固定劑是用幾種藥品協(xié)作起來(lái)，可以使各自的優(yōu)點(diǎn)相互補(bǔ)充。.單純固定劑1）乙醇一無(wú)色的液體，可以與水以任何比例混合。具有以下特點(diǎn)：穿透速度快，與其他固定液混合使用時(shí)可以增加他們的穿透力。酒精固定的組織硬化顯著，體積收縮厲害，組織在高濃度酒精中滯留過(guò)久，會(huì)變脆，體積縮小原體積的20%左 右。通常用95%或100%的酒精固定，但是

8、不宜放置過(guò)久，一般保存在70%酒精。酒精是一種還原劑，易被氧化成乙醛，再變?yōu)榇姿幔圆荒芘c銘酸、重銘酸鉀、鉞酸等氧化劑混合。酒精可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前二者生成的沉淀不溶于水，后者所生的沉淀那么溶于水，所以酒精固定 的標(biāo)本對(duì)核的染色不良。2）甲醛一是一種氣體，一般市售的為37-40%的甲醛水溶液或者稱福爾馬林，易揮發(fā)，有猛烈的刺激性氣 味。福爾馬林固定組織，滲透力強(qiáng)，組織收縮少，但經(jīng)酒精脫水時(shí)收縮很大，它能使組織硬化并增加組織的彈性。 甲醛為非沉淀性固定劑，但是可與蛋白質(zhì)化和，對(duì)脂肪、神經(jīng)及髓鞘的固定效果較好，也可固定高爾基復(fù) 合體和線粒體，為一般病理制片常用。固定后，核的染色較好，

9、胞漿染色較差。適合固定的濃度：10%的福爾馬林。固定小塊組織數(shù)小時(shí)即可，時(shí)間長(zhǎng)也沒(méi)有關(guān)系。加熱可縮短固定時(shí)間。對(duì) 于較長(zhǎng)時(shí)間固定的組織須流水沖洗24小時(shí)甚至48小時(shí)，否那么會(huì)影響染色效果。由于福爾馬林防止久，能 產(chǎn)生三聚甲醛白色沉淀，在高溫下可變回甲醛，甲醛易氧化，變成乙酸，使溶液變?yōu)樗嵝?，增加?biāo)本的酸 性，嚴(yán)峻時(shí)影響核的染色。可用如下方法保持中性甲醛：福爾馬林100毫升， 蒸儲(chǔ)水 900毫升，一水磷酸二氫鈉4克， 磷酸氫二鈉 6.5克3）醋酸17c以下結(jié)冰，又稱冰醋酸。此液能凝固細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)，適合染色質(zhì)或染色體的固定，穿透 力強(qiáng)，對(duì)于一般的組織塊，只需固定1小時(shí)。此液可使細(xì)胞膨脹，防止收

10、縮；不能凝固細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，所以不會(huì)使組織硬化，常和酒精、福爾馬林等 簡(jiǎn)單引起組織變硬和收縮的液體混合。4）苦味酸一-是一種黃色結(jié)晶，在水中的溶解度為0.9-L2%,在空氣中能自燃，在封閉容器中能猛烈爆炸, 故在試驗(yàn)室中常配成飽和水溶液保存。易溶于酒精、二甲苯、苯、水?？辔端峥沙恋硪磺械鞍踪|(zhì)，它對(duì)類脂物、碳水化合物無(wú)作用。此固定液對(duì)細(xì)胞收縮明顯，收縮程度可達(dá)50% 以上，但是不使組織變硬；穿透速度慢。經(jīng)苦味酸固定的組織不用水洗，可直接用70%的酒精洗去黃色，即使 留些顏色也無(wú)阻礙。固定時(shí)間不宜過(guò)久，否那么影響蘇木精堿性染料的染色。2 ,混合固定劑DBouin氏液：苦味酸飽和水溶液75毫升 福爾

