生殖激素水平和睪丸體積對非梗阻性無精癥患者精子存在的預(yù)

1、生殖激素水平和睪丸體積對非梗阻性無精癥患者精子存在的預(yù)測價值馮 科，張翠蓮，李杭生，郭海彬 （450003 鄭州，河南省人民醫(yī)院生殖中心）摘要 目的 探討非梗阻性無精癥（non-obstructive azoospermia，NOA)患者生殖激素水平、睪丸體積等參數(shù)對睪丸內(nèi)是否存在精子的預(yù)測價值，以及可用于預(yù)測TESA結(jié)果的切點值，為NOA患者避免手術(shù)創(chuàng)傷提供臨床參考資料。 方法 將我中心男科門診就診的133例NOA患者按TESA的結(jié)果分為有精子組和無精子組，測定生殖激素水平、睪丸體積、精漿果糖，中性-糖苷酶、染色體、AZF等。 結(jié)果 有精子組和無精子組左側(cè)睪丸體積（mL）：9.1202.25

2、和 6.2542.63，右側(cè)睪丸體積（mL）：9.2302.02和 6.4712.48，促卵泡生成素(FSH，mIU/mL):9.8202.09和 22.6215.0，總睪酮（TT，ng/mL）：5.1900.68 和4.1551.82，總睪酮/黃體生成素（T/LH）：0.6060.19 和0.5740.35，總睪酮/雌激素（T/E2）：162.416.66 和141.493.4。無精子組血清FSH顯著高于有精子組，優(yōu)選的FSH水平切點值為13.31mIU/mL時，其敏感度為74.1%，特異性為96.2%。FSH水平ROC曲線的AUC為0.850，表明其診斷準確性中等。 結(jié)論 就單一因素而言，

3、FSH水平對于NOA患者預(yù)測睪丸內(nèi)是否有精子發(fā)生具有相當(dāng)重要的價值，并且價值明顯優(yōu)于睪丸體積，兩者的聯(lián)合應(yīng)用對非梗阻性無精子癥患者預(yù)測其睪丸內(nèi)精子存在更有意義。關(guān)鍵詞 非梗阻性無精子癥；促卵泡生成素；睪丸體積；預(yù)測價值中圖法分類號 文獻標志碼 AThe predictive value of reproductive hormone levels and testicular volume of non-obstructive azoospermia patients exist spermFeng Ke，Zhang Cuilian, Li Hangsheng, Guo Haibin (Rep

4、roductive Medical center,Henan Provincial People s Hospital , Zhengzhou,450003)Abstract: Objective：To investigate patients with non-obstructive azoospermia reproductive hormone levels, testicular volume and other parameters of the existence of sperm in the testis predictive value , as well as cut -p

5、oint values can be used to predict the outcome of TESA , thus non- obstructive azoospermia patients avoid unnecessary surgical trauma to provide important clinical information. Methods The 133 cases of non-obstructive azoospermia my male outpatient center on the result divided by TESA sperm group an

6、d no sperm group , and measured levels of reproductive hormones and testicular volume and related tests.Results There are no sperm sperm group and testis volume (ml), follicle-stimulating hormone (FSH, mIU / ml), total testosterone (TT, ng / ml), T / LH, T/E2 levels were : L: 9.120 2.25 and 6.2542.6

7、3, R: 9.230 2.02 and 6.4712.48,9.820 2.09 and 22.62 15.0,5.190 0.68 and 4.155 1.82,0.606 0.19 and 0.574 0.35,162.4 16.66 and 141.4 93.4. No sperm serum FSH group was significantly higher than sperm without sperm group TT , T / LH, T/E2 significantly lower sperm group .Preferred FSH levels cut point

8、is 13.31mIU/ml, a sensitivity of 74.1% and a specificity of 96.2%. AUC of FSH levels ROC curve is 0.850 , indicating that the diagnostic accuracy is mod- erate Conclusions For a single factor is concerned , FSH levels for patients with non-obstructive azoospermia prediction whether spermatogenesis h

9、as very important value within the testis , and its value much better than testicular volume .Combination of the two factors makes more sense for non-obstructive azoospermia prediction exist with their testicular sperm.Key words: Non-obstructive azoospermia ; follicle stimulating hormone ; testicula

