儀器分析課程論文

1、毛細管電泳綜述摘要：自1988年第一臺商品化的毛細管電泳儀問世，距今已有二十多年的時光。在這期間， 毛細管電泳(CE)技術無論在理論還是應用方面，都得到了飛速的發(fā)展。今天，CE技術 已 逐漸成熟，在分析化學、生物化學、環(huán)境化學、材料化學、臨床化學、有機化學、天然產 物化學和藥物化學等領域有著廣泛的應用。CE技術作為一種強有力的分離分析手段，已成 功地應用于小分子、大分子、中性化合物和荷電化合物的分離。檢測器是毛細管電泳儀器的 關鍵部件，本文主要對毛細管電泳的檢測器進行討論，介紹一下我們自制的電導檢測器。 關鍵詞：毛細管電泳，檢測器第一章前言電泳是指帶電粒子在電場作用下向電性相反的方向遷移的現(xiàn)象

2、，據(jù)此對某些化學或生物 化學組分進行分離的技術稱為電泳技術。毛細管電泳(CE)又稱高效毛細管電泳(HPCE)，是指以毛細管為分離室，以高壓電場為驅動力的一類新型現(xiàn)代電泳技術，它于80 年代中后期迅速發(fā)展，其原理是在高壓電場和毛細管分離通道中，依據(jù)試樣中各 組分電泳淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類分析技術。與經典電泳相 比，毛細管電泳法克服了由于焦耳熱引起的譜帶寬和柱效較低的缺點。毛細管電 泳引入高的電場強度，改善了分離質量，具有分離效率高、速度快和靈敏度高等 特點，而且所需樣品少、成本低，更為重要的是，它又是一種自動化的儀器分析 方法。毛細管電泳法與高效液相色譜一樣同是液相分離技術，在很

3、大程度上兩者 互為補充，但無論從效率、速度、用量和成本來說，毛細管電泳法都顯示了它獨 特的優(yōu)勢。毛細管電泳分離技術與傳統(tǒng)的平板電泳和現(xiàn)代液相色譜分離技術相比 具有很多優(yōu)點：1.高效(105-107理論塔板數(shù)/米)；2.快速(幾十秒至幾十分鐘)； 3.分離模式多，選擇自由度大；4.分析對象廣，從無機離子到整個細胞；5.高速 自動化；6.樣品需量小，無環(huán)境污染,運行成本低，如:毛細管電泳可通過改變操 作模式和緩沖液成分，根據(jù)不同的分子性質(如大小、電荷數(shù)、疏水性等)對極廣 泛的物質進行有效分離,而高效液相色譜法要用價格昂貴的色譜柱和溶劑?？梢姡?毛細管電泳法具有儀器簡單、分離模式多樣化、應用范圍廣

4、、分析速度快、分離 效率高、靈敏度高、分析成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)點。CE的研究可追溯到60年代，1967年由Stellen Hjerten撰寫的一篇論文，他使用3 mm內徑的石英毛細管，進行自由溶液區(qū)帶電泳(CZE)E，由于意識到焦耳熱會引起嚴重的 峰展寬，他使用旋轉毛細管的方法減小溫度梯度的影響。1974年，Virtanen通過實驗比較， 認為使用細內徑毛細管是降低焦耳熱效應、提高分離效率的主要方法。1979年，Mikkers 采用200 gm內徑的聚四氟乙烯管和電導檢測器分離了16種有機離子，獲得了 105plates/m的高柱效3，這是毛細管電泳發(fā)展中第一個突破性成就。第二個突破性成就是

