纖維素酶在動(dòng)物營養(yǎng)中的應(yīng)用

1、纖維素酶在動(dòng)物營養(yǎng)中的應(yīng)用自從 1906年Seiiliere在蝸牛的肖化液中發(fā)現(xiàn)能夠分解天然纖維素的纖維素酶以來，纖維素酶的研究受到動(dòng)物營養(yǎng)界的普遍關(guān)注，尤其是近年來隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的研究取得了一定的成果。1 纖維素酶的種類纖維素酶按其來源可分為真菌源性纖維素酶和細(xì)菌源性纖維素酶兩種。細(xì)菌源性的纖維素酶來源于分解纖維素的細(xì)菌，如瘤胃細(xì)菌（黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和熱纖梭菌等，產(chǎn)量和活性較低。真菌源性纖維素酶來源非常廣泛，所有能分解晶體纖維素的真菌，均能或多或少的分泌纖維素酶。目前，國內(nèi)外工廠化生產(chǎn)采用的菌種大多數(shù)是木霉、曲霉和青霞等。生產(chǎn)高質(zhì)量纖維素酶的關(guān)鍵

2、是高產(chǎn)菌株的選育，我國自20世紀(jì)70年代就開始了這方面研究，目前已利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)進(jìn)行誘變培養(yǎng)，選育出了康代木霉NT15H、NT15HI、黑曲霉XT15H、XT15HI、綠色木霉等高產(chǎn)菌株，并投入工廠化生產(chǎn)。2 纖維素酶的組成纖維素酶是一種多組分的酶系，采用各種層析、電泳等技術(shù)可將纖維素酶分成不同的組分。就目前研究結(jié)果看，至少包括三類性質(zhì)不同的酶。21 內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶來自真菌簡(jiǎn)稱EG，來自細(xì)菌簡(jiǎn)稱Len。這類酶一般作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解-1，4-糖音鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素如纖維糊精、纖維二糖、纖維三糖等。22 外切-1，4一葡聚

3、糖酶來自真菌簡(jiǎn)稱CBH，來自細(xì)菌簡(jiǎn)稱Cex。此類酶可從纖維素酶的非還原末端一個(gè)一個(gè)地依次切下葡萄糖單位，產(chǎn)物為一葡萄糖。該酶對(duì)纖維寡糖的親合力強(qiáng)，能迅速水解內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的纖維寡糖，其專一性較強(qiáng)。23 -葡萄糖著酶簡(jiǎn)稱BG。該酶可水解纖維二糖和短鏈纖維寡糖生成葡萄糖。對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。該酶的專一性差，實(shí)際上可作用于所有的葡萄糖-二聚物。2.4 三類酶的協(xié)同降解機(jī)制上述三類纖維素酶在分解纖維素時(shí)，任何單獨(dú)一種都不能裂解晶體纖維素，只有三種酶共同存在并協(xié)同作用時(shí)才能完成水解過程。一般來說，外切酶作用于不溶性纖維素的表面，使形成晶體結(jié)構(gòu)的纖維素分子鏈裂

4、開，長(zhǎng)鏈分子末端部分發(fā)生游離，從而使纖維素易于水化；內(nèi)切酶則作用于經(jīng)外切酶活化的纖維素，分解其-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；-葡聚糖苷酶再將纖維二糖、纖維三糖等分解為葡萄糖。應(yīng)當(dāng)指出，該協(xié)同降解作用的順序不是絕對(duì)的，而且各酶的功能也不是這樣簡(jiǎn)單固定的。3 纖維素酶的理化性質(zhì)不同來源的纖維素酶理化性質(zhì)不盡相同。同一菌株產(chǎn)生的同一酶在不同報(bào)道中也存在一定的差異。如 Inghn等（1980）報(bào)道的來源于擬氏木霉（Trichodenn reesei）的-葡萄糖苷酶的最適pH值為6.5，在40下最穩(wěn)定，以纖維H糖為底物的Km為33nunoll，分子量為98KD，而Fogarty和Ke

5、lly（ 1990）描述的擬氏木霉來源的-葡萄糖甘醇的分子量為47KD，等電點(diǎn)（PI）為547，同時(shí)，Woodward（1981）報(bào)道的擬氏木霉來源的-葡萄糖苷酶的最適pH為4.8，以纖維二糖為底物的Km值為19mmol/l。多數(shù)真菌和少數(shù)細(xì)菌的纖維素酶都可糖基化。糖基與蛋白質(zhì)間以共價(jià)鍵結(jié)合，或呈可解離的絡(luò)會(huì)狀態(tài)。糖基化作用在一定程度上可保護(hù)纖維素酶免受蛋白酶的水解，同時(shí)，纖維素酶由于糖基化使其所含碳水化合物比例在不同酶之間發(fā)生差異，導(dǎo)致酶的多形式和分子量的差異。真菌的EG包括兩種異構(gòu)酶EGI和EGlll。EGI的PI為42，分子量為54KD，由437個(gè)氨基酸組成。EGHl的PI為4856，分

