基因突變與DNA損傷修復(fù)課件

1、基因突變與DNA損傷修復(fù)主講：楊在君本章主要內(nèi)容點(diǎn)突變及其分子效應(yīng)點(diǎn)突變的誘變劑自發(fā)突變動(dòng)態(tài)突變DNA損傷修復(fù)機(jī)制基因突變的檢測(cè)一、點(diǎn)突變及其分子效應(yīng)2、點(diǎn)突變的類型1、概念：point mutation: 指單個(gè)堿基的改變，簡(jiǎn)言之突變發(fā) 生在基因的一個(gè)“點(diǎn)”上。類型堿基替換堿基增加及缺失轉(zhuǎn)換：Py Py; Pu Pu，多見(jiàn)顛換：Py Pu ; Pu Py ，少見(jiàn)插入1個(gè)堿基對(duì)刪除1個(gè)堿基對(duì)3、點(diǎn)突變的分子效應(yīng) 同義突變（synonymous mutation):堿基序列的改變沒(méi)有引起產(chǎn)物氨基酸序列的改變,與密碼子的簡(jiǎn)并性有關(guān)。TACTTATUACUAUTyrTyrDNARNAAA（1）突變發(fā)

2、生在基因編碼區(qū)內(nèi) 錯(cuò)義突變（missense mutation): 堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變。TACTTCCUACUCCTyrSerDNARNAAA 有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)活性甚至完全無(wú)活性，從而影響了表現(xiàn)型。如果該基因是必須基因，則稱為致死突變。 有些錯(cuò)義突變的產(chǎn)物仍有部分活性，使表型介于野生型與突變型之間的中間類型，稱為滲漏突變。 有些錯(cuò)義突變不影響或基本上不影響蛋白質(zhì)的活性，不表現(xiàn)明顯的性狀變化，稱為中性突變。 無(wú)義突變（nosense mutation): 某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子，使蛋白質(zhì)合成提前終止，因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般是沒(méi)有活性的。

3、TACTTAAUACUAATyr終止DNARNAAA 移碼突變（frameshift mutation): 由于插入或缺失單個(gè)或幾個(gè)（非3個(gè)）堿基，從而改變了自突變位點(diǎn)到開(kāi)放閱讀框的終止密碼子間的全部序列。（2）突變發(fā)生在基因非編碼區(qū)內(nèi)4、可逆轉(zhuǎn)的突變效應(yīng) 當(dāng)某個(gè)基因A突變成a以后，也可以再向反方向發(fā)生突變，回復(fù)成原來(lái)的A，并使表型恢復(fù)原狀，這叫回復(fù)突變（reverse mutations/ reversion/back mutation）正向突變（Forward mutation）：是引起基因型從野生型變?yōu)橥蛔冃偷耐蛔?。Aa回復(fù)突變正向突變（1）真正回復(fù)（true reversion)對(duì)原來(lái)

4、突變的嚴(yán)格逆轉(zhuǎn)AAA (Lys)GAA (Glu)AAA (Lys)wild-typemutantwild-typeReverseForwardTrue reversion（2）抑制（基因）突變（suppressor mutation) 一種突變的效應(yīng)可由另一種抑制基因突變（suppressor mutation）來(lái)減少或取消，即：在不同于原來(lái)的位點(diǎn)的突變（也叫第二或第二點(diǎn)突變Second-site mutation）a/xReversea/xb/ysuppressor5、功能喪失突變和獲得功能的突變（1）功能喪失突變（loss of function mutation) 蛋白質(zhì)的活性減弱或消

5、除，通常為隱性突變。（2）獲得功能的突變（gain of function mutation) 這種突變賦予了蛋白質(zhì)異常的活性，并可能產(chǎn)生新的表型。13.2 點(diǎn)突變的誘變機(jī)制誘發(fā)突變（induced mutation）：由各種誘變劑誘發(fā)產(chǎn)生的突變。誘變劑（mutagen）：凡是可以誘發(fā)基因突變的因素（物理，化學(xué)）稱為誘變劑，某些誘變劑往往同時(shí)具有致癌作用，因而又稱為致癌劑（carcinogen）。誘變劑的作用機(jī)制：（1）取代DNA中的一個(gè)堿基；（2）改變一個(gè)堿基使之在DNA復(fù)制中發(fā)生錯(cuò)配；（3）破壞一個(gè)堿基使其在正常情況下不能和任何堿 基配對(duì)。1、堿基類似物： 其分子結(jié)構(gòu)極其相似于DNA分子中

