人工種子與植物脫毒詳解課件

1、第4章 人工種子與植物脫毒人工種子的概念和研制的意義人工種子技術(shù)離體繁殖體培養(yǎng)人工種子的包埋技術(shù)人工種子的貯藏人工種子的應用前景人工種子（Artificial seeds）任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子。胚狀體或不定芽人工種子亦稱體細胞種子(somatic seeds)，又稱合成種子（synthetic seeds） 。人工種子的種類根據(jù)包被的程度可將人工種子分為三大類：裸露的或休眠的繁殖體人工種皮包被的繁殖體水凝膠包被的繁殖體人工種子的研究狀況1978年，英國Murashige首先提出人工種子。歐洲列入尤里卡計劃、日本和美國列入優(yōu)先發(fā)展生物技術(shù)

2、計劃。我國1987年將其列入國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃。據(jù)報道，目前已對26個科，36個屬的植物進行了人工種子研究。其研究范圍顯示出兩大特點：經(jīng)濟作物和糧食作物的人工種子日益增多以微器官作為繁殖體的報道日益增多，其中包括微芽、微枝、原球莖、小鱗莖、小塊莖。以器官為繁殖體的人工種子物種繁殖體主要結(jié)果印度桑(Morus indica)芽無菌條件下發(fā)芽成苗檀香(Santalum ablum)芽無菌條件下發(fā)芽成苗花葉芋(Caladium bicolor)芽無菌條件下發(fā)芽成苗百合(Lilium)小鱗莖無菌條件下發(fā)芽成苗直桿桉樹(E. maideni)側(cè)芽無菌條件下發(fā)芽成苗萵苣(Lacyuca sativa

3、)芽無菌及有菌下發(fā)芽成苗華腺萼木(Mycetia sienensis)微芽有菌土壤中發(fā)芽成苗大花蕙蘭(Cytobium)原球莖無菌條件下發(fā)芽石槲蘭(Dendrobium)原球莖無菌條件下發(fā)芽唐菖蒲(Gladiolus hortalans)球莖無菌條件下發(fā)芽香蕉(musa acuminata)微芽無菌條件下發(fā)芽楊樹(Popupus beijingy)芽無菌條件下發(fā)芽以體細胞胚為繁殖體的人工種子物種主要結(jié)果胡蘿卜(Daucus carota)有菌土壤中發(fā)芽成苗苜蓿(Medicago sativas)有菌條件下發(fā)芽成苗芹菜(Apium graveolens)有菌條件下發(fā)芽成苗柑橘(C. sinens

4、isC. reticulata)無菌條件下發(fā)芽成苗挪威云杉(Picea abies)無菌及有菌條件下發(fā)芽松樹(Pinus lambertiana,P. aeda)無菌及有菌條件下發(fā)芽玉米(Zea mays)無菌條件下發(fā)芽成苗雜交水稻(O. sativaO. lalifolia)無菌條件下發(fā)芽橡膠樹(Hevea brasiliensis)無菌條件下發(fā)芽西洋參(Panax quinquefolium)無菌條件下發(fā)芽刺五加(A. senticosus)無菌及有菌條件下成苗黃連(Coptis chinensis)無菌及有菌條件下成苗人工種子研制的意義人工種子結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運輸，可直接播種

5、，易于機械化操作；不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量多，繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；有利于繁殖生育周期長、自交不親和、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無病毒材料;可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農(nóng)藥等成分，提高種子活力；體細胞胚由無性繁殖體系產(chǎn)生，可以固定雜種優(yōu)勢。繁殖體的培養(yǎng)技術(shù)人工種子技術(shù)人工種子對體細胞胚繁殖體的要求作為人工種子繁殖體的體細胞胚，其基本要求是要具有發(fā)育上的同步性（如何誘導），還必需滿足如下標準特征： 形態(tài)正常，具有完整的胚結(jié)構(gòu)。 與母體植物的基因型基本相同，特別是在 重要經(jīng)濟性狀和農(nóng)藝性狀上沒有變異。 具有較好的成熟性，能耐一定程度的脫水。其次，作為實用化的體細胞胚種子

