酶活性及酪氨酸酶

1、酶催化活性及其影響因素的研究學(xué)院:化學(xué)與分子工程學(xué)院班級:應(yīng)用化學(xué)108班 姓名:王文移05 寧家彬06酶催化活性及影響其活性因素的研究作者：王文移寧家彬摘要:酶廣泛存在與生物體中，對生命的生化反應(yīng)至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)主要探 究不同濃度下催化活性的不同，以及溫度，pH值，抑制劑對于酶活性的影響。關(guān)鍵詞:酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH，溫度，抑制劑Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different cat

2、alytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity.引言認(rèn)識生物體中酶的存在和催化作用，了解生物體系中在酶存在下的合成或 分解與普通的有機(jī)合成的不同和相同之處，認(rèn)識一些生物化學(xué)過程的特殊性， 是當(dāng)今對酶的研究不可或缺的話題。通過本次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘莆丈锘钚晕镔|(zhì)的提 取和保存方法，學(xué)會使用儀器分析手段研究催化反應(yīng)特別是生物化學(xué)體系中催 化過程的基本思想和方法。酪氨酸酶是一種氧化還原酶，它廣泛存在于動植物和微生

3、物中。土豆的提取 液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶為a-淀粉酶，在唾液腺細(xì)胞內(nèi)合成。酶 的活性會受到很多因素的影響，如溫度、PH值、底物濃度以及激活劑抑制劑的 影響。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跍y定各個因素對于酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶來進(jìn)行反應(yīng)，主要觀察淀粉與試劑的反應(yīng)顏 色，多巴的吸光度。本實(shí)驗(yàn)從土豆中提取酪氨酸酶，并測定其催化活性。當(dāng)土豆、蘋果、香焦等的 受損面接觸空氣后會產(chǎn)生深棕色的現(xiàn)象是人們都見過的，這是這類物質(zhì)含有酪 氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物質(zhì)內(nèi)部，當(dāng)暴露在空氣中后，在氧氣的參與下， 會發(fā)生一系列反應(yīng)。以下是主要的反應(yīng)過程。由于多巴轉(zhuǎn)變成多巴紅的反應(yīng)速率較快，再轉(zhuǎn)到

4、下一步產(chǎn)物速率則慢得多，故 可選擇多巴轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟图t的反應(yīng)速率的測定來判斷催化反應(yīng)的活性。因多巴紅 具有特殊的顏色，故可用分光光度法測定，在不同的時刻測定某特定波長下的 吸光度，用吸光度對時間作圖，從所得的直線斜率求酶的活性。酶的活性計(jì)算方法：一般定義在優(yōu)化的條件下（包括pH值、離子強(qiáng)度、溫度 等），25C時在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 mol底物所需要催化劑的量為活性單位。通過KA下式可計(jì)算酶的活性：a =x 106，式中，a為所用溶液的酶的活性，AA為ktV最大吸收波長吸光度的變化，t為時間（min）, k為多巴紅的摩爾吸收系數(shù)，V 為加入酶的體積，進(jìn)而計(jì)算出原料（土豆）中酶的活性：A aVo/m。式

5、中A 為原料中酶的活性（注意此處A不是吸光度A），V為原料所得的酶溶液的總 體積，m為原料總質(zhì)量。淀粉在淀粉酶作用下發(fā)生分解，其變化為：淀粉一一紫色糊精一一紅色糊精一 一麥芽糖，葡萄糖。淀粉與糊精無還原性，對班氏試劑呈陰性；麥芽糖與葡萄糖則是還原性的糖， 與班氏試劑共熱生成紅棕色氧化亞銅的沉淀。反應(yīng)最適溫度為37-4oC，最適pH為6.8, Cl-離子是激活劑，Cu2+離子是抑制 劑。下圖為多巴在酪氨酸酶的催化作用的下的反應(yīng)歷程黑包素實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1、儀器：分光光度計(jì)、離心機(jī)、研缽、水浴、秒表2、試劑：二羥基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、土豆、淀 粉溶液，碘液、班氏試劑、鹽酸、