5、 Jorgenson等人于1981年完成的冏，他們采用內徑為75 gm的石英毛細管和熒光檢測器， 配以30 kV的高電壓，獲得了 4 x 105plates/m的柱效，使傳統(tǒng)電泳技術發(fā)生了根本變革， 迅速發(fā)展成為可與氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)相媲美的新穎的分離和分析技術 高效毛細管電泳(HPCE)o 1983年Hjerten開展了很多開創(chuàng)性的工作，把傳統(tǒng)的聚丙 烯酰胺凝膠電泳移植到毛細管中，創(chuàng)建了毛細管凝聚電泳(CGE)5； 1984年Terabe在毛 細管中使用含有表面活性劑SDS的背景電解質溶液成功地分離了中性分子和小分子，開 創(chuàng)了膠束電動毛細管色譜(MEKC)6； 198

6、5年Hjerten結合傳統(tǒng)的等電聚焦技術，提出了 新的毛細管等電聚焦技術(CIEF)7； 1987年Knox等利用超細的液相色譜填料填充毛細 管，發(fā)展了毛細管電色譜技術(CEC)8。至此，在短短的幾年內形成了毛細管電泳的幾種主 要分離模式。此后，毛細管電泳與其它分離手段的聯(lián)用技術亦開始發(fā)展起來，如毛細管電 泳-質譜聯(lián)用技術(CE-MS)9、液相色譜-毛細管電泳聯(lián)用技術(LC-CE)10、等速電泳-毛細管 區(qū)帶電泳聯(lián)用技術(ITP-CE)11等。目前，毛細管電泳成為上一世紀后二十年分析化學領域 中發(fā)展最迅速的分離分析方法，其研究已成為分析化學領域的熱門方向，應用范圍迅速擴 大1216。第二章毛細

7、管電泳分離技術的幾種模式毛細管區(qū)帶電泳(CZE)毛細管區(qū)帶電泳(CZE，capillary zone electrophoresis)是毛細管電泳中最基本 也是應用最廣的一種操作模式，也稱毛細管自由溶液區(qū)帶電泳，我們通常把它看 做其他各種操作模式的母體。CZE是基于樣品中各個組分間荷質比的差異，在 外加高壓電場作用下依據(jù)樣品中各離子成分電泳淌度的不同而實現(xiàn)分離的。電泳 過程中所采用的背景電解質是緩沖溶液，在緩沖溶液中加入一定量的添加劑，可 以提高電泳的分離選擇性，抑制毛細管壁的吸附，或者改變電滲流的大小和方向。 其中帶電粒子的遷移速度二電泳和電滲流速度的矢量和正離子與兩種效應的運動方向一致，在

8、負極最先流出；而中性粒子無電泳現(xiàn)象， 受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子則兩種效應的運動方向相反；當v電滲流v電泳時，陰離子在負極最后流出，在這種情況下,不但可以按類分 離，同種類離子由于差速遷移被相互分離。毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis， CGE)瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是普通電泳中的兩種形式，特別是對于十 二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，由于SDS是一種陰離子表 面活性劑，可以與蛋白質作用將其改性，把球形蛋白質變?yōu)榘魻?，SDS將蛋白質 的原有電荷掩蓋，使各種蛋白質表現(xiàn)為相同的電荷密度，蛋白質的遷移速度與它 們的有效

9、直徑有確定的關系，用來測定蛋白質的分子量。將SDSPAGE移入毛 細管內進行就形成了 CGE，在CGE中樣品的用量可以明顯減少，可以實現(xiàn)定量 分析。其原理就是將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性， 類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖 銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很 難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好， 散熱性好，分離度極高；缺點是制備柱較困難，壽命較短。無膠篩分技術：采用 低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。膠束電動毛細 官電泳（ME

10、KC , micellar electrokinetic chromatography）是Terabe在1984年首先提出的60,問世以后，立即引起了學術界的廣泛重視。這 一技術的最大優(yōu)點是使毛細管電泳有可能在進行離子型化合物分離的同時分離 中性物質，因此在各個領域特別是生物、醫(yī)藥方面顯示了廣泛的應用前景。在MEKC緩沖液中加入離子型表面活性劑，使其濃度達到臨界濃度，表面 活性劑單體就會結合在一起，形成一個球體，即為膠束。膠束通常外部親水，內 部疏水，在電場力的作用下，膠束在柱中移動。電泳和電滲流的方向相反，且/ 電滲流 ，電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；中性分子在膠束相和溶 液（水相）