6、的正常堿基，故可以結(jié)合進(jìn)復(fù)制的DNA鏈中去。（1）5-溴尿嘧啶（5-BU）： 引起突變的原因是：它們能夠以互變異構(gòu)體的狀態(tài)形式存在。一種普通狀態(tài)（酮式）和一種稀有狀態(tài)（烯醇式）兩種狀態(tài)中的每一種狀態(tài)與DNA的一種不同的堿基配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生堿基對(duì)替換突變（substitution mutation）。5-BU誘變機(jī)制（2）2-氨基嘌呤（2-AP）： 引起突變的原因是：它既可以作為腺嘌呤的類似物與胸腺嘧啶配對(duì)，當(dāng)發(fā)生質(zhì)子化后又可以與胞嘧啶發(fā)生錯(cuò)配。 2AP誘導(dǎo)堿基轉(zhuǎn)換突變，可以從AT GC或GCAT，取決于它最初整合進(jìn)入DNA時(shí)的狀態(tài)。2、堿基改變： 某些誘變劑并不摻入DNA而是通過(guò)堿基改變（bas

7、e alteration) 從而造成特異性的堿基錯(cuò)配。（1）烷化劑 烷化劑是帶有一個(gè)或幾個(gè)不穩(wěn)定烷基的化合物，能同堿基起作用，使之帶上烷基（CH3，CH2CH3），繼而引起復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)配。烷化劑種類很多，比較常用的有：乙基甲磺酸（Ethyl methane sulfonate， EMS）亞硝基胍（Nitrosoguanidine, NG）（2）嵌入劑嵌入劑原黃素（proflavin） 吖啶橙（acridine） 溴化乙淀（Ethidiumbromide）嵌入劑是一些扁平的分子，可以嵌入DNA的堿基對(duì)之間，造成堿基對(duì)發(fā)生傾斜。并在嵌入位置導(dǎo)致單核苷酸對(duì)的插入/缺失，引起移碼突變。3、堿基損傷 某

8、些誘變劑可以造成單個(gè)或多個(gè)堿基損傷（base damage）因而DNA復(fù)制時(shí)不能進(jìn)行特定的、正常的配對(duì)。DNA聚合酶不能越過(guò)那些損傷的堿基而導(dǎo)致復(fù)制過(guò)程被阻斷。（1）紫外線（UV） 紫外線引起突變，因?yàn)镈NA中嘌呤和嘧啶堿基在紫外分布區(qū)（254260nm）有一個(gè)非常強(qiáng)的紫外光吸收，在該波長(zhǎng)UV能誘導(dǎo)相鄰嘧啶形成嘧啶二聚體，直接影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。（2）黃曲霉素B1（aflatoxin B1, AFB1）AFB1 AFB1在鳥(niǎo)嘌呤N7位置上形成加成復(fù)合物，導(dǎo)致堿基和糖之間的糖苷鍵斷裂，因此釋放出堿基形成無(wú)嘌呤位點(diǎn)。4、基因的定點(diǎn)突變 基因的定點(diǎn)突變（site specific mutagen

9、esis of gene) 是指按照人們的意愿對(duì)基因的編碼區(qū)和表達(dá)調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子區(qū)）進(jìn)行缺失、插入或堿基替換等過(guò)程。（1）寡核苷酸誘導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變 將某基因克隆到載體上人工合成含有突變位點(diǎn)的一對(duì)引物（突變位點(diǎn)位于引物中心附近，兩端有足夠的序列足以互補(bǔ)配對(duì)）PCR擴(kuò)增Dpn酶切將突變DNA轉(zhuǎn)入受體篩選重組子。（2）雙引物法13.3 自發(fā)突變概念：自發(fā)突變（spontaneous mutation) : 在無(wú)人干預(yù)的條件下，自然發(fā)生的基因突變。突變率（mutation rate)：在一個(gè)世代中或其他規(guī)定的單位時(shí)間內(nèi)，在特定條件下，一個(gè)細(xì)胞發(fā)生某一突變事件的概率。1、自發(fā)突變的特征突變的稀有性

10、。高等生物的自發(fā)突變率一般為110-5110-10；細(xì)菌的自發(fā)突變率一般為 110-4110-10突變的可逆性 。染色體缺失或重復(fù)的突變不可逆his+his-210-6410-8his+his-正向回復(fù)突變的多方向性和復(fù)等位性。一個(gè)基因可以向不同的方向突變，形成一個(gè)以上的等位基因。 A a1, a2, a3 . anAa2aa1突變可以發(fā)生在生物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的任何一個(gè)時(shí)期，但生殖細(xì)胞中的突變率最高。2、自發(fā)突變的機(jī)制（1）自發(fā)損傷脫嘌呤脫氨基 過(guò)氧化物原子團(tuán)（O2-）、（H2O2）、（OH-）等有氧代謝的副產(chǎn)物，都是有活性的氧化劑， 它們可導(dǎo)致DNA的氧化損傷，T氧化后產(chǎn)生T乙二醇，G氧化后產(chǎn)