10、r volume ; predictive valueSupported by the scientific and technological projects of health Department of Henan Province 2011020127 .Corresponding author: Guo Haibin, E-mail:基金項目 河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項目（2011020127）通信作者 郭海彬， HYPERLINK mailto:E-mail： E-mail： 無精癥患者占男性不育的10%20%，其中包括梗阻性無精癥（obstructive azoospermia,O

11、A）和非梗阻性無精癥（nonobstructive，NOA)。前者可以通過經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（percutaneous epididymal sperm aspiration, PESA）和經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)（testicular sperm aspiration,TESA）得到精子，而后者因為精子庫精子相對匱乏，生育問題未能得到很好的解決。隨著顯微取精和輔助生殖技術(shù)的進步，NOA患者有機會通過卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）得到血親子代，但受技術(shù)及設(shè)備等因素的制約，國內(nèi)大多數(shù)生殖中心尚未開展顯微取精和微量精子冷凍技術(shù)，況且顯

12、微取精需要切開睪丸，創(chuàng)傷較大，破壞其血供，容易形成瘢痕粘連，甚至睪丸萎縮，獲精率偏低。如何把取精風(fēng)險降低，又能使患者最大可能地獲得可利用精子？這就需要對NOA患者生精能力給予更客觀、科學(xué)的評估，對通過外科手術(shù)獲得精子的概率進行預(yù)測。雖然該類手術(shù)較小，但是有創(chuàng)的操作，會對患者產(chǎn)生心理及生理上的影響。在臨床工作中，能否利用NOA患者的睪丸體積和生殖激素水平等因素預(yù)測其睪丸內(nèi)能否找到精子，以及可能性的大小，這對于該類患者是否需要外科手術(shù)取精，以及能否利用試管嬰兒技術(shù)獲得血親后代十分重要，也可為NOA患者建立無創(chuàng)評估體系提供重要資料。本研究回顧分析我院133例NOA患者的臨床資料，分析睪丸大小與生殖激

13、素水平等參數(shù)對TESA結(jié)果的預(yù)測價值，尋找能夠通過外科手術(shù)發(fā)現(xiàn)精子的睪丸體積和生殖激素水平的切點值，以期為NOA患者是否需要接受外科手術(shù)治療提供臨床依據(jù)。資料與方法1.1 研究對象及分組 2013年1月至2014年1月在河南省人民醫(yī)院生殖中心男科門診就診的NOA患者133例，排除染色體為47，XXY的患者，年齡2241歲，不育年限112年，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)男子不育標準化檢查與診療手冊1，通過詳細的病史采集、體格檢查，采用Prader睪丸模型作比擬法測量睪丸體積，記錄其大小。按照WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊2經(jīng)連續(xù)3次以上精液離心后進行沉淀鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，結(jié)合精

14、漿果糖、中性糖苷酶及B超結(jié)果排除梗阻性因素。根據(jù)睪丸穿刺結(jié)果分為無精子組和有精子組。無精子組100例，有精子組33例。所有研究對象簽署知情同意書，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。1.2 睪丸穿刺的方法所有患者完善術(shù)前檢查，由本中心同一位男科醫(yī)師完成手術(shù)過程。取平臥位，常規(guī)消毒鋪巾，左手拇指、食指、中指固定較大一側(cè)睪丸，1%的利多卡因局部浸潤麻醉，專用的帶側(cè)孔的睪丸穿刺針（一次性無菌溶藥20 mL注射器）沿前者的針孔進入睪丸組織，左手擠壓睪丸組織，右手負壓抽吸組織。若一次獲取組織較少，可反復(fù)穿刺，將取出的睪丸組織織分成2份，1份針刺破碎后在400倍的倒置顯微鏡下仔細尋找精子，另1份置于Bouins固

15、定液中送病理檢查。兩側(cè)睪丸只要發(fā)現(xiàn)精子即認為是有精子，否則為無精子。術(shù)后局部消毒，紗布固定包扎。1.3 生殖激素測定方法 清晨8：0010:00空腹抽取靜脈血，分離血清后，分別測定促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone， FSH），黃體生成素（Luteinizing hormone， LH），總睪酮（Total testosterone， TT），催乳素（Prolactin， PRL），雌激素（Estrogen， E2），并計算總睪酮/黃體生成素（T/LH）、總睪酮/雌激素（T/E2）。德國羅氏公司Elecsys-2010全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測，試劑、標