6、還必須滿足一定的數(shù)量需求，規(guī)模化生產(chǎn)是其基本前提。Choi等（2002）建立了人參體細胞胚大規(guī)模液體培養(yǎng)體系，每500ml容器可生產(chǎn)體細胞胚12,000個。在體細胞發(fā)育至子葉期早期，將期轉(zhuǎn)入1/2MS無機鹽加9蔗糖的培養(yǎng)基中誘導，獲得了良好效果。微型營養(yǎng)器官繁殖體的培養(yǎng)溫度 馬鈴薯18-20光照 馬鈴薯短培養(yǎng)基滲透壓 馬鈴薯8蔗糖激素 與內(nèi)源激素水平變化和平衡有關(guān)地黃根莖半夏塊莖馬鈴薯塊莖芽繁殖體的培養(yǎng) 大多數(shù)情況下，微芽、不定芽的培養(yǎng)往往直接從外植體上直接誘導形成，培養(yǎng)方式簡單，且勿需高濃度的激素處理，因此所產(chǎn)生的繁殖體基本保持了原有植物的品種特性。 根據(jù)植物類型不同，可選擇不同的外植體作為

7、芽發(fā)生的來源:非洲紫羅蘭一般選用葉片為外植體，誘導不定芽作為微繁殖體；榆樹類植物則可選根作為外植體產(chǎn)生微芽；石竹類花卉可以莖尖為外植體培養(yǎng)側(cè)芽作為繁殖體部分植物繁殖體誘導培養(yǎng)條件種類繁殖體程序及時間培養(yǎng)基和蔗糖(g/L)激素濃度 (mg/L)其它(mg/L)2,4-DNAAZTBAKT芥菜型油菜體細胞胚Step I 21MS, 302.11.01.0LH, 100Step II 21MS, 300.10.06-0.21.00.5LH, 100微芽21MS, 305.0桉樹體細胞胚Step I 20B5, 40-502.0-4.01.0Ade, 40Step II28-56改良H, 300.2-

8、0.50.5Ade, 40微芽25改良H, 300.2-0.50.5-2.0蘭花原球莖25MS, 200.1椰子汁LH，水解乳蛋白Ade，腺嘌呤繁殖體的包埋繁殖體的預處理體細胞胚的后熟培養(yǎng)與脫水干燥 微型器官繁殖體適度脫水與表面消毒處理以及必要時的強制休眠處理人工種皮分內(nèi)種皮和外種皮對人工種皮的要求：具有保護胚的功能，并且無毒性、通氣好、抗污染、抗壓性好、不粘連、適于貯藏和運輸。內(nèi)種皮：聚氧乙烯、海藻酸鈉、明膠、瓊脂等。外種皮常用材料： Elvax 4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，1987，美國)涂膜，價高，操作復雜，效果不佳。 Tullanox和Cab-0-sil(二氧化硅化合物）

9、，以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在材料中滾動即可。 硅酮種衣，能抗真菌，滲入水蒸汽和氧氣，處于試驗之中。人工胚乳成分：無機鹽混合物、碳水化合物（糖和淀粉）、蛋白質(zhì)。糖分存在容易導致微生物感染而腐爛，所以人工胚乳中也要加入防腐劑、抗菌素、農(nóng)藥等。人工胚乳添加的兩條途徑： 直接法 微型包裹法包埋技術(shù)干燥法 聚氧乙烯干燥法包埋是最早的人工種子包埋技術(shù)，即將胚狀體置于23、相對濕度70%的黑暗條件下逐漸干燥，然后用聚氧乙烯包裹胚狀體。液膠包埋法 胚狀體不經(jīng)干燥包埋，直接與流體膠混合后播入土中。應用此法，胚成活率低，常因干燥而死亡。包埋技術(shù)水凝膠法 是最常用的一種方法。即用海藻酸鈉等水

