qPCR技術(shù)概述課件

1、qPCR技術(shù)概述第1頁，共45頁。目錄第一部分：RNA提取RNA的重要性RNA提取的方法RNA質(zhì)量的鑒定第二部分：熒光定量 熒光定量的原理和方法 熒光定量的應用 市場上常見的熒光定量產(chǎn)品2022/8/202第2頁，共45頁。2022/8/203從RNA開始到基因拷貝數(shù)的定量或者表達研究，已經(jīng)成為大多數(shù)實驗的主流設計方案，也是RNA相關(guān)課題研究的首選思路。完整RNA的提取和純化,是進行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、RNA芯片，mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。1. RNA提取的重要性第3頁，共45頁。2022/8/2041. RNA提取的重要性

2、第4頁，共45頁。2. RNA提取方法2022/8/205細胞內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（ SDS、胍鹽等),迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，抑制RNA酶的活性，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。 通過有機溶劑（酚、氯仿 等）處理可以使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總RNA。第5頁，共45頁。2. RNA提取方法2022/8/206欲提取RNA的樣本釋放出RNA 得到純化的總RNA 對RNA保存異硫氰酸胍，胍鹽/-巰基乙醇等，對細胞進行裂解有機溶劑或硅基質(zhì)吸附等方法對RNA進行純化第6頁，共45頁。2. RNA提取方法樣品準備2022/8

3、/207樣本最好用新鮮或者速凍(不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70冰箱中)的沒有經(jīng)過反復凍融的樣本。樣品預處理方式：不同來源的樣品（如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織、細胞等）因細胞結(jié)果不同預處理方式亦有所不同。一般處理方式如下： 植物材料液氮研磨 動物材料勻漿(液氮條件下)、液氮研磨 細菌溶菌酶破壁第7頁，共45頁。2. RNA提取方法細胞裂解異硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）:TRIzol方法，Invitrogen公司最先開發(fā)，應用于大部分動植物材料，但對次生代謝較多的植物材料，RNA提取效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，并將RNA釋放到溶液中。而酸性苯酚可促使RNA進入水相

4、，離心后可形成水相和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。2022/8/208基因組DNA水相有機相RNA第8頁，共45頁。2. RNA提取方法細胞裂解 胍鹽/-巰基乙醇法： Qiagen公司最先開發(fā),此方法適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。胍鹽使細胞充分裂解，-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程可以抑制RNase的活性，保護RNA不被降解2022/8/209第9頁，共45頁。2. RNA提取方法細胞裂解2022/8/2010其他方法：有些植物材料多糖多酚，如植物果實，番茄葉子等；有些植物木質(zhì)化程

5、度較高，如根莖等組織，這些都會導致RNA提取過程的困難。如：纖維組織（心臟，骨骼肌等）由于這些組織細胞密度低，單位重量組織中RNA含量低，所以需要增加起始量。蛋白/脂肪含量高的組織（腦，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮狀物，需要重新抽提。第10頁，共45頁。2. RNA提取方法純化2022/8/2011純化原則：消除RNA樣品中存在的對酶（如逆轉(zhuǎn)錄 酶）有抑制效應的有機溶劑和高亮度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類分子的污染。排除DNA分子的污染第11頁，共45頁。2. RNA提取方法純化有機溶劑抽提法抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)沉淀：用異丙醇或乙醇來沉淀水相中的

6、RNA洗滌：75%的乙醇洗滌，去除鹽離子溶解：加入適量的RNase-free ddH2O2022/8/2012第12頁，共45頁。2. RNA提取原理純化硅基質(zhì)吸附法 利用核酸與硅基質(zhì)材在高鹽條件下結(jié)合，低鹽條件下脫離的特征。2022/8/2013第13頁，共45頁。3.RNA評價與鑒定 提取RNA后我們需要對RNA進行相關(guān)的質(zhì)量檢測， 以確定它是否符合后續(xù)試驗的要求。RNA用于不同的后續(xù)試驗，對其質(zhì)量要求不盡相同。如：cDNA文庫構(gòu)建：要求RNA完整，且無酶抑制物殘留Northern blot ：對RNA的完整性要求高RT-PCR:對酶反應抑制物殘留要求嚴格2022/8/2014第14頁，共

7、45頁。3.RNA評價與鑒定RNA純度檢測分光光度計法通過OD260/280來檢測RNA的純度，OD260/230作為參考OD260/280在1.9-2.1之間，可以認為RNA的純度較好；OD260/280小于1.8，則表明蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多；OD260/280大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；OD260/230小于2.0，表明裂解液中有異硫氰酸胍和-疏基乙醇的殘留。2022/8/2015第15頁，共45頁。3.RNA評價與鑒定 rRNA占總RNA的80%-85%，在瓊脂糖凝膠上可以清晰的看到28S(23S)和18S（16S）rRNA。當28S rRNA的量約為18S rRNA的兩倍的 時候，說明

8、RNA的完整性較好2022/8/2016 RNA完整性鑒定瓊脂糖凝膠電泳第16頁，共45頁。第二部分：實時熒光定量PCR2022/8/2017在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線和CT值對未知模板進行定量分析的方法。 第17頁，共45頁。1.qPCR原理和方法2022/8/2018實時熒光定量PCR是1996年由Applied Biosysrems 公司推出的實驗技術(shù)；常用的熒光標記方法：1，非特異性熒光標記（染料法）： 1、SYBR Green 2、EvaGreen 3、LC Green2，特異性熒光標記（探針法）： 1、TaqMan 2、