11、生8-氧-7-氫脫氧鳥(niǎo)嘌呤， 8-氧-7-氫脫氧鳥(niǎo)嘌呤可和A錯(cuò)配，導(dǎo)致GT。（2）堿基的氧化損傷（3）DNA復(fù)制錯(cuò)誤（4）其他可能的機(jī)制放射性同位素射線、宇宙射線、紫外線等理化因素。劇烈變化的溫度和極端溫度。特殊結(jié)構(gòu)的基因，不能被損傷修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別。自發(fā)突變也與重復(fù)序列有關(guān)。13.4 動(dòng)態(tài)突變（自學(xué)）13.5 DNA損傷修復(fù)機(jī)制 如果所有DNA損傷都不修復(fù)，細(xì)胞將很快死亡，這是因?yàn)橹滤劳蛔兊姆e累和依賴于DNA完整性的一些關(guān)鍵過(guò)程被抑制(這些過(guò)程包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄)。細(xì)胞發(fā)展了眾多的機(jī)制來(lái)處理DNA損傷，這可被分為以下幾類：光復(fù)合修復(fù)（photoreaction repair or light rep

12、air）切除修復(fù)（excision repair）錯(cuò)配修復(fù)（DNA mismatch repair）重組修復(fù)（recombinational）SOS修復(fù)（SOS repair)（1） 光復(fù)合修復(fù)Photoreactivation repair: uses a white-light-dependent enzyme to split cyclobutane pyrimidine dimers formed by ultraviolet light.在可見(jiàn)光的激活下，光修復(fù)酶結(jié)合于胸腺嘧啶二聚體處，并催化解聚為單體的過(guò)程。不同的生物體利用不同的類似酶。（2） 切除修復(fù) 切除修復(fù)是在DNA內(nèi)切酶、

13、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶等共同作用下，將DNA分子受損傷的部分切除，并以完整的一條鏈為模板，合成切除的部分使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過(guò)程。 切除修復(fù)過(guò)程中，損傷的DNA鏈由切除酶（excinuclease）切除，此酶也是一種核酸內(nèi)切酶。編碼內(nèi)切酶是由多個(gè)亞基組成的Uvr基因。 切除修復(fù)切口切口UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶OHPDNA連接酶NAD+大腸桿菌中的UvrA可識(shí)別DNA損傷部位，引導(dǎo)UvrB和UvrC與其結(jié)合形成復(fù)合體。由UvrC完成對(duì)DNA 單鏈的切割，被切除的堿基在解鏈酶的作用下從DNA上脫離，然后由DNA聚合酶以互補(bǔ)鏈合成DNA，DNA連接酶封閉其缺口，

14、從而完成DNA損傷修復(fù)。 患者不能接受太陽(yáng)的紫外線，否則在皮膚暴露部位就會(huì)誘發(fā)皮膚癌，通過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)，該病患者皮膚細(xì)胞中的切除修復(fù)酶系統(tǒng)存在缺陷，不能對(duì)UV誘發(fā)的大量DNA損傷進(jìn)行有效的修復(fù)，特別是人的抑癌基因p53發(fā)生突變就會(huì)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。 著色性干皮癥（xeroderma pigmentosum） AP 核酸酶修復(fù)途徑 在DNA鏈上無(wú)嘌呤和無(wú)嘧啶位點(diǎn)叫做AP位點(diǎn)。AP核酸內(nèi)切酶可以通過(guò)剪切AP位點(diǎn)上的磷酸二酯鍵使鏈斷裂，進(jìn)一步由外切酶、DNA polI 和連接酶進(jìn)一步進(jìn)行修復(fù)。（3） 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（DNA mismatch repair system，MMR）可能在DNA

15、復(fù)制過(guò)程中對(duì)于錯(cuò)配堿基的修復(fù)和由此產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)換發(fā)揮一定的作用，現(xiàn)在已知許多生物包括人類中均存在具有一定方向性的錯(cuò)配修復(fù)體系。通常錯(cuò)配系統(tǒng)傾向于修復(fù)新生鏈上的堿基。因此對(duì)正確母鏈和錯(cuò)配子鏈的區(qū)分至關(guān)重要：親本鏈上帶有甲基，剛合成的子鏈尚未甲基化 E. coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)包括9個(gè)蛋白成分，其中最重要的有MutS、MutL、與MutH，MutS識(shí)別錯(cuò)誤配對(duì)的堿基并與其結(jié)合（MutS二聚體）、MutL和MutH蛋白按順序加入，并與Muts協(xié)同作用。MutH在含有錯(cuò)配堿基的單鏈上切口，在螺旋酶II作用下解開(kāi)雙螺旋。隨后在一種雙向性外切酶的作用下依次從切口處切除，直到切除錯(cuò)誤的核苷酸。再由DNA po

