ch09 動(dòng)物組織培養(yǎng)

1、第九章 動(dòng)物組織培養(yǎng) 第一節(jié)、動(dòng)物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)一、動(dòng)物細(xì)胞 特點(diǎn) 無細(xì)胞壁倍增時(shí)間長，生長緩慢需氧量少，對攪拌敏感 (why?)聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開始退化(Hayflick界限)二、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定義動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。與植物組織培養(yǎng)定義的比較：植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，在人工培養(yǎng)基上，離體培養(yǎng)植物的器官、組織、細(xì)胞以獲得再生植株等的過程、方法。外植體：由活體植物上切取下來進(jìn)行培養(yǎng)的組織或器官。動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培

2、養(yǎng)區(qū)別動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，且大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需有血清。動(dòng)物細(xì)胞對環(huán)境敏感，包括pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力都比微生物有更嚴(yán)的要求，一般須嚴(yán)格的監(jiān)測和控制。植物細(xì)胞對營養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡單。但由于植物細(xì)胞培養(yǎng)一般要求在高密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細(xì)胞生長較微生物要緩慢，長時(shí)間的培養(yǎng)對無菌要求及反應(yīng)器的設(shè)計(jì)也提出特殊的要求。Classification of Cell CulturesPrimary CultureCells taken directly from a tissue to a

3、 dishSecondary CultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergo apoptosis.Apoptosis is programmed cell deathPrimary Cultureretention of the 3D shapeoutgrowth and migration of cells三

4、個(gè)相關(guān)定義細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)第一次傳代后，形成的細(xì)胞群體，即具有增殖能力，類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，一般為有限細(xì)胞系。細(xì)胞株：細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞群體。原代培養(yǎng)后得到細(xì)胞系，再經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，一部分細(xì)胞死亡，一部分細(xì)胞繼續(xù)生長并轉(zhuǎn)化為連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系。3、生長特性根據(jù)形態(tài)特征分類A 貼壁型（粘附型細(xì)胞） 上皮細(xì)胞型、 成纖維細(xì)胞型、 游走細(xì)胞型、 多形細(xì)胞形。粘附生長本是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細(xì)胞之間相互接觸；二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后

5、即停止生長，這時(shí)若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面。兩種貼壁的培養(yǎng)細(xì)胞Contact inhibitionWhen cells contact each other, they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycleTransformed cells will continue to proliferate and pile upon each otherB 懸浮型體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因此也叫懸浮型細(xì)胞。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞或微生物，當(dāng)接種于體外

6、環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。如：血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類細(xì)胞。這類細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞體始終為球形。第二節(jié)、常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法一、培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境1.環(huán)境無毒和無菌：2.適宜的溫度：人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞最適溫度均為3537。3.氣體環(huán)境和氫離子濃度：需要一定量的O2（19959975pa）和CO2（95空氣+5%CO2）；pH7.2-7.44.滲透壓：260320mOsm/kg適用于大多數(shù)細(xì)胞5.營養(yǎng)要求苛刻：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供。六碳糖是主要的能源物質(zhì)，谷胺酰胺是其主要的氮源

7、之一并對其增殖與生長具有重要作用。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特殊性1、大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長。 2、動(dòng)物細(xì)胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。 3、對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對環(huán)境極其敏感，包括 pH 、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴(yán)格監(jiān)控。對環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進(jìn)行供氧和調(diào)節(jié)pH。 4、動(dòng)物細(xì)胞生長緩慢，因此培養(yǎng)時(shí)間較長，易污染。 Rich Media Are Required for Culture of Animal CellsNine amino ac

8、ids, referred to as the essential amino acids, cannot be synthesized by adult vertebrate animals and thus must be obtained from their diet. Animal cells grown in culture also must be supplied with these nine amino acids, namely, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, thre

9、onine, tryptophan, and valine. addition, most cultured cells require cysteine, glutamine, and tyrosine. The other essential components of a medium for culturing animal cells are vitamins, which the cells cannot make at all or in adequate amounts; various salts; glucose; and serum, the noncellular pa