16、準品均由Roche Diagnostics GmbH公司提供。試劑批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于3.0%。1.4 AZF基因微缺失檢測方法 序列標簽(STS)位點根據(jù)歐洲男科學(xué)協(xié)會(EAA)和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)(EMQN)推薦的標準設(shè)計，分別為AZFa區(qū)的sY84(326bp)和sY86(320bp)、AZFb區(qū)的sY127(274bp)和sY134(301bp)、AZFc區(qū)的sY254(400bp)和sY255(126bp)，由Invitrogen公司合成。每個樣品分為A、B組進行多重PCR實驗，A組包括sY254、sY86、sY127，B組包括sY84、sY134、sY255。PCR反

17、應(yīng)總體系為10L，包括去離子水、緩沖液、dNTP、DNA聚合酶及模板。PCR擴增條件:95 預(yù)變性15 min，95 變性30 s，57 退火60 s，72 延伸60 s，共35個循環(huán)，72 延伸10 min，最后4 保溫。取PCR擴增產(chǎn)物5L，加1L 6上樣緩沖液，在3.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，100 V電壓電泳45 min，紫外燈下觀察分析。1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用表示，兩組數(shù)據(jù)間的差異比較采用非參數(shù)檢驗。通過Logistic回歸分析,篩選出與患者行睪丸穿刺活檢發(fā)現(xiàn)精子相關(guān)程度較高的指標為FSH(2=29.468，P0.01)。應(yīng)用受試者工作特征曲線( r

18、eceiver operating curve，ROC)對NOA患者睪丸體積、FSH等數(shù)值進行優(yōu)選，尋找最佳切點值，繪制ROC曲線，計算ROC曲線下的面積( Area under the curve，AUC)來判斷監(jiān)測方法的優(yōu)劣。2 結(jié)果2.1 睪丸體積和生殖激素水平 研究對象的年齡、睪丸體積和生殖激素水平等參數(shù)統(tǒng)計學(xué)比較結(jié)果見表1。兩組之間FSH、睪丸體積、TT、T/LH和T/E2差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)SH尤為顯著（P0.01）。我院生殖中心男科實驗室生殖激素的正常參考范圍,FSH:1.512.4mIU/mL，LH:1.78.6mIU/mL，PRL:4.0415.2ng/mL，TT:2.8

19、8 ng/mL，E2:7.6342.6pg/mL。表1 兩組患者的年齡、睪丸體積、生殖激素水平等參數(shù)的比較()參數(shù) 有精子組（n=33） 無精子組（n=100) P值年齡(歲) 28.273.56 28.634.44 0.632 左睪丸（mL） 9.1202.25 6.2542.63 0.001右睪丸（mL） 9.2302.02 6.4712.48 0.001FSH(mIU/mL) 9.8202.09 22.6215.0 0.01LH(mIU/mL) 8.5651.77 9.2976.12 0.403PRL(ng/mL) 16.234.14 16.439.06 0.882TT(ng/mL) 5

20、.1900.68 4.1551.82 0.01E2(pg/mL) 31.294.90 32.8713.19 0.409T/LH 0.6060.19 0.5740.35 0.002T/E2 162.416.66 141.493.4 0.003 2.2 睪丸體積、生殖激素水平參數(shù)對睪丸穿刺結(jié)果的預(yù)測 采用Logistic回歸分析檢驗發(fā)現(xiàn)：FSH對預(yù)測NOA患者睪丸內(nèi)是否存在精子的擬合優(yōu)度最佳（Wald X2=23.592,P0.01），其次為睪丸體積（Wald X2=21.173,P0.01),第3為T/LH(Wald X2=20.413,P0.01)，其他參數(shù)在回歸分析模型中擬合度不佳。2.3

21、利用ROC曲線優(yōu)選生殖激素水平的切點值假設(shè)以睪丸穿刺結(jié)果為“金標準”，優(yōu)選睪丸體積和生殖激素水平預(yù)測穿刺結(jié)果的切點值。以睪丸穿刺結(jié)果為狀態(tài)變量，分別以睪丸體積和生殖激素水平及相關(guān)參數(shù)為檢驗變量建立ROC曲線。利用ROC曲線分析各個數(shù)值切點的敏感性和特異性。當(dāng)FSH的切點值為13.31mIU/mL時，其敏感度為74.1%，特異性為96.2%。睪丸體積切點值為8.5mL,其敏感度為68%，特異性為93.8,提示睪丸體積對NOA患者診斷預(yù)測能力中等。另外，LH、PRL、T、T/LH、T/E2 AUC分別為0.470、0.429、0.657、0.637、0.669。圖1 促卵泡生成素ROC曲線的切點值