6、乳酸、碳酸鈉、氯化鈉、硫酸銅實(shí)驗(yàn)步驟3.1酪氨酸酶的活性研究溶液配制0.10mol/L 磷酸緩沖溶液（pH=7.2）： 50ml 0.20mol/L 磷酸二氫鈉+8ml 0.1mol/L鹽酸，定容至200ml；0.10mol/L 磷酸緩沖溶液（pH=6.0）： 50ml 0.20mol/L 磷酸二氫鈉+22ml0.1mol/L鹽酸，定容至200ml；0.10mol/L多巴溶液：0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸緩沖溶液定容至100ml （現(xiàn)用現(xiàn)配）。3.1.2酶的提取取新鮮土豆，清潔后切碎，稱取10.0g置于研缽中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸 緩沖溶液，用力擠壓，兩層紗布濾出提取液

7、，立即離心分離（3000rpm， 5min），傾出上層清液保存于冰浴中，提取液為棕色，在放置過程中不斷變 黑。3.1.3酶的活性測量取2.5ml上述提取液用pH=7.2的緩沖溶液稀釋到10ml比色管中，搖勻分別取0.1mL稀釋過的提取液于10mL比色管中，加入2.5mL pH=6.0的緩沖溶 液，再加入2ml多巴溶液，同時開始計(jì)時，用分光光度計(jì)在480nm處測定吸光 度。開始6min內(nèi)每分鐘讀一個數(shù)，以后隔2min讀一個數(shù)，直至吸光度變化不 大為止。取0.2ml，0.3ml。0.4ml已稀釋過提取液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)（總體積為5ml）。以吸光度對時間作圖，從直線斜率求出酶的活性。3.2淀粉酶的活性研

8、究淀粉酶活性的檢測：取一只試管加入5ml淀粉溶液和0.2-2ml唾液，混 勻后水?。?7（）在白瓷板上用碘液觀察顏色，至微黃色為止，向上述試管中 加入2ml班氏試劑，放入沸水中加熱十分鐘觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象pH對酶活性的影響：取四只試管分別加入鹽酸，乳酸，蒸餾水，碳酸鈉 各2ml再加入2ml淀粉溶液和2ml酶溶液，37度水浴，5分鐘后加入2ml班氏 試劑，沸水浴，觀察沉淀生成情況溫度對酶的影響：三只試管分別加入3ml淀粉，另外三只加1ml淀粉 酶，分別成組在0，37，70度下水浴，5分鐘后混合，5分鐘后加碘液，觀察顏 色3.2.4.抑制劑與激活劑的作用管號123NaCl/ml1-CuSO /ml 4-

9、1-蒸餾水/ml-1淀粉酶溶液/ml111淀粉溶液/ml333滴加碘液，觀察溶液顏色變化3.3影響酶活性的因素的研究（1）取0.40ml稀釋過了的提取液在沸水浴中加熱5min，冷卻后配成測定溶 液，觀察現(xiàn)象。（2）取0.40ml稀釋過的提取液，加入少量的固體NaS O配成測定溶液，觀2 2 3察現(xiàn)象。（3）取0.40ml稀釋過的提取液，加少量EDTA振動混合，反應(yīng)一段時間后配 成測定溶液，觀察現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄及討論（一）酪氨酸酶催化活性研究加入不同量的酶在不同時間反應(yīng)的吸光度如下表（表1）所示，由于反應(yīng) 在8分鐘以后已經(jīng)趨于平緩，故在12分鐘以后的兩組（14、16）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未列 出。表1：不

10、同酶加入量不同時間反應(yīng)的吸光度測定提取 液/mL不同反應(yīng)時間/（min）吸光度測定值123456810120.100.0810.0930.1000.1130.1270.1400.1370.1380.1410.200.1390.1520.1670.1830.1980.2210.2260.2300.2300.300.1870.2010.2230.2400.2560.2710.2810.2830.2900.400.0150.0190.0260.0330.0370.0450.0440.0510.058以吸光度值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，可得出在加入酶的作用下多巴的轉(zhuǎn) 換動力學(xué)過程，再由直線部分得出轉(zhuǎn)換速