11、間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，在毛細管柱內向負極遷 移的速度慢，流出時間長，這樣可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的 應用范圍；SDS是最常用的一種表面活性劑，SDS膠束相叫準固定相。MEKC比 高效液相色譜更為高效，HPLC分離柱效為5000-25000理論板數(shù)/m，MEKC可 達到50000-500000理論板數(shù)/m。比高效液相色譜更為高速，MEKC分離時間 通常小于30min，但達到相仿效率的毛細管LC，需要更長的時間。4.毛細管等電聚焦（CIEP）上樣毛*用管NUZU如VV/甘T。* 占.谷+毛細管等電聚焦（Capillary Isoelectric Focusing,

12、 CIEF）是一種根據(jù)等電點差 別來分離生物大分子的高分辨率電泳技術，使用兩性電解質的混合物（合成的具 有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物）做載體，當施加直流電壓（6 8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；具體為當壓力進樣 將樣品（通常為蛋白質）加入毛細管后，施加電壓大約35min，帶正電的流向 陰極，帶負電的流向陽極，使陰極端的pH值升高，陽極端的pH值降低，在毛 細管內即形成了 pH梯度，氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液?日有關， 在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零； 蛋白質樣品在毛細管內停留在各自的等電點（pI ）處，這一

13、過程毛細管遷移電流 逐漸降低到零。最后是將NaCl加入到盛有NaOH的陰極槽內，再加68kV的 高壓，使Cl離子進入毛細管，在近陰極端的pH降低，使已經聚焦的蛋白質依 次通過檢測器，這一過程毛細管遷移電流逐漸升高。毛細管AWTO 仲 WXg WTO WX 負垓 、極 負根 Pl PI3 正根5 毛細管等速電泳(CapillaryAsotachophoresis ， CITP) （1）將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子（充滿毛細管）和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按 前導離子的速度等速向陽極前進

14、，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣， 陽極檢測。不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同W寸E)，淌度大的離子 區(qū)帶電場強度??；沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假 設“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2” 區(qū)；當“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊。毛細管等速電泳的特點：界面明顯，富集、濃縮作用；6色譜理論日益完善的基礎上逐步興起的結合體，是電泳遷移原理和色譜分離原理相結合的新型微分離分析技術。CEC是在1974年首先提出的，Pretorious95指出 在毛細管中可以使用電流作為驅動力，但由于使用的毛細管內

15、徑太大，未能顯示 出電色譜的優(yōu)勢。因此直到20世紀80年代毛細管電色譜才開始受到人們的廣泛 重視。1981年，Jorgenson等96使用ODS毛細管填充柱，嘗試以電滲流來推動 流動相，同時高效分離了幾種中性化合物，成為毛細管電色譜發(fā)展中的里程碑。根據(jù)所用毛細管柱的不同，CEC可以分為以下三種經典方法：填充毛細管電 色譜(p-CEC)、開管毛細管電色譜(OT-CEC)和整體毛細管電色譜。1982年Tsuda 等97首次進行了開管毛細管電色譜(OT-CEC)實驗，證明了開管毛細管電色譜 (OT-CEC)具有很高的分離能力。毛細管電色譜對中性化合物的分離機制主要基 于分析物與固定相間的相互作用，對