10、溶性凝膠經(jīng)與鈣離子進行離子交換后凝固，用于包埋單個胚狀體。種子硬度由凝膠濃度與絡合物離子交換時間決定。CaCl2濃度：2.0%-2.5%離子交換時間：20min-30min無菌水漂洗20minFlash植物人工種子的成苗率繁殖體海藻酸鈉(%)培養(yǎng)基及蔗糖濃度激素(mg/L)成苗率(%)四會貢柑體細胞胚3MT，4GA(1), IBA(0.25)30-70(無菌)唐菖蒲小球莖4-5MS, 1.5%IBA(0.5), GA(0.1)93熱帶蘭花球莖4改良MS, 3%NAA(1.0),BA(0.2)95赤桉微芽4改良SH, 3%NAA(0.2-0.5)80-90貯藏貯藏條件：47低溫、相對濕度小于67

11、%貯藏中存在的問題： 種胚質(zhì)量不高、后期停止生長、胚腐爛、種子失水干縮等。解決措施： 胚乳中添加防腐劑、抗生素、控制糖含量、低溫貯藏，種皮外包裹滑石粉、液體石蠟等成分。人工種子可能最先用于無性繁殖植物微芽，試管塊莖、鱗莖等作繁殖體時，成苗率高且出苗整齊，具有田間應用的可行性，同時，離體培養(yǎng)的繁殖體可完全去除病原物。傳統(tǒng)上的試苗由于體積大、對攜帶儲運條件要求苛刻因而限制了使用規(guī)模。如果利用人工種子將可能首先實現(xiàn)無性繁殖植物種子生產(chǎn)的徹底革命。 1. 以微芽為繁殖體的人工種子技術(shù)，有可能首先在無性繁殖的果樹、花卉、林木等植物中得以應用。人工種子的發(fā)展和應用前景人工種子的發(fā)展和應用前景2. 微器官人

12、工種子可用于天然種子繁殖后代群體變異大的植物有些植物如桉樹，雖然能夠用天然種子繁殖，但種子繁殖的植株變異大，樹體不整齊。微芽試管苗繁殖技術(shù)已在生產(chǎn)上顯示了樹體整齊的優(yōu)越性，目前以微芽為繁殖體的人工種子技術(shù)已經(jīng)建立。桉樹人工種子在土壤中的成苗率已可達80%以上，且樹體十分整齊。 以體細胞胚為繁殖體應用的局限性及可能性以花或果實為經(jīng)濟產(chǎn)品的多年生植物如果樹有可能出現(xiàn)較長的幼年期，使開花結(jié)果推遲，且還可能出現(xiàn)果實不整齊的現(xiàn)象。以營養(yǎng)器官或木材為產(chǎn)品的植物中，對性狀一致性要求不嚴格的植物中，體細胞胚繁殖體具有其它繁殖體不可替代的優(yōu)越性。人工種子的發(fā)展和應用前景人工種子的發(fā)展和應用前景以體細胞胚為繁殖體

13、應用的局限性及可能性容易建立生產(chǎn)工藝，已經(jīng)具備高質(zhì)量的體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系的植物，如苜蓿、胡蘿卜等。不具備或不完全具備高質(zhì)量體細胞胚胎發(fā)生體系，商品價值較高，但許多種類育性不佳，繁殖困難，或者生產(chǎn)雜種費用昂貴。比較容易建立生產(chǎn)工藝，具備完善的胚胎發(fā)生技術(shù)體系，經(jīng)濟價值也很高。咖啡、玉米等。存在問題許多重要的植物目前還不能靠組織培養(yǎng)快速產(chǎn)生大量的、出苗整齊一致的、高質(zhì)量的體細胞胚或不定芽。包埋劑的選擇及制作工藝方面尚需改進，以提高體胚到正常植株的轉(zhuǎn)化率，并達到加工運輸方便、防干防腐耐貯藏的目的。如何進行大量制種和大田播種，實現(xiàn)機械化操作等方面配套技術(shù)尚需進一步研究。 小結(jié)人工種子是在實驗室人工