11、馬林25毫升 冰醋酸5毫升。是一種良好的固定劑，一般組織學(xué)和胚胎學(xué)的材料均可固定，該液滲透力強(qiáng)，固定勻稱，組織收縮少，可把 一般的微細(xì)結(jié)構(gòu)顯示出來(lái)。一般組織固定12-24小時(shí)，小塊組織數(shù)小時(shí)。2） Carnoy氏液：純酒精60毫升 冰醋酸10毫升 氯仿30毫升。此液穿透速度快，達(dá)快組織不超過(guò)3-4小時(shí)，小塊組織20-40分鐘，時(shí)間久了，會(huì)使組織膨脹并有硬化現(xiàn) 象。多用于細(xì)胞學(xué)制片，固定染色體、中心體、有絲分裂相等；對(duì)外膜致密的組織特殊適合，也適于腺體和淋 巴組織。第二節(jié)洗滌和脫水一、洗滌材料從固定液中取出后，需要馬上沖洗使其中含有的固定液全部除去。否那么留在組織中的固定液，有的可阻 礙染色，有

12、的可以發(fā)生沉淀物或結(jié)晶影響觀看，有的可連續(xù)發(fā)生作用，使材料變壞或使以后的處理發(fā)生困難。 沖洗有肯定的原那么，視固定劑的種類而異：.含有苦味酸的固定液，如Bonin氏液，倒去固定液入70%的酒精更換數(shù)次即可脫水。如想除去苦味酸的 黃色，可在70%的酒精中加入少量的氨水（數(shù)滴），且能中和苦味酸，更換數(shù)次新液。.福爾馬林固定的組織，一般不需要沖洗，固定時(shí)間長(zhǎng)期的標(biāo)本肯定要充分水洗，否那么會(huì)影響染色，一般 自來(lái)水沖洗12-24小時(shí)。.含有銘酸、重鋁酸鉀的固定劑，必需流水沖洗，沖洗時(shí)間與固定時(shí)間相同或多于固定時(shí)間。.如固定液中含有氯化汞，應(yīng)依據(jù)溶液的性質(zhì)用水或酒精沖洗，沖洗后必需在70%的酒精中加碘去汞

13、（一 般為0.5%的碘酒精），去汞后再用5%的硫代硫酸鈉去除碘的黃色。由于汞易在組織內(nèi)形成結(jié)晶不利于切片，不 利于觀看。,鉞酸及含有鍍算的固定液，必需用流水沖洗。由于鉞算能使組織發(fā)黑，影響染色，經(jīng)過(guò)酒精時(shí)形成沉淀。.用酒精或酒精混合液固定的組織，一般不要求沖洗，假設(shè)沖洗，酒精濃度應(yīng)與固定液酒精濃度相同，不行 用水沖洗。二、脫水（一）脫水的目的和重要性組織沖洗完畢后進(jìn)一步就是脫水。由于組織經(jīng)固定和洗滌后含有多量水分，由于水分不能和石蠟或火棉 膠等支持劑混合，組織內(nèi)有極少量的水分存在，就會(huì)阻礙這些支持劑的滲入，所以必需把組織中的水分徹底 去除，這一步驟稱為脫水。脫水的作用：有利于組織的透亮和透蠟。

14、由于透亮劑（二甲苯、氯仿）必需在組織完全無(wú)水的狀況下才能滲入；水不能與包埋劑混合。脫水有利于組織的永久保存，水的存在能使組織分解。這 是制片中相當(dāng)重要的一個(gè)步驟，假如這一步驟沒(méi)有把握好，脫水不徹底，就會(huì)影響到組織的透亮和透蠟，即使包埋好的材料也切不出好的切片，鋪張材料和時(shí)間。（二）脫水劑和方法脫水劑必需在任何比例下與水都能混合，主要有兩種類型：.非石蠟溶劑的脫水劑 如酒精、丙酮等，組織在脫水后必需經(jīng)二甲苯透亮才可浸蠟。1）乙醇一常用的脫水劑，價(jià)格低廉，方法簡(jiǎn)單把握。但是能收縮和硬化組織，還必需透亮后才能透蠟。脫水方法：一般組織可從70%酒精開(kāi)頭，經(jīng)過(guò)80%、90%、95%、100%酒精，使其逐