16、帶電化合物的分離取決于分析物的電泳淌度 和其與固定相間的親和性。是在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液， 以電滲流為流動相，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程。Table E毛細管電泳的兒種分離模式及其主要分離機理主要分福機h七細管區(qū)諾沽泳（CZE）海疝在n倉溶撤中的淌博;命溶晰分J KI七區(qū)荷/質量比元升膠火電匕縮管色詁（MEKC）磨質在膛柬與水 相間分闈系數(shù)的菁異匕細件等皂聚焦 giEF）溶質密11點片異E細管等速|_泳（CITP）溶成如電場梯度下的分布龍并巨翊骨電色語（CEC）悅相存在卜濟質分配系數(shù)貳異另外還可以按操作方式重新分為手動、半制動及全自動型毛細管電泳，或按

17、分離通道形狀分為圓形扁形方形毛細管電泳等等。我們還可以通過對分配系數(shù)Kp、電滲率Uos、電泳淌度u等的取舍，重新歸類 毛細管電泳。但是無論采用何種分類方法，毛細管電泳總是包含了一族或是一類 的方法，不是一種或者單一的方法。毛細管電泳的多種分離模式，給樣品分離提 供了不同的選擇機會，這對復雜樣品的分離分析，是非常重要的。第二章檢測器檢測器是毛細管電泳儀的關鍵部件，靈敏度是檢測器的重要指標，常用的商 品檢測器有紫外和熒光兩種，此外也有電化學和質譜檢測器。最常用的是紫外檢 測器，靈敏度順序為固定波長可變波長光電管二極管。紫外檢測器這是高效液相（HPLC）和高效毛細管電泳（HPCE）中使用最多的一種，

18、其原 理就是朗伯-比爾定律。目前有三種主要類型，即固定波長、可變波長、二極管 陣列檢測器。需要指出的是紫外檢測器因其光路長度受毛細管內徑的限制，使得 其檢測靈敏度相對較低，通常在幾個ppm的水平上，它的線性范圍通常在34 個數(shù)量級。它的檢測光窗就在毛細管柱上。熒光檢測器熒光檢測器是高效毛細管電泳靈敏度較高的一種檢測器，它的檢測下限可到10-15 mol的水平，激光誘導熒光檢測器的靈敏度則跟高。它的原理與高效液相中熒光 檢測器相同，激發(fā)光可以使紫外光也可以是激光。與紫外光譜一樣，熒光檢測也 是在柱上進行，它是將一個孤光燈或一束激光發(fā)生的輻射聚焦在毛細管壁上，通 過一個棱鏡系統(tǒng)或則光導纖維將產生的

19、熒光收集到一個與激光光束成900的位 置。通常用的激光光源的波長是325nm，強度為5-10 mV的He-Cd光源。3 電化學檢測器電化學檢測器是微柱分離體系的理想檢測方法。這主要由于反應是在電極表面上 進行的，檢測池的小型化有利于待測物質向電極表面的傳遞，當電極表面積減小 時，可提高信噪比，因此，毛細管電泳的電化學檢測器允許使用微電極。電化學 檢測法主要有安培發(fā)、電導法和電勢法，其中安培法最靈敏。利用碳電極和金屬 電極進行毛細管電泳（HPCE ）安培檢測，檢測限可達10-810-9mol/L。由于其只 對電活性物質有響應，選擇性較好。安培檢測器不需要光學元器件，制造簡單， 造價低。因此其作為

20、電化學檢測的代表正在成為生化分析技術中很有前景的新技 術。4質譜檢測器質譜可以提供檢測物質分子量和結構信息的重要檢測技術，質譜儀有很多 種類，如CZE，MEKC，CITP，CGE和ACE以及CEC等都能與質譜檢測 器成功地連接，其中應用較多的仍是CZE-MS。MEKC由于添加表面活性劑形成的膠束會抑制樣品離子的信號， 所以MEKC-MS使用較少。與CE相 連的MS最常用的電離方式是ESI，可以直接把樣品分子從液相轉移到氣相， 而且可以測定分子量較大的樣品。與CE相連的質譜儀主要有三元四極（QQQ）質譜儀，離子阱（TTT）質譜儀，傅立葉轉換離子回旋加速器共振 （FT-ICQ）質譜儀和飛行時間（T