14、控制條件下生產(chǎn)的繁殖體。人工種子繁殖體包括體細胞胚、微型器官和微芽，根據(jù)植物種類不同可適當選擇。人工種子應用的基本條件是繁殖體的工廠化生產(chǎn)和配套技術(shù)的成熟。無性繁殖植物的人工種子有望最先得以應用。思考題人工種子的概念和類型。人工種子對體細胞胚繁殖體有什么要求？目前人工種子生產(chǎn)中需要解決的主要技術(shù)問題。目前人工種子最適于在哪些方面應用？植物離體培養(yǎng)脫毒技術(shù)病毒在植物體內(nèi)的分布及危害植物脫病毒方法脫毒植物檢測及保存病毒的特性及其對植物的危害大多數(shù)植物病毒不經(jīng)種子傳播；無性繁殖的植物，都易受到一種或多種病毒的侵染。植物種類染病毒種類植物種類染病毒種類菊花康乃馨水仙月季葡萄無花果1911410265矮

15、牽牛馬鈴薯大蒜蘋果草莓桃51724362423蘋果銹果病薄荷病毒病病郁金香雜色花郁金香正?；ú《驹谥参矬w內(nèi)的分布病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性，隨植株不同部位和年齡而異。老葉和成熟組織及器官中病毒含量較高根尖、莖尖生長點約0.11mm區(qū)域內(nèi)，幾乎不含病毒。 （原因？） （原因：分生組織細胞分裂和生長速度快，而病毒在植物體細胞內(nèi)繁殖速度相對較慢；另外，病毒是通過篩管組織或胞間聯(lián)絲傳播至其他組織細胞的，而莖尖分生組織無分化，沒有維管組織。）病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性的理論假說(1) 能量競爭 病毒核酸和植物細胞分裂時DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生組織細胞本身很活躍，其DNA合成是自

16、我提供能量自我復制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量來自我復制，因而就得不到足夠的能量，從而就抑制了病毒核酸的復制。(2) 傳導抑制 病毒在植物體內(nèi)的傳播主要是通過維管束實現(xiàn)的，但在分生組織中，維管組織還不健全，從而抑制了病毒向分生組織的傳導。(3) 激素抑制 在分生組織中，生長素和細胞分裂素水平均很高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4) 酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系統(tǒng)在分生組織中缺乏或還沒建立，因而病毒無法在分生組織中復制。(5) 抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假說，認為在分生組織中存在有某種抑制因子。

17、植物脫病毒方法物理方法化學方法生物方法高溫處理莖尖培養(yǎng)微體嫁接珠心培養(yǎng)愈傷脫毒熱處理脫毒熱處理脫毒法原理熱處理不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或停止，而失去侵染能力；作為一種物理效應可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。熱處理脫毒法愈傷組織熱處理法從患病植株上取葉片（莖片、鱗片、花器等）進行離體培養(yǎng)，誘導形成愈傷組織，然后將愈傷組織反復繼代培養(yǎng)同時兼用熱處理。常用的溫度及處理時間 37 38（2、4或8周） 50（315min)熱空氣處理脫毒法將試驗母株在高溫生長室中生長一個階段，使其頂端分生組織和次生分生組織迅速生長，然后切取其莖尖分生組織進行

18、離體培養(yǎng)。生長室溫度（35 40）光照強度（300010000Lx)愈傷組織繼代兼熱處理鈍化TMV和CMV獲得煙草無病毒植株的效果繼代 無煙草花葉病毒(TMV) 無黃瓜花葉病毒(CMV) 次數(shù) 25 30 37 25 30 37 0 0/20 8/21 - - 1 0/20 0/20 0/20 5/18 4/19 10/21 2 0/20 0/20 0/20 8/20 10/20 11/20 3 0/20 0/20 8/20 10/20 8/20 11/20 4 0/20 0/20 5/20 5 4/20 1/20 5/20結(jié)論: 病毒種類不同,愈傷組織反復繼代兼熱處理的效果不同；TMV、CM