15、步脫水。對(duì)一些松 軟的組織如胚胎需 從20%、30%或50%開(kāi)頭，否那么組織收縮較大。脫水的時(shí)間依據(jù)組織塊的種類、體積大小而定。高濃度酒精一般不超過(guò)2小時(shí)，最長(zhǎng)不超過(guò)3-4小時(shí)。脫水必需潔凈，在換入高一級(jí)的酒精時(shí)，要先在吸水紙上吸干以免把水分帶入高一級(jí)的酒精中，夾持組 織動(dòng)作要輕，不要損壞組織。2）丙酮一可代替酒精做脫水劑，作用和酒精相像。脫水力量比酒精強(qiáng)，但組織收縮較大，多用于快速脫 水或固定兼有脫水的方法中。.脫水兼石蠟溶劑的脫水劑 如正丁醇、叔丁醇等，組織在脫水后可直接透蠟，不需要中間二甲苯透亮 的步驟。1） .正丁醇一黃色液體，易揮發(fā)，吸入后發(fā)生頭痛，脫水力量弱，但收縮小，可與水和酒精

16、混合，能溶解 石蠟，可不經(jīng)過(guò)透亮直接浸蠟。脫水程序是：經(jīng)過(guò)各級(jí)酒精，換入正丁醇，在換一次新正丁醇，最終入正丁醇石蠟中。2）叔丁醇一無(wú)毒，可與水、酒精、二甲苯混合，是一種很好的脫水劑，此液不會(huì)使組織收縮或變硬，不 必經(jīng)過(guò)透亮，直接浸蠟。第三節(jié)透亮組織在脫水后，所用的大多數(shù)脫水劑不能和石蠟相混合，透亮劑既可以與脫水劑相混合又能和石蠟相混合，起到橋梁的作用。它可以提出脫水劑，在代替脫水劑后導(dǎo)致石蠟的滲入。當(dāng)組織中全部為透亮劑占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織呈現(xiàn)不同程度的透亮狀態(tài)，此種現(xiàn)象稱為透亮。假如組織不能透亮，說(shuō)明脫水未盡，必需重新返工，否那么影響透蠟的進(jìn)行。在制片過(guò)程中，有兩次透亮。第一次是脫水后、

17、透蠟前組織塊的透亮，目的是便于透蠟包埋。 其次次透亮是染色后切片的透亮，目的是利于光線的透過(guò)便于顯微鏡的觀看。常用的透亮劑 最常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、石炭酸等。二甲苯一應(yīng)用最廣的一種透亮齊IJ,價(jià)格廉價(jià)。五色透亮，易揮發(fā)，易溶于酒精又能溶解石蠟，能與封片劑樹(shù)膠混合，不能與水混合。透亮力強(qiáng)，作用較快，缺點(diǎn)是簡(jiǎn)單使組織收縮變硬變脆。所以組織不能在內(nèi)停留過(guò)久，而且必需在完全脫水后才能應(yīng)用。通常在制片進(jìn)入二甲苯以前先經(jīng) 過(guò)1: 1的酒精和二甲苯混合液，避開(kāi)材料收縮。 氯仿組織在其中浸存較久，收縮不厲害，也不會(huì)變脆；極易揮發(fā)，在透蠟時(shí)，浸入材料中的氯仿比二甲苯簡(jiǎn)單揮發(fā)。缺點(diǎn)是滲透