10、rt of the blood MediumMediumMediumDissolved gasesto control pH together with NaHCO3H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- Handerson-Hasselbach eqn predicts pH:pH = 6.0966+log(HCO3- /CO2 )5-10% ambient CO2 dissolves in the medium decreasing pHaddition of NaHCO3 increases HCO3- thus promotes H2C03 formation incre

11、asing pHMediumDissolved gasesWhat if 5% 10%?pH drops to 7.2 from 7.4Oxygen consumption by cells:delivery is different than in vivodiffusion as opposed to hemoglobin transportlimited bysolubility of oxygen in media at 37 Ctransport from gas phase to cell surfacedissolution, diffusion and consumption

12、Pg, Oxygen tension provided by the incubator Pc, Oxygen tension at the bottom of the dishDiffusion based on Ficks lawD*K*(Pg-Pc)/dwhere D: diffusivity of O2 in water at 37Cuptake rate = diffusion rateMediumOxygen: pH of the medium at high cell #?O2 consumption per unit area increasesO2 concentration

13、 on the cell surface decreasesshift to anaerobic metabolismformation of lactic acid and CO2!be alarmed if phenol red turns to orange!MediumPc and media height and Pg.Pc depends on Pg and d Pg Pcnote much lower Pc at the corresponding Pgdue to low solubility of O2 and diffusion barrierCells spread wi

14、th Pg, why? d, diffusion resistance, PcMediumSerumliquid that remains after plasma is allowed to clotadded to medium by 1-20% v/vcalf, fetal bovine, horse, humanbatch to batch variation!contents interfere with what cells produce (use radiolabeling)Solutions used in cell culture Phosphate Buffered Sa

15、line - Ca2+ Mg2+ Free (PBS-CMF)Used to wash/remove excess serum that inhibits the function of TRED. Calcium will also inhibit the function of TRED.Must be warmed in the water bath before use so cells are not shocked by cold liquid.Trypsin EDTA (TRED)An enzyme used to detach the cells from a culture

16、dish.Trypsin cleaves peptide bonds (LYS or ARG) in fibronectin of the extracellular matrix.More about fibronectin and the ECM next weekEDTA chelates calcium ions in the media that would normally inhibit trypsin.Trypsin will self digest and become ineffective if left in water bath more than 20 minute

17、s.Trypsinizing cells too long will reduce cell viabilityTrypan BlueAn exclusion dyeLiving cells cannot take up the dye and will appear bright and refractile.Dead cells with broken membranes will absorb the dye and appear blue.Usually add 200 ml of trypan blue to 200 ml of cell suspension in eppendor

18、f tube四、常用的培養(yǎng)方法（1）、懸滴培養(yǎng)法 是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織、器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法，最早是由Harrison于1907年創(chuàng)立的?；疽c(diǎn)是：將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再置放于一凹形載片之上，最后用熔蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 單玻片的再培養(yǎng)1）用消毒剃須刀刮去蓋玻片四周的石蠟2）用鑷子小心揭開蓋玻片，培養(yǎng)物面朝上，放入培養(yǎng)皿內(nèi)。3）用白內(nèi)障刀切除生長暈周圍部分，留下方形培養(yǎng)物，并切成小塊。4）將小塊在含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中再漂洗，移入另一含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行再培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法將擬培養(yǎng)對

19、象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)的瓶子都可稱為培養(yǎng)瓶。 （3）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的一種方法。 （4）灌注小室培養(yǎng)法將細(xì)胞接種于一個(gè)由上下兩個(gè)蓋玻片（分別構(gòu)成上壁與下壁）與一金屬圈（構(gòu)成側(cè)壁）密封圍成的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室的側(cè)面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出。 最初是1912年由Burrows嘗試設(shè)計(jì)了一種簡單的灌注小室培養(yǎng)模型。 （5）培養(yǎng)板培養(yǎng)法具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96