21、OF）質譜儀等，前兩者較為常用。CE-MS 常用的接口有無套管接口，液體接合接口和同軸套管流體接口等三種，后 兩種接口均在毛細管流出部分引入補充流體，以維持一個穩(wěn)定的電噴霧流。 CE-MS所使用的緩沖液最好是易揮發(fā)、低濃度，可獲得較好的離子流響應。 與質譜相連的CE中常使用加入較高含量的有機溶劑（例如甲醇、乙睛）的 緩沖液或者使用非水毛細管電泳，有利于離子噴霧過程，可以增進檢測的 靈敏度。天然植物藥各組分之間以及藥物與其代謝產物之間往往結構比較 相似，用CE-MS無論對分離及鑒定都顯示了優(yōu)勢。Henion等用同軸套管流 體接口，全掃描質譜方式分離了8種合成的異哇琳生物堿，對威氏黃柏（Phenl

22、lodendron wilsonii）樹皮中的8種組分進行了分離并鑒定了其中的 6 種。Unge等用同樣接口將盧竹堿等巧種叫垛類生物堿和生物胺基線分離。 此外，離子噴霧（Ionspray，ISP），大氣壓化學電離（APCI）等也被應用在 CE-MS 中。第三章毛細管電泳分離條件的選擇毛細管電泳的基本操作包括毛細管的安裝、洗滌、電泳介質的灌入、進樣和分離 等。進樣和分離是比較重要的部分。進樣方法有電遷移、壓力進樣、場放大進樣 等。分離一般采用恒壓模式，也可采用恒電流和恒功率模式。分離條件一般包括 緩沖液、電滲控制、電場強度、溫度、分離模式等。分離電壓一般，在毛細管柱的長度確定時，隨著分離電壓的增

23、加，電滲流和電泳速度 的絕對值都將增加。遷移時間縮短。同時升高電壓，毛細管電泳電流增加，產生 的焦耳熱增加，使溶液內部產生溫度梯度，從而影響柱效。因此適宜的電壓是毛 細管電泳所必須的。電泳緩沖液電泳分離過程是在緩沖液中進行的，緩沖液直接影響離子的遷移和最后的分 離，甚至影響進樣過程。選擇緩沖液要遵循如下原則：（1）在所選擇的pH范圍 內有很好的緩沖容量（2）較低的背景吸收（3）自身的淌度低，即分子體積大， 電荷小，這樣產生的焦耳熱小，有利于提高柱效（4）只要條件允許，盡量采用 酸性溶液，有利于獲得較小的電滲流淌度和較大的分離度。緩沖液的濃度是一個 很重要的指標，增加濃度，可以使離子強度增加，可

24、以明顯增加緩沖液的容量， 減小溶質組分與毛細管內壁的相互作用，改變遷移時間，改善分離。但是當濃 度增加時，毛細管電泳電流增加，焦耳熱增加，影響分離度。添加劑添加劑是CE中一個十分重要的控制因素，表面活性劑是使用最多的一種。 表面活性劑均可用于毛細管區(qū)帶電泳和毛細管膠速電動色譜中，前者的表面活性 劑的濃度低于其臨界膠速濃度，后者則相反。后者主要用作準固定相。常用的有 SDS、十六烷基三甲基季氨漠、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、2-（嗎琳）乙烷 磺酸（MES）、甲基纖維素、PEG等。有機溶劑也可被廣泛用作添加劑，不同有機溶劑的作用各不相同。有機溶劑的加 入可以明顯的減少電滲流速度，使分離度增加。