19、V均經(jīng)37熱處理，脫毒效果最好。其它效果香石竹（康乃馨）在3840下經(jīng)兩個月處理可除去全部病毒。馬鈴薯在37下處理1020天能除去卷葉病毒。熱處理脫毒法優(yōu)點方法簡單，效果明顯。缺點具有局限性，不能去除所有病毒。只對圓形病毒（蘋果花葉病毒），或?qū)€狀病毒（馬鈴薯卷葉病毒）有效；而對桿狀病毒（千日紅病毒）無效。 極易使植物材料受熱枯死，造成損失莖尖培養(yǎng)脫毒法依據(jù)原理康乃馨不同大小莖尖與康乃馨斑駁病毒的脫毒效果莖尖大小(mm)培養(yǎng)數(shù)荊芥鑒定之病斑總病斑 接種葉數(shù) 平均病斑數(shù)/葉無病毒莖尖 數(shù)目 % 0.1 0.25 0.5 0.75 1.01.0 3 20 30 9 4 5 3 13 0.2 137

20、 61 2.2 1198 70 17.1 429 12 35.3 432 11 39.2 1972 20 98.6 2 66 8 40 4 13 1 11 0 0 0 0影響莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的因素母體材料病毒侵染的程度外植體的生理狀態(tài)起始培養(yǎng)的莖尖大小莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵 莖尖越小對培養(yǎng)基的要求越高，成功率越低。微體嫁接法(micrografting)應用微體嫁接的原因：木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根形成植株。具體做法：將極小的莖尖（0.14mm1.0mm）作為接穗嫁接到不帶病毒的種子實生苗砧木上，然后將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。優(yōu)點：接穗在砧木上易成活，故可用很小的莖尖來培養(yǎng)

21、，去除病毒幾率大，獲得無病毒苗的可能性大。蘋果莖陷病毒的莖尖培養(yǎng)脫毒接穗： 0.2mm莖尖砧木：無菌實生苗的胚軸（帶兩片子葉）方法：劈接法將接穗插入兩片子葉之間的組織中微體嫁接法(micrografting)脫除病毒的關(guān)鍵： 要求剝離技術(shù)很高 需要考慮砧木和接穗對營養(yǎng)組成的不同要求； 與接穗的取材季節(jié)有密切關(guān)系（蘋果46月取材嫁接成活率較高。）珠心組織培養(yǎng)脫毒法依據(jù)：病毒通過維管組織傳播，而珠心組織（孢子體部分）與維管組織沒有直接聯(lián)系，故可以通過珠心組織培養(yǎng)獲得無病毒植株。目前已用該方法去除了柑橘銀屑病、葉脈突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。該方法的缺點：存在20%30%左右的變異率，無病毒苗

22、苗期較長。柑橘要68年才能結(jié)果。胚珠愈傷組織培養(yǎng)脫毒法通過植物器官或組織誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再誘導分化芽，長成植株，可以獲得脫毒苗，這在天竺葵、馬鈴薯、大蒜、草莓、枸杞等植物上已先后獲得成功。利用誘導各器官愈傷組織培育無病毒苗的機制，可能有如下幾種： （a）病毒在植株體內(nèi)不同器官或組織分布不均 （b）病毒復制能力衰退或丟失； （c）繼代培養(yǎng)的愈傷組織抗性變異。 檢測方法血清鑒定法生物鑒定法分子檢測法電鏡鑒定法直接觀察幾種馬鈴薯病毒病的癥狀血清鑒定法(serologic test)實驗依據(jù)：沉淀反應植物病毒“抗血清”在植物病毒診斷中優(yōu)點：病毒抗血清具有高度?；裕簩Ｒ恍?；“預見性”；定量性。病毒抗血清在診斷上的局限性：不是所有病毒都能制成抗血清能夠提純的病毒量太少，或在提純過程中喪失了必備的抗原結(jié)構(gòu)；植物體內(nèi)的單寧物質(zhì)使病毒喪失了抗原性質(zhì)。血清鑒定法基本方法：玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集試驗 試管沉淀反應 免疫雙擴散ELISA病毒感染人工注射