20、孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。 第三節(jié)、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與保存一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長階段（一）原代（初代）培養(yǎng)期 指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個(gè)階段，一般持續(xù)1-4周。在這個(gè)階段，細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。 （二）傳代期 原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便該稱為細(xì)胞株，在全生命期中該階段的持續(xù)時(shí)間最長。一般情況下，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。 （三）衰退期 該階段細(xì)胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開始衰退凋亡。 Kinetics of GrowthLogarithmic scale!Cells reach confluen

21、ce (cover all available surface)二、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng) 的過程圖解 機(jī)械分散組織細(xì)胞方法消化初代培養(yǎng)法基本步驟組織塊初代培養(yǎng)法一般傳代培養(yǎng)的步驟 (1) 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。(2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底。(3) 25分鐘后檢查，如有細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。(4) 吸出消化液，加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以免細(xì)胞流失，洗去殘留的消化液。如果單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。(5) 用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度。（6）重新接種培養(yǎng)。 消化法傳代培養(yǎng)步驟三、CryopreservationHow

22、does freezing induce damage?cool too fast formation of ice crystals inside the cellcool too slow hypertonic extracellular solution dehydrationtransport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growthThawing rate is also important (thaw rapidly)要點(diǎn)用慢凍快融的方法：標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度為12度/

23、分，當(dāng)溫度達(dá)25度時(shí)，下降率可增至5度至10度/分，到100度時(shí)，則可迅速浸入液氮中。要適當(dāng)掌握下降速度，過快會影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成，但各種細(xì)胞對凍結(jié)速度要求也不一樣?？傊?，在一開始時(shí)，下降速度不能超過10/分鐘。另外，用什么防護(hù)劑合適和用量多少，要依賴細(xì)胞而定。最好凍存一年后，再復(fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。四、ContaminantsSterile culture practiceSignscloudinessobservable colonieschange in pH (medium color changes)Microbesbacteriarod, cocci,

24、spheresmotilebacterial endotoxin elicits cell responseendotoxin may damage even before visual manifestation of coloniescommercial kits for endotoxinsMicrobes (cont.)yeastround refractile particlesfungi (molds)thin filamentous extensionsmycoplasma and virusdifficult to detect visuallycan pass through

25、 filtersbe alert for unexpected behavior in culture (morphology, growth rate etc.)use commercial kitsFungus微生物防治多數(shù)污染無法挽救，棄之細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵在于無菌操作利用抗生素，加溫處理，動(dòng)物體內(nèi)接種等處理污染。另外：防止細(xì)胞交叉污染第四節(jié)、器官培養(yǎng)一、概念從供體取得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的一定的環(huán)境中培養(yǎng)。主要強(qiáng)調(diào)器官組織的相對完整性。組織厚度和直徑1mm，使之能靠自然滲透來維持氧氣和營養(yǎng)。保證內(nèi)部細(xì)胞有足夠的氧氣滲入，可以提高氧分壓或加注純氧。附加特殊的培養(yǎng)基如生長因子，激素二、培養(yǎng)方法、表玻璃器官培養(yǎng)法 表玻璃器官培養(yǎng)法是由Fell和Robinson于1929年建立的一種器官培養(yǎng)的經(jīng)典技術(shù)。技術(shù)要點(diǎn)是：在一塊表玻璃內(nèi)加上雞胚提取液和雞血漿，凝固后將所培養(yǎng)的器官移植到上面，然后一起置于一培養(yǎng)皿內(nèi)，送入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 A上面觀B側(cè)面觀、瓊脂凝膠培養(yǎng)法與血凝塊比較，瓊脂固體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于基質(zhì)不液化，細(xì)胞在瓊脂上的遷移受到限制。 Wolff和Schneider采用改良后的瓊脂培養(yǎng)基成功進(jìn)行了胚胎器官的發(fā)育及形態(tài)發(fā)生的研究，后來又利用瓊脂凝膠培養(yǎng)基進(jìn)行了腫瘤組織的培養(yǎng)。由此而設(shè)計(jì)了Wolff器官培養(yǎng)法。 、擦鏡紙培養(yǎng)法 C