9、Molecular Beacon 3、Amplisensor第18頁，共45頁。1.qPCR原理和方法SYBRB Green基本原理: SYBR Green I是一種結(jié)合于所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光，當DNA雙鏈分開，無熒光。 2022/8/2019SYBR Green第19頁，共45頁。SYBR GREEN法優(yōu)缺點優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性-適用于任何DNA使用方便-不必設計復雜探針非常靈敏 便宜缺點：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性（但可以通過溶解曲線的分析優(yōu)化反應條件）對引物特異性要求較高2022/8/20201.qPCR原

10、理和方法SYBRB Green第20頁，共45頁。1.qPCR原理和方法SYBR Green熔解曲線分析利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴增。2022/8/2021SYBR GREEN 熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確第21頁，共45頁。1.qPCR原理和方法SYBR Green 熔解曲線分析2022/8/20221，融解曲線分析，有雜峰；2，其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確。第22頁，共45頁。1.qPCR原理和方法Taq man探針法5端標

11、記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探針2022/8/2023第23頁，共45頁。1.qPCR原理和方法Taq man探針法2022/8/2024第24頁，共45頁。1.qPCR原理和方法Taq man探針法2022/8/2025Taq man探針法優(yōu)缺點：優(yōu)點：對目標序列高特異性-陰性結(jié)果確定設計相對簡單-與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好缺點：只適合一個特定的目標價格較高不容易找到本底低的探針第25頁，共45頁。1.

12、qPCR原理和方法Molecular Beacon 分子信標2022/8/2026分子信標是一段熒光標記、具有莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸探針環(huán)兩端各有5-6個核苷酸配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，5端報告基團，3端淬滅基團在PCR反應的退火/延伸階段，分子信標與靶序列特異結(jié)合，分子信標由發(fā)夾結(jié)構(gòu)變?yōu)殒湢罱Y(jié)構(gòu)第26頁，共45頁。1.qPCR原理和方法Taq man探針法2022/8/2027Taq man探針法優(yōu)缺點：優(yōu)點：對目標序列高特異性 檢測SNP最靈敏的試劑之一。熒光背景低缺點：只適合一個特定的目標價格較高不容易找到本底低的探針第27頁，共45頁。2.qPCR原理和方法 定量原理2022/8/2028第

13、28頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2029Fluores cence第29頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2030Ct值的定義：CT值： C代表Cycle，T代表閾值(threshold)，CT值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。CT值由閾值確定第30頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2031閾值(threshold) 缺省值設定為基線（baseline，即本底信號）范圍(3-15個循環(huán))內(nèi)熒光信號強度標準偏差的10倍。閥值由基線確定第31頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理20

14、22/8/2032理想的PCR反應: XnX0 * 2nXn ：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n ：擴增循環(huán)數(shù)第32頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2033非理想的PCR反應: XnX0 * (1+En)n Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n： 擴增循環(huán)數(shù)En: 擴增效率第33頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2034在擴增產(chǎn)物達到閾值線時: XCt=X0(1+Ex)Ct=M - (1)XCt：熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量. 在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得: lg

15、 M=lg X0(1+Ex)*Ct-(2)整理方程式(2)得: lg X0= -Ctlg(1+Ex) + lg M- (3)擴增產(chǎn)物的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量。第34頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理2022/8/2035熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線10410310610510210濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量第35頁，共45頁。2.qPCR原理和方法定量原理絕對定量 目的是測定未知樣品的準確拷貝數(shù)或濃度，需要已知準確拷貝數(shù)或濃度的標準品，

16、需要制作標準曲線，數(shù)據(jù)處理比較方便，容易理解。相對定量 不需要測定未知樣品的準確拷貝數(shù)或濃度，只需要知道樣品之間的濃度比值。所以，標準品可以是已知準確拷貝數(shù)或濃度的標準品，但是，最常用的方法是通過稀釋目的基因的PCR產(chǎn)物作為標準品；標準品可有可無。數(shù)據(jù)處理相對復雜，比較難理解。2022/8/2036第36頁，共45頁。絕對定量2022/8/2037敏感性高: 檢測低拷貝數(shù)樣品;區(qū)分小差異樣品大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測: 100 1010省時有效臨床檢測，轉(zhuǎn)基因檢測環(huán)境監(jiān)測等第37頁，共45頁。標準曲線法相對定量舉例2022/8/2038第38頁，共45頁。標準曲線法相對定量舉例2022/8/20

17、39設置內(nèi)標：b-actin、GAPDH等管家基因?qū)Π谢蜻M行均一化：靶基因拷貝每一個內(nèi)標基因拷貝 雙標準曲線法 含靶基因與含內(nèi)標基因的濃度梯度質(zhì)粒分別做標準曲線； 樣本靶基因與內(nèi)標基因絕對濃度的換算，并均一化處理， 標本間靶基因的表達水平分析 2 -c(t) 法 標本內(nèi)靶基因與內(nèi)標基因Ct值比較： C(t) =C(t)m- C(t)n 標本間C(t) 比較： c(t) C(t)1-C(t) 2 -c(t) 計算第39頁，共45頁。標準曲線法相對定量舉例2022/8/2040第40頁，共45頁。標準曲線法相對定量舉例2022/8/2041第41頁，共45頁。3. qPCR的應用1，定量分析2，定性分析2022/8/2042第42頁，共45頁。3.qPCR的應用定量分析絕對定量分析：DNA 或 RNA 的絕對定量分析 病原微生物或病毒含量的檢測 ,轉(zhuǎn)基因動植拷貝