16、lIII 填充空隙，進(jìn)行修復(fù)合成，最后由連接酶連接。由于切口和錯(cuò)配核苷酸相距很遠(yuǎn)（12kb）,故這種修復(fù)是一種長(zhǎng)片段修復(fù)。（4） 復(fù)制后修復(fù)-重組修復(fù)系統(tǒng)a 復(fù)制：以損傷單鏈為模板復(fù)制時(shí)，越過(guò)損傷部 位，對(duì)應(yīng)位點(diǎn)留下缺口；未損傷單鏈復(fù)制成完整雙鏈。b 重組：缺口單鏈與完整同源單鏈重組，缺口轉(zhuǎn)移到完整鏈，使損傷單鏈的互補(bǔ)鏈完整，損傷單鏈仍然保留。c 再合成：轉(zhuǎn)移后的缺口以新的互補(bǔ)鏈為模板聚合補(bǔ)齊。（5） SOS 修復(fù) SOS 修復(fù)（SOS repair） 這也稱差錯(cuò)傾向修復(fù)（error prone repair），是細(xì)胞中的DNA 受到大規(guī)模損傷，嚴(yán)重影響其生存，在其他修復(fù)難以見(jiàn)效的情況下，被誘

17、發(fā)出來(lái)的一種高效修復(fù)系統(tǒng)，這種修復(fù)是為了保命也就管不了修補(bǔ)的片段是否正確,這也是生物為了維持其生命的延續(xù)，不得已采取的一種以犧牲遺傳物質(zhì)的忠實(shí)性，冒著產(chǎn)生大量基因突變風(fēng)險(xiǎn)的“保命”措施。表現(xiàn)特點(diǎn): 細(xì)胞內(nèi)原有的修復(fù)酶（切除修復(fù)、 重組修復(fù)）合成量增加；誘導(dǎo)產(chǎn)生的修復(fù)酶（SOS聚合酶）來(lái)修復(fù)損傷部位。 SOS 反應(yīng) 機(jī)體受到大劑量的誘變產(chǎn)生大規(guī)模DNA損傷時(shí)，可產(chǎn)生一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS response），包括生長(zhǎng)抑制、分裂停止、呼吸受阻、整合在宿主基因組上的原噬菌體釋放、細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的許多基因關(guān)閉，同時(shí)有一些應(yīng)激狀態(tài)下的新基因開(kāi)放等，這些基因使機(jī)體DNA損傷得以高效修

18、復(fù)，細(xì)菌又可逐漸回復(fù)到正常狀態(tài)。 SOS修復(fù)機(jī)制a 通過(guò)式修復(fù)：正常的DNA多聚酶復(fù)制到損傷位點(diǎn)時(shí)，其活性受到抑制，短暫抑制后產(chǎn)生一種新的DNA多聚酶，該酶可以通過(guò)損傷部位，由于其修復(fù)校正功能較低，新合成的DNA堿基錯(cuò)配頻率較高，易引起突變。b 切除式修復(fù)：如果DNA雙鏈上均有損傷，而且距離較近，機(jī)體可能先對(duì)其中一條鏈采取切除式修復(fù)，一個(gè)位點(diǎn)修復(fù)正常，另一個(gè)則產(chǎn)生錯(cuò)誤，再對(duì)另一條鏈切除式修復(fù)，又會(huì)保留這個(gè)基因突變。也可能在復(fù)制后由外切酶的作用下擴(kuò)大缺口，發(fā)生通過(guò)式修復(fù)產(chǎn)生錯(cuò)誤，形成新的突變。13.6 基因突變的檢測(cè)1、病毒和細(xì)菌基因突變的檢測(cè) 利用寄主范圍、生長(zhǎng)速度、噬菌斑大小、形態(tài)等性狀可檢測(cè)病毒突變。抗性突變檢測(cè)： 通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗生素或噬菌體即可篩選細(xì)菌抗性突變體。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變檢測(cè)：利用在完全培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的影印培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。首先采用青霉素富集法濃縮大量突變體，再進(jìn)行負(fù)選擇。2、真菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢測(cè)分生孢子誘變處理基本培養(yǎng)基 未萌發(fā)孢子萌發(fā)菌絲培養(yǎng)去除(過(guò)濾)少數(shù) 死亡營(yíng)養(yǎng)野生型 孢子缺陷型(去除) 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基3、果蠅突變體