11、率，即為酶的活性。為使作圖更為準(zhǔn) 確，現(xiàn)只取前六分鐘內(nèi)數(shù)據(jù)作圖如下：圖1:0.10mol提取液關(guān)系曲線圖2:0.20mol提取液關(guān)系曲線圖3:0.30mol提取液關(guān)系曲線 曲線圖3:0.30mol提取液關(guān)系曲線 曲線依次得出不同提取液的活性，比較不同體積的提取液加入后相同量的多巴 轉(zhuǎn)換速率。由于放置時間較長，第四組實(shí)驗(yàn)已經(jīng)失去可靠性。(酪氨酸酶的吸 光系數(shù)為lg k=3.7。)表2：酶的活性計(jì)算已稀釋的提取液體 積/mL活性/Amin-1原提取液活性/ (mL-1)原料活性/ g-10.l00.01121.9417.550.200.01615.9612.770.300.01711.319.04

12、80.400.0062.9932.394（1）在沸水浴中加熱5分鐘冷卻后測得的溶液吸光度基本保持不變，其酶的活 性在高溫下失活。（2） 且比 性。加入少量固體Na2S2O3配成的測定溶液，其測得的吸光度也基本保持不變（2） 且比 性。（1）條件下的吸光度還小，其原因是硫代硫酸鈉是還原劑，使蛋白質(zhì)變稀釋的提取液加入少量EDTA稀釋的提取液加入少量EDTA振動混合，其測得的吸光度在緩慢減小。其原因是EDTA與輔助因子絡(luò)合，使酶活性失活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論根據(jù)酪氨酸酶的活性實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果，可知活性本應(yīng)當(dāng)隨著酶濃度的增大而 增大，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中卻出現(xiàn)活性隨酶濃度的增大而先增大后減小的情況出 現(xiàn)，可能是因?yàn)樵诿?/p>

13、提取之后未保存在冰浴中導(dǎo)致沒失活，從而導(dǎo)致酶活性的 變化出現(xiàn)異常情況。關(guān)于酶的活性影響因素的實(shí)驗(yàn)可得出以下結(jié)論（1） pH對活性影響：pH過?。ㄟ^酸）、過大（過堿）都能使酶蛋白變性而失活.pH的改變能影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時也可以影響底物和 輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化，只有在特定的pH 下，酶、底物和輔酶的解離狀態(tài)，最適宜它們相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從 而使酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值。這個pH稱為酶的最適pH。唾液淀粉酶的最適PH 為中性，故在蒸餾水中沉淀最多，鹽酸酸性過強(qiáng)，使酶的活性失活，乳酸是弱 酸，顏色基本不變，碳酸鈉是弱堿，產(chǎn)生較少的沉淀。（2）溫

14、度對酶活性的影響：酶的催化作用受溫度的影響很大，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以溫度過高會引 起蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶的失活，唾液淀粉酶在70。和0時，酶活性失活，顏色 呈藍(lán)色。在37時，是唾液淀粉酶的最適溫度，淀粉遇唾液淀粉酶水解，顏色 呈淺黃色。（3）抑制劑與激活劑對酶活性的影響：酶的活性受某些物質(zhì)的影響，能使酶活性增加的稱為激活劑，能使酶活性降低 的稱為抑制劑。很多少量的激活劑和抑制劑就會影響酶的活性，而且常具有特 異性。本實(shí)驗(yàn)中氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。所以加入 NaCl后，溶液顏色為淺黃色。氯離子促進(jìn)唾液淀粉酶的水解。銅離子作為抑制 劑，故加入硫酸銅后，溶液顏色為深藍(lán)色。水作為對照變量，加入后對溶液稀 釋，顏色為淺藍(lán)色。參考文獻(xiàn)KenllnerR,MermetJM,OttoMWindmerHM.Analytical