18、力弱，透亮?xí)r間是二甲苯的2-3倍。苯一近似二甲苯，揮發(fā)較快。對(duì)組織收縮較少，久浸組織也不會(huì)產(chǎn)生變硬變脆現(xiàn)象。第四節(jié)透入和包埋組織經(jīng)過(guò)脫水、透亮后要讓石蠟等支持劑透入內(nèi)部使組織變硬并將組織包埋進(jìn)去，以利于切片和觀看，這個(gè)過(guò)程稱為透入和包埋。 目的是除去組織中的透亮齊IJ,使石蠟滲入組織內(nèi)部后把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，以便切成薄片。一、石蠟的透入石蠟是從石油中分別出來(lái)的一種甲烷系固體碳化氫。依據(jù)熔點(diǎn)的不同有軟蠟和硬蠟之分。軟蠟熔點(diǎn)低，一般切 片所用的軟蠟熔點(diǎn)為42-45 、45-50 o硬蠟熔點(diǎn)高，切片所用硬蠟熔點(diǎn)為52-54或56-60。選用石蠟 的熔點(diǎn)應(yīng)依據(jù)切片時(shí)的室溫條件和組織類型來(lái)考慮。

19、一般，石蠟硬度與組織硬度相近，組織較硬時(shí)用硬的石蠟; 室溫高時(shí)用硬帽，室溫低時(shí)用軟蠟。石蠟太硬，切片簡(jiǎn)單切碎，石蠟太軟，蠟帶簡(jiǎn)單皺縮，很難展平。配制和使用新蠟時(shí)必需經(jīng)久煮練，由于新蠟內(nèi)往往含有氣體或水分，需要加熱再溶化，反復(fù)加熱以除去蠟內(nèi)氣 體，增加石蠟密度。用過(guò)的廢蠟加熱過(guò)濾后仍可使用，比新蠟更好用。透入過(guò)程：當(dāng)組織塊在透亮劑中透亮好以后，就讓石蠟滲入組織內(nèi)部。先將組織塊放入石蠟和二甲苯的等量混合液中，這樣可削減組織的收縮和扭轉(zhuǎn)，使石蠟隨著透亮劑滲入到組織的每個(gè)局部。從石蠟與二甲苯的混合液中取出組織塊，必需經(jīng)過(guò)純石蠟I、純石蠟H和純石蠟HI,在每個(gè)蠟中的時(shí) 間一般為半小時(shí)左右。依據(jù)蠟塊的大小

20、可適當(dāng)變化時(shí)間，使石蠟中含有的剩余透亮劑完全去除，以免影響切片。 二、石蠟包埋預(yù)備好石蠟包埋框或包埋盒、冷水、鑲子等。第五節(jié)切片、貼片和烤片一、切片石蠟切片機(jī) 一次性刀片 磨刀修快、粘在木塊上，預(yù)備好毛筆、成蠟帶的硬紙板，光滑面是反面應(yīng)朝下放，有皺紋面是正面朝上。 切片中可能消失的各種問(wèn)題：1切片分別不能形成蠟帶：室溫過(guò)低或石蠟過(guò)硬，蠟邊過(guò)小或不平。2蠟帶彎曲：蠟塊上下面不平行，刀鈍、蠟塊不與刀刃平行等。3蠟片上卷，切過(guò)刀口致裂開(kāi)：刀口太鈍或不清潔，刀的角度過(guò)大或石蠟過(guò)硬。4蠟片易粘在切片刀上或切片太皺：室溫太高或石蠟太軟；刀片角度過(guò)小也能使切片皺縮。5切片厚薄不一；刀或蠟塊未固定緊，切片機(jī)磨損或有故障。6切片消失裂隙或碎裂：組織浸蠟缺乏或浸蠟溫度過(guò)高，或在透亮劑中時(shí)間過(guò)久，組織已經(jīng)發(fā)脆，無(wú)法補(bǔ)救。7切片消失縱口:刀有缺口或石蠟內(nèi)有硬的物質(zhì)、刀口不清潔等。8切片時(shí)有沙沙聲，切片有小孔：組織在透蠟時(shí)溫度過(guò)高，組織受損，無(wú)法補(bǔ)救。9切成之片，組織自動(dòng)脫落或與石蠟分別：透蠟缺乏。二、貼片與烤片1展片一溫水撈取法展片烤片機(jī)或簡(jiǎn)易的方法，以器皿成溫水，約40左右，將預(yù)先割開(kāi)的蠟片攤于水面