25、它還可以增加有機樣品的溶解度， 改變選擇性。常用的有甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸酎等。手性添加劑的加入可以極大地改善手性對映體的分離度，通常用作手性分離添加 劑的有環(huán)糊精及其衍生物、冠醚、膽汁鹽、抗生素等，50%的手性分離使用的是 環(huán)糊精。進來也有用杯芳烴進行手性分離的研究成果報道。手性拆分有直接和間 接拆分兩種。直接拆分分為1主客體配合2配位體交換配合3手性交束包容蛋白 質親和等類型。主客體配合是指被分析物質在空間上與主體分子形成配合物的過 程，通常用的主體分子有環(huán)糊精和手性冠醚，目前杯芳烴衍生物也得到了一定的 應用。間接拆分實際上是一種柱前衍生后進行CE分離的方法，衍生試劑應滿足 以下條件1

26、反應快產物穩(wěn)定沒有消旋過剩試劑不干擾測定含有很強的生色基團 和熒光性質。4溫度在CE中，溫度的影響主要通過粘度體現(xiàn)出來，淌度是粘度的函數(shù)，因此溫度的 控制非常重要。儀器的進展1檢測器和聯(lián)用技術近年來，毛細管電泳的檢測器和聯(lián)用技術發(fā)展很快，Zhang和Paze綜述了熒光 檢測器 的進展96-97, Liu綜述了電化學檢測器的進展98, Matysik綜述了 在非水毛細管電泳中，電化學、熒光和質譜檢測器的特點及其應用99, Wu綜 述了毛細管電泳整體檢測技術，該技術在 毛細管等點聚焦中有著較好的應用前 景100。有關CE的聯(lián)用技術也有較快的發(fā)展，Von Brocke A101綜述了 CE-MS的進

27、展，Miranda綜 述了流動注射與CE聯(lián)用技術的進展102, Valcarcel綜述了用于在線樣品預處理的自動恒流系統(tǒng)（CFS-CE）與CE的聯(lián)用 技術103，陳義等研究了瑞利光散射檢測器和CE的聯(lián)用，并用于測定金屬離 子104。2微流控芯片（Chips）:微流控芯片作為一個重要的技術領域，得到越來越多 的關注，其所涉及的對象從生物、生物小分子（氨基酸、神經遞質）、膠體微 粒到金屬離子、無大分子（DNA、蛋白、糖）機物等。對于微流控芯片的裝置、 理論研究和應用的最新進展有多篇綜述105-109。展望毛細管電泳也存在一些問題 1毛細管制備能力差，光路太短，非高靈敏度的檢測器難以測出樣品峰；凝

28、膠、色譜填充管需要專門的灌制技術；大的側面/截面積比能放大吸附的作用，導致蛋白質等的分離效率下降或無峰；吸附引起電滲變化，進而影響 分離重現(xiàn)性等，目前尚難以定量控制電滲。CE技術的研究和應用，給藥物分析領域和藥品檢驗工作帶來了生機與 活力，無疑將對該專業(yè)技術的發(fā)展及提高起著重要的推動和促進作用。尤 其以對基因工程藥物、中成藥復方制劑的分析和中藥材種屬的鑒定，令人 矚目。但任何事物都有兩面性，它也有弱點和不足，如有的藥物用CE分析精確度還不夠高；有的靈敏度很高，但專屬性界定尺度又不易掌握；CE儀器昂貴，很難普遍推廣等等，都需要不斷研究解決。尤其以如何巧妙地與 其它方法和技術（如HPLC、MS等）

29、聯(lián)合使用，以收到更好的效果，是今后 CE技術研究、完善的方向和課題?？上驳氖?，這方面的工作已開始啟動， CE 一 HPLC、CE 一 MS聯(lián)用己取得高效率、高質量的分析成果。經過科學工 作者的不懈努力，一個藥物分析領域的新技術快速發(fā)展時期即將到來。Table 1-2珈管龜泳技術的應用0應用領域參考女獻氨基酸、貧11質和多（1I0-H9I勝.藥物介析120- 127食析128 - 133環(huán)境分析134 - 136手性汁離【61 f 5物化常數(shù)測定87-90，137-1401Hjerten S. Free zone electrophoresis. Chromatographic Reviews.

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