6、子量為49SKD，由397個(gè)氨基酸組成。木霉的CBH的異構(gòu)酶為CBHI和CBHI。其中CBHI的PI為42，分子量為66KD，由496個(gè)氨基酸組成。CBHI的PI為59，分子量為53KD，由447個(gè)氨基酸組成。BG的PI為7585，分子量為7080KD，由714個(gè)氨基酸組成。4 纖維素酶的結(jié)構(gòu)對(duì)纖維素酶結(jié)構(gòu)的研究表明，盡管氨基酸排列順序不同，但許多酶的蛋白質(zhì)構(gòu)架卻有一定的相似性。一般纖維素酶分子是由具有催化功能的催化域（Cellulos binding domains CBD）和具有纖維素結(jié)合功能的結(jié)合（吸附）域（Cellulos binding domains，CBD）及連接它們的連接序列（

7、Link）和保守重復(fù)序列組成。41 催化域（CD） 它體現(xiàn)催化活性及對(duì)特定水溶性底物的特異性。依據(jù)催化域氨基酸序列的同一性（idenhty）和流水基團(tuán)分析（drophibic clusteransts）可將纖維素酶（-1，4-葡聚糖酶）的催化域分為A、B、C、D、E、F、G、H、I九個(gè)屬（falnil）。目前僅了解了擬氏木霉的CBHII的催化域的三維結(jié)構(gòu)。該催化域的活性部位是一個(gè)封閉的隧道結(jié)構(gòu)，僅能通過一個(gè)纖維素分子。有的纖維素酶不止有一個(gè)催化域，如來源于解糖熱解纖維菌（Caldocellum Saccharolytican）的 celB，在 N端有一個(gè)外切酶的催化域，在C端有一個(gè)內(nèi)切酶的催化

8、域，而且，這兩個(gè)催化域?qū)俨煌膶佟?2 結(jié)合域（CBD） 它對(duì)酶的催化活力是非必需的，但執(zhí)行調(diào)節(jié)酶對(duì)可溶性和非可溶性底物的專一性活力的作用。目前，已報(bào)道有8種不同的結(jié)合域（Gilkes et al 1991，Tomne et al 1995），它們可位于肽鏈的N端或C端。一些細(xì)菌的CBD順序有一定的共同特點(diǎn)，如帶電荷的氨基酸含量低，羥基氨基酸含量很高，有保守的色氨酸、天冬氨酸和甘氨酸殘基。但也有的纖維素酶沒有CBD，如熱纖梭菌是依賴?yán)w維素酶系中的纖維小體（celluome）吸附纖維素的。CBD的作用機(jī)理還不清楚，有人認(rèn)為，CBD是通過氫鍵穩(wěn)定結(jié)合結(jié)晶底物的。43 連接序列 連接序列富含脯氨酸、

9、羥基氨基酸或甘氨酸，長(zhǎng)度從659個(gè)氨基酸不等。其作用可能是保持CD與CBD之間的距離，也可能有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。但有些纖維素酶并沒有這種顯著的連接序列。44 重復(fù)序列 許多纖維素酶包含一個(gè)長(zhǎng)度從20到150個(gè)氨基酸的重復(fù)序列。如來源于Clostridium thermocellum的內(nèi)切葡聚糖酶（5個(gè)）和來源于解纖維梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶（1個(gè)），它們的重復(fù)序列為24個(gè)氨基酸大小的高度保守序列，重復(fù)兩次。重復(fù)序列可位于蛋白的C端或中部連接序列之前或之后。重復(fù)序列的功能目前還不清楚，對(duì)有些酶的研究發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)酶的催化活性是非必需的。5 纖維素酶的基因克隆和高效表達(dá)迄今為止，人們已

10、經(jīng)從40多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆到了纖維素酶的基因，其中大多數(shù)的核苷酸序列已被測(cè)定。大多數(shù)克隆的纖維素酶基因能夠在Ecoli中表達(dá)出可檢測(cè)的EG和CBH活力。Zhou等（1999）利用重組大腸桿菌高效表達(dá)了來源于菊歐文氏菌的內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶基因celZ。但在大腸桿菌中表達(dá)纖維素酶基因存在兩個(gè)問題，一是不易提取，二是表達(dá)水平低。為此，人們將目光轉(zhuǎn)向了真核表達(dá)系統(tǒng)。目前，應(yīng)用較多的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母作為一般傳統(tǒng)的工業(yè)微生物不產(chǎn)生毒素，用其表達(dá)纖維素酶基因，其產(chǎn)物高度糖基化，經(jīng)正確加工修飾可直接分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平高。如酵母表達(dá)的李氏木霉CBHll、EGI的產(chǎn)量可達(dá)100mgh以上，并具

11、有正常的生物學(xué)活性。6 纖維素酶的作用機(jī)理6.1 補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，刺激內(nèi)源酶分泌不同動(dòng)物消化道的酶系組成不同。牛羊等反芻動(dòng)物消化道中雖有一定量的微生物存在，但產(chǎn)生的纖維素酶數(shù)量有限，使纖維素的消化吸收受到一定限制。而雞豬等單胃動(dòng)物由于體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素酶不能消化纖維素，導(dǎo)致日糧中占相當(dāng)比例的營養(yǎng)物質(zhì)隨纖維素作為糞便排出。添加纖維素酶可補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，提高動(dòng)物對(duì)粗纖維的利用率。同時(shí)，還可改善消化道酶系的組成、酶量及活性。62 破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收植物的細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等組成。它們?cè)诩?xì)胞外形成一層穩(wěn)定而堅(jiān)固的外殼，阻止了畜禽對(duì)細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。纖維