22、（AUC=0.850）2.4 兩組數(shù)據(jù)中AZF基因微缺失的分布情況 無精子癥組AZF缺失患者高于有精子癥組，其中聯(lián)合缺失高達7%。有精子組AZF基因微缺失多集中在c區(qū)。表2 AZF基因微缺失在有精子組和無精子組中的分布n(%)組別 AZFc(%) AZFa(%) AZFa+b(%) AZFb+c(%)有精子組 9.09(3/33) 3.03(1/33) 0(0/33) 3.03(1/33)無精子組 0(0/100) 4(4/100) 3(3/100) 4(4/100)3 討論精子的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，其中涉及到有絲分裂和減數(shù)分裂并且還有40多種酶的參與。這一過程發(fā)生在睪丸內(nèi)部，通過血睪屏障和

23、人體的免疫系統(tǒng)隔離，有其相對的獨立性。非梗阻性無精癥是一種最嚴重的精子發(fā)生障礙，目前對它的評估和治療還是一種嚴峻的挑戰(zhàn)。雖然對它的診斷有一套完整的方案，但是對非梗阻性無精癥患者來說在臨床中通過藥物治療和外科手術(shù)找到精子的機會還是很小。對這類患者來說，不管是傳統(tǒng)的TESA還是睪丸切開顯微取精術(shù)（micro-TESE），都有創(chuàng)傷，會給患者造成一定的生理和心理上的影響，尤其是術(shù)后未發(fā)現(xiàn)精子的時候。為了避免給患者帶來不必要的創(chuàng)傷，如何從臨床和實驗室指標來預(yù)測精子的發(fā)生及發(fā)生的可能性，仍需深入研究。下丘腦-垂體-睪丸性腺軸對精子的發(fā)生起著重要的調(diào)控作用。下丘腦分泌GnRH, GnRH激活垂體前葉的腺苷酸

24、環(huán)化酶，刺激垂體前葉分泌FSH和LH。FSH主要作用于精子成熟的最后階段，促進次級精母細胞發(fā)育為精子細胞和精子，刺激支持細胞發(fā)育，并促進其產(chǎn)生一種能結(jié)合雄激素的蛋白質(zhì)，通過這種蛋白質(zhì)，使生殖細胞獲得穩(wěn)定高濃度的雄激素，促進生殖細胞發(fā)育分化為成熟的精子。精子的發(fā)生和維持，需要垂體分泌的FSH和睪丸間質(zhì)細胞分泌的睪酮的協(xié)同作用。多數(shù)學(xué)者都在關(guān)注FSH與非梗阻性無精癥的相關(guān)性研究，尋找促使精子發(fā)生的相關(guān)因素，試圖建立非梗阻性無精癥的無創(chuàng)傷評估體系。對非梗阻性無精子癥的診斷，睪丸組織的穿刺病理檢查結(jié)果仍是重要的一環(huán)。國外有文章報道針對非梗阻性無精癥患者采用micro-TESE獲取精子的概率達到了50.

25、3%3。隨著國內(nèi)外顯微取精技術(shù)的發(fā)展，越來越多的非梗阻性無精癥患者會愿意接受顯微手術(shù)治療，進而通過微量精子冷凍和單精子卵細胞漿內(nèi)注射技術(shù)獲取后代，但是目前國內(nèi)仍有部分生殖中心因人員、設(shè)備及技術(shù)等因素尚未開展顯微取精技術(shù)和微量精子冷凍技術(shù)。本研究主要利用生殖激素水平和睪丸體積及相關(guān)參數(shù)來預(yù)測精子存在的可能性，避免非梗阻性無精癥患者接受不必要的外科手術(shù)治療，節(jié)約有限的醫(yī)療資源，減輕患者經(jīng)濟及精神上的壓力。Ramasamy等4通過睪丸切開顯微取精術(shù)研究792例非梗阻性無精癥患者，按FSH水平將患者分為4組: 15IU/mL、15FSH30IU/mL、30FSH45IU/mL、45IU/mL，比較發(fā)現(xiàn)

