藥典三部2015版-通則-3604新生牛血清檢測要求

1、3604新生牛血清檢測要求本品系從出生14小時(shí)內(nèi)未進(jìn)食的新生牛采血分離血清，經(jīng)除菌過濾后制成。牛血清生產(chǎn)過程中不得任意添加其他物質(zhì)成分。新生牛血清應(yīng)進(jìn)行以下檢查，符合規(guī)定后方可使用。如采用經(jīng)過驗(yàn)證的病毒滅活工藝處理的牛血清，大腸桿菌噬菌體 及病毒檢測必須在滅活前取樣進(jìn)行。pH值 應(yīng)為7.008.50。蛋白質(zhì)含量 采用雙縮月尿法（通則0731第三法）或其他適宜方 法測定，應(yīng)為3550g/L。血紅蛋白用分光光度法或其他適宜的方法測定，應(yīng)不高于200mg/L。以蒸儲(chǔ)水為空白對照，使用 1cm光路的比色杯，直接測定供試 品在576nm、623nm及700nm波長下的吸光度值，每個(gè)供試品至少 測定2次，

2、計(jì)算平均測定值。按照下式計(jì)算供試品中血紅蛋白含量：血紅蛋白含量（mg/L）=（A 576 M15）（A623X102）（A700M9.1） 10 式中 A576、A623、A700為供試品在576nm、623nm及700nm波長下 的平均吸光度值。滲透壓摩爾濃度應(yīng)為250330mOsmol/kg （通則0632）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)不高于10EU/m l（通則1143凝膠限度試驗(yàn)）支持細(xì)胞增殖檢查 用Sp2/0-Ag14或適宜的傳代細(xì)胞進(jìn)行。細(xì) 胞復(fù)蘇后，用待測樣品配制的培養(yǎng)液至少連續(xù)傳三代后使用， 取對數(shù) 生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。（1）細(xì)胞生長曲線的測定 取供試品按10%濃度配制細(xì)胞培養(yǎng) 液，按

3、每1ml含104的細(xì)胞濃度接種細(xì)胞，每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)觀 察1周，并繪制生長曲線，細(xì)胞的最大增殖濃度應(yīng)不低于106/ml。（2）細(xì)胞倍增時(shí)間的測定按生長曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。取細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)（丫）、接種細(xì)胞數(shù)（X）及生長時(shí)間（T） 計(jì)算。倍增時(shí)間=T/AA=log2Y/X細(xì)胞的倍增時(shí)間應(yīng)不超過20小時(shí)。（3）克隆率的測定 按有限稀釋法將細(xì)胞稀釋至每 1ml含10 個(gè)活細(xì)胞的濃度，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每板至 少接種60孔，于37C、5%二氧化碳培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞克隆生長情 況，培養(yǎng)1周后計(jì)數(shù)每孔中的細(xì)胞克隆數(shù)，并計(jì)算克隆率，應(yīng)不低于 70%。克隆率=A/BX100

4、%式中 A為細(xì)胞克隆數(shù)；B為接種細(xì)胞的總孔數(shù)。無菌檢查 依法檢查（通則1101）,應(yīng)符合規(guī)定。支原體檢查 依法檢查（通則3301）,應(yīng)符合規(guī)定。大腸桿菌噬菌體 采用噬斑法和增殖法檢測。不得有噬菌體污染。病毒檢查細(xì)胞培養(yǎng)法及熒光抗體檢測（1）樣品制備 取約250ml的新生牛血清供試品用于檢測，將 其配制成含15%供試品的培養(yǎng)液，用于檢測全過程的細(xì)胞換液及傳代。以檢測合格的血清作為陰性對照血清。（2）指示細(xì)胞制備 至少采用猴源（如Vero細(xì)胞）、2種牛源細(xì) 胞（BT和MDBK細(xì)胞或無病毒污染的原代牛腎細(xì)胞） 以及人二倍體 細(xì)胞作為指示細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇后至少傳代1次后使用。根據(jù)所需量制 備足夠量的細(xì)胞