12、素酶可在半纖維素酶、果膠酶等的協(xié)同作用下，破壞植物的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物裸露出來，被淀粉酶和蛋白酶進(jìn)一步降解，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率。6.3 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料營養(yǎng)價(jià)值植物性飼料進(jìn)人畜禽消化道后，其中的纖維素、半纖維素、果膠等大分子物質(zhì)可部分溶解產(chǎn)生粘性溶液，使消化道內(nèi)容物的新度增加，對(duì)內(nèi)源酶形成了一個(gè)物理屏障，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。日糧中添加纖維素酶以后，在半纖維素酶、果膠酶、-葡聚糖酶等的共同作用下，可將纖維素、半纖維素、果膠、戊糖等大分子物質(zhì)降解為單糖和寡糖，使消化道內(nèi)容物的輪度降低，增加內(nèi)源酶的擴(kuò)散，增大酶與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。7 纖維素酶的應(yīng)用

13、現(xiàn)狀7.1 應(yīng)用方法在實(shí)際生產(chǎn)中，通常將纖維素酶與半纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶等組成復(fù)合酶添加到飼料中。目前，國內(nèi)外利用纖維素酶的方法有體外酶解法和體內(nèi)酵解法兩種。前者是把纖維素酶和秸稈飼料拌勻，在一定溫度、濕度和pH下堆積或密封發(fā)酵一定時(shí)間，晾干后直接飼喂動(dòng)物。該法效果好，但費(fèi)工費(fèi)時(shí)，成本高。后者是把纖維素酶以添加劑的形式加到精料內(nèi)，拌勻后飼喂動(dòng)物，借助于動(dòng)物消化道的內(nèi)環(huán)境發(fā)揮作用。該法簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣泛。7.2 飼喂效果72.1 反芻動(dòng)物 伊清強(qiáng)（1991）在綿羊日糧中添加纖維素酶 309只日，使處于牧草期的綿羊日增重提高了541，使處于枯草期的綿羊日增重提高了491，同時(shí)使羊毛的產(chǎn)量提高

14、了504。焦平林等(1996)用閹牛試驗(yàn)，在日糧中按每頭每日添加纖維素酶409，飼喂60天。結(jié)果表明，加酶組日增重為892789，對(duì)照組日增重為7648g，差異極顯著（P0.01）。 Lewis et al等（1999）報(bào)道，纖維素水解酶按一定比例添加于飼料中能夠提高泌乳早期和泌乳中期奶牛的泌乳量。Yang（1999）在對(duì)泌乳期荷斯坦奶牛飼喂纖維素水解酶（主要為纖維素酶和木聚糖酶）的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酶的添加提高了飼料消化率和產(chǎn)奶量。吳建設(shè)等（對(duì)洲）報(bào)道，荷斯坦奶牛每日兩次添加瘤胃保護(hù)纖維素酶（共15g頭日），顯著提高了35FCM標(biāo)準(zhǔn)乳產(chǎn)量（PO05），乳脂率也有一定程度的提高（P005）。722

15、雞 李文斌等（1996）進(jìn)行蛋雞日糧添加纖維素酶的試驗(yàn)，添加水平分別為800、1200 1600、3200Iukg，結(jié)果表明以添加 3200Iukg效果最好，雞群產(chǎn)蛋率提高24.7（PO01），飼料報(bào)酬提高236（P001）。徐齊友等（1998）在蛋雞日糧中添加01、015 05的纖維素酶，結(jié)果表明，產(chǎn)蛋期間產(chǎn)蛋率分別提高053、 125和 288。Galante（1998）在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，-葡聚糖酶能提高肉仔雞。雛雞和母雞的飼料消化吸收率及日增重。許樣榮（2000）研究報(bào)道，肉仔雞高效日糧中添加-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶，使采食量和日增重分別提高了47（P0.05）和98（P001），料重比降低了48(PO01)。72.3 豬 清強(qiáng)等（1992）報(bào)道，在基礎(chǔ)日糧中添加 06和 12的纖維素復(fù)合酶，結(jié)果生長(zhǎng)育肥豬增重比對(duì)照組分別提高了16.84和21.86。Wank等（1993）報(bào)道添加纖維素酶后，使中性洗滌纖維的消化率由303提高到34.1，酸性洗滌纖維從688提高到739。但李寶玉等（2000）報(bào)道，在以玉米一豆粕為基礎(chǔ)的日糧中添加纖維素酶對(duì)生長(zhǎng)豬的生產(chǎn)性能無作用。Li和Sawer(1997）報(bào)道，添加纖維素酶制劑，除能提高大麥一豆粕型口糧中蛋白和能量的消化利用率外，其它口糧如典型的玉米一豆粕口糧，對(duì)豬的生長(zhǎng)性