26、FSH15IU/mL組的患者獲取成熟精子的機會顯著大于FSH15IU/mL。Chen等5通過對208例非梗阻性無精癥患者行FSH檢驗和TESA手術(shù)進行了一項前瞻性研究，按照TESA是否找到成熟精子分為兩組，尋找FSH的切點值為19.4mIU/mL，等于或高于此值的患者沒有發(fā)現(xiàn)精子。本研究發(fā)現(xiàn)在各個參數(shù)中FSH對預(yù)測非梗阻性無精癥患者睪丸內(nèi)是否存在精子價值最大，通過ROC曲線分析其切點值為13.31mIU/mL，大于此值即認為睪丸內(nèi)無可利用精子，小于此值認為睪丸內(nèi)能發(fā)現(xiàn)可利用精子，其敏感度為74.1%，特異性為96.2%。根據(jù)以往的臨床經(jīng)驗和文獻顯示睪丸的體積大小跟睪丸的生精功能是呈正相關(guān)的，在

27、無精子癥患者中睪丸體積小于6mL就認為精子發(fā)生的可能性非常小。Golpi等6研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)睪丸體積12mL時，在非梗阻性無精癥患者發(fā)現(xiàn)精子的機會為61.11%，當(dāng)8mL睪丸體積12mL時，機會為48.21%，當(dāng)睪丸體積8mL時，機會為42.19%。同時他認為睪丸體積對于預(yù)測精子是否存在是個有意義的參數(shù)。有學(xué)者認為睪丸體積比FSH對非梗阻性無精子癥患者睪丸內(nèi)精子發(fā)生的預(yù)測價值更大7，但本研究發(fā)現(xiàn)睪丸體積對預(yù)測精子是否存在的價值低于FSH。隨著生精功能障礙程度的加重，睪丸體積的縮小趨勢就越明顯8，從本研究的ROC曲線結(jié)果看，當(dāng)非?；颊叩牟G丸體積大于8.5mL時，找到精子的可能性較大，反之較小。它的預(yù)測

28、價值低于FSH，但明顯優(yōu)于其他參數(shù)。這一研究結(jié)果與王雨新等9的研究一致。但是比Golpi等6研究的能發(fā)現(xiàn)精子的睪丸體積偏高，考慮可能是手術(shù)取精的方式不同，前者手術(shù)取精方式更為精細。從FSH和睪丸體積對精子存在的預(yù)測價值看，作者認為兩者的聯(lián)合應(yīng)用對非?；颊邔⒏幸饬x。在睪丸內(nèi)部，促黃體生成素作用于間質(zhì)細胞的黃體生成素受體，使其分泌睪酮，睪酮反過來也會抑制LH的分泌。睪酮和雄烯二酮經(jīng)過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇，兩者之間的平衡以及平衡的持續(xù)將有益于精子的發(fā)生。Giorgio 等10研究來曲唑在非?；颊咧械淖饔?，發(fā)現(xiàn)T/E210的患者服用后精子的數(shù)量明顯增多，可能是受益于T/E2趨于更合理的比

29、例。本研究結(jié)果顯示染色體異常和生精因子的微缺失可以作為一個獨立的預(yù)測睪丸內(nèi)是否存在精子的參數(shù)。Prafulla S 等11研究發(fā)現(xiàn)在印度中部地區(qū)Y染色體微缺失在重度少弱精子癥和無精子癥患者中占有8.33%，其中AZFc缺失高達84.6%。Ali A Dabaja 等12發(fā)現(xiàn)AZFc缺失的患者通過顯微鏡下睪丸切開發(fā)現(xiàn)精子的機會為72%，而AZFa、AZFb缺失的患者卻沒有找到精子。鄭菊芬等8研究發(fā)現(xiàn)AZF基因微缺失概率與生精障礙程度無高度相關(guān)性，但是NOA患者中AZF基因微缺失概率達到15%以上，AZF基因微缺失可能是NOA患者的主要遺傳原因。本研究中無精子組AZF缺失患者明顯高于有精子組，無精

30、子組AZF的聯(lián)合缺失達到7%。提示在臨床工作中，一旦發(fā)現(xiàn)AZF的聯(lián)合缺失，最好不行外科手術(shù)尋找精子。參考文獻：1Rowe P J, Comhaire F H, Hargreave T B, 等.世界衛(wèi)生組織男性不育標準化檢查與診療手冊M李錚，張忠平，黃冀然，等. 譯北京: 人民衛(wèi)生出版社，2007: 43-44.2 國家人口和計劃生育委員會科學(xué)技術(shù)研究所、中華醫(yī)學(xué)會男科學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會精子庫管理學(xué)組. 世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊M5 版 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2011: 35-36.3 Esteves S C. Microdissection testicular

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