5、。（3）用含有供試品的培養(yǎng)液將4種指示細(xì)胞分別接種于75cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種量應(yīng)使細(xì)胞在培養(yǎng)7天后可達(dá)到至少80%90% 匯合。同時(shí)制備陰性對照血清培養(yǎng)瓶。將培養(yǎng)瓶置 37C、5%CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少7天。可在第5天時(shí)換液一次。（4）第7天進(jìn)行第1次盲傳，將接種供試品及陰性對照的每種 指示細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別傳出至少 2個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至第14 天，在第12天時(shí)可換液一次。（5）在第13天時(shí)（或第2次傳代前1天）或陰性對照瓶細(xì)胞達(dá) 到至少70%匯合時(shí)，制備陽性對照用細(xì)胞。即取1個(gè)陰性對照細(xì)胞瓶 分別傳至6孔板或其他適宜的細(xì)胞板中用于細(xì)胞病變觀察（CPE）、 血吸附檢查（HAd

6、）及熒光抗體檢測（IF）,次日接種陽性對照病毒。（6）第14天時(shí)進(jìn)行第2次盲傳。將第1次傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)物 分別傳至6孔板或其他適宜的細(xì)胞板中，進(jìn)行細(xì)胞病變觀察及HAd檢查時(shí)，接種于每種指示細(xì)胞上的待測樣本至少接種 3孔；進(jìn)行熒光 抗體檢測時(shí)，接種于每種指示細(xì)胞上的待測樣本進(jìn)行每種病毒檢測時(shí) 至少接種2孔。繼續(xù)培養(yǎng)至少至第21天。剩余細(xì)胞樣本-60C或以下 保存?zhèn)溆茫?）在第14天接種陽性對照病毒：?。?）制備的指示細(xì)胞接 種適量陽性對照病毒，置 36C4C、5%CO2培養(yǎng)箱吸附2小時(shí)，吸 棄上清液，加入適量細(xì)胞維持液，置 36CC、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7天。對于BT細(xì)胞，BVDV可作為病變

7、陽性對照，BPI3可作為HAd 陽性對照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛胰病毒（BAV-3）、牛細(xì)小病 毒（BPV）以及牛腹瀉病毒（BVDV）可作為IF檢測陽性對照；對 于MDBK細(xì)胞，呼腸孤病毒3型（REO3）和PI3可分別作為細(xì)胞病 變及HAd檢查陽性對照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3為IF檢測陽 性對照；對于Vero細(xì)胞，PI3可作為細(xì)胞病變及HAd檢查陽性對照， PI3及REO-3作為IF檢測陽性對照?？刹辉O(shè)立狂犬病病毒（Rabies） 陽性對照。所有IF檢測陽性對照病毒應(yīng)接種100300CCID50。（8）接種陰性對照及供試品的細(xì)胞培養(yǎng)物在接種后每日觀察細(xì) 胞病變情況，在

8、接種后至少21天或末次傳代后至少7天時(shí)分別進(jìn)行 病變觀察、HAd檢查及IF檢測。陽性對照培養(yǎng)物在接種后第 7天或 10%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)可進(jìn)行IF檢測。進(jìn)行血吸附檢查時(shí)，用雞與豚鼠血紅細(xì)胞在 28c及2025c 進(jìn)行檢測。進(jìn)行熒光抗體檢測時(shí)，將細(xì)胞固定后采用直接或間接免疫熒光抗 體檢查法，至少應(yīng)對 BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及Rabies 進(jìn)行檢查，結(jié)果均應(yīng)為陰性。（9）結(jié)果判定 陰性對照應(yīng)無細(xì)胞病變，血吸附檢查應(yīng)為陰性， 熒光抗體檢測應(yīng)為陰性；陽性對照應(yīng)有明顯的細(xì)胞病變，血吸附檢查 應(yīng)為陽性，熒光抗體檢測應(yīng)為陽性，判為試驗(yàn)成立。供試品如無細(xì)胞 病變，血吸附檢查為陰性，且熒光抗體檢測為陰性，判定為符合要求。 待測樣本如出現(xiàn)細(xì)胞病變，或血吸附檢查為陽性，或任何一種熒光抗 體為陽性，則判定為不符合要求。經(jīng)病毒滅活處理的牛血清，滅活前取樣檢測后若任何一項(xiàng)檢測顯 示為陽性，不建議用于生產(chǎn)。除非可鑒別出污染的病毒，且病毒滅活 工藝驗(yàn)證研究顯示其污染量可被有效滅活時(shí)方可使用。如果滅活前 BVDV病毒檢測為陽性，滅