基因工程技術(shù)

1、關(guān)于基因工程技術(shù)第一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 一 概述 基因工程技術(shù)使很多自然界很難或不能獲得的蛋白得以大規(guī)模合成.80年代以來,表達真核cDNA,細菌毒素和病毒抗原基因等,為人類獲取大量醫(yī)用價值的多肽蛋白開辟了新途徑. 基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點:生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽,胰島素,干擾素等,細胞因子等; 可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì);發(fā)現(xiàn)更多內(nèi)源生理活性物質(zhì);定向改變內(nèi)源生理活性物質(zhì);獲得新化合物,擴大藥物來源 .第二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 重組DNA技術(shù)也稱為分子克隆技術(shù)。 供體、受體、載體是其三大基本元件。 基因工程: 利用重組

2、技術(shù)，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對各種生物的核酸（基因）進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入微生物或真核細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類需要的基因產(chǎn)物，或者改造、創(chuàng)造新的生物類型。 是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用. 包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。 上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）； 下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。 第三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 從實質(zhì)上講，基因工程的定義強調(diào)了外源DNA分子的新組合被引入到一種新的寄主生物中進行繁殖。 這種DNA分子的新組合是

3、按工程學(xué)的方法進行設(shè)計和操作的，這就賦予基因工程跨越天然物種屏障的能力，克服了固有的生物種間限制，擴大和帶來了定向創(chuàng)造生物的可能性，這是基因工程的最大特點。 基因工程要素：包括外源DNA，載體分子，工具酶和受體細胞等。 第四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 一個完整的、用于生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：（1）外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。此工作是整個基因工程的基礎(chǔ)，又稱為基因工程的上游部分；（2）適合轉(zhuǎn)移、表達載體的構(gòu)建或目標基因的表達調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；（3）外源基因的導(dǎo)入；（4）外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選；（5）

4、外源基因表達產(chǎn)物的生理功能的核實；（6）轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立，以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析；（7）生態(tài)與進化安全保障機制的建立；（8）消費安全評價。 第五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二 基因工程誕生的理論依據(jù) （1） DNA是遺傳物質(zhì) 不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。地球上的一切生物，它們的基因都是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)都是一樣的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原則上是可以重組互換的。 （2） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半

5、保留復(fù)制機制。 （3）中心法則和遺傳密碼 遺傳密碼是通用的。一系列三聯(lián)密碼子（除極少數(shù)的幾個以外）同氨基酸之間的對應(yīng)關(guān)系，在所有生物中都是相同的?，F(xiàn)在，基因是可以人工會成的。 第六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）基因是可切割的 基因直線排列在DNA分子上。作為DNA分子上一個特定核苷酸序列的基因，允許一個一個完整地被切割下來。（5）基因是可以轉(zhuǎn)移的 發(fā)現(xiàn)有的基因可以在染色體DNA上移動，甚至可以在不同染色體間進行跳躍，插入到靶DNA分子之中。（6）多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系普遍認為，一種多肽就有一種相對應(yīng)的基因。因此，基因的轉(zhuǎn)移或重組可以根據(jù)其表達產(chǎn)物多肽的性質(zhì)來檢查。（7

6、）基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞經(jīng)重組的基因一般來說是能傳代的，可以獲得相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。 第七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程的研究內(nèi)容 1、基礎(chǔ)研究 基因工程問世以來，科技工作者始終十分重視基礎(chǔ)研究，包括構(gòu)建一系列克隆載體和相應(yīng)的表達系統(tǒng)，建立不同物種的基因組文庫和cDNA文庫，開發(fā)新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了豐碩的研究成果，使基因工程技術(shù)不斷趨向成熟。 第八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)、基因工程克隆載體的研究 基因工程的發(fā)展是與克隆載體構(gòu)建密切相關(guān)的，由于最早構(gòu)建和發(fā)展了用于原核生物的克隆載體，所以以原核生物為對象的基因工

7、程研究首先得以迅速發(fā)展。 Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)以及成功地構(gòu)建了Ti質(zhì)粒衍生的克隆載體后，植物基因工程研究隨之就迅速發(fā)展起來。 動物病毒克隆載體的構(gòu)建成功，使動物基因工程研究也有一定的進展?？梢哉J為構(gòu)建克隆載體是基因工程技術(shù)路線中的核心環(huán)節(jié)。 至今已構(gòu)建了數(shù)以千計的克隆載體。但是構(gòu)建新的克隆載體仍是今后研究的重要內(nèi)容之一。尤其是適合用于高等動植物轉(zhuǎn)基因的表達載體和定位整合載體還須大力發(fā)展。 第九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2)基因工程受體系統(tǒng)的研究 基因工程的受體與載體是一個系統(tǒng)的兩個方面。前者是克隆載體的宿主，是外源目的基因表達的場所。受體可以是單個細胞，也可以是組織、器官、甚

8、至是個體。用作基因工程的受體可分為兩類，即原核生物和真核生物。 原核生物大腸桿菌是早期被采用的最好受體系統(tǒng)，應(yīng)用技術(shù)成熟，幾乎是現(xiàn)有一切克隆載體的宿主； 酵母菌是較早被用作基因工程受體的真核生物。有人把酵母菌同大腸桿菌一起看作是第一代基因工程受體系統(tǒng)。 高等植物也已用作基因工程的受體，一般用其愈傷組織、細胞和原生質(zhì)體，也用部分組織和器官。 第十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 高等植物也已用作基因工程的受體，一般用其愈傷組織、細胞和原生質(zhì)體，也用部分組織和器官。目前用作基因工程受體的植物有雙子葉植物擬南芥、煙草、番茄、棉花等，單子葉植物水稻、玉米、小麥等，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。

9、 動物鑒于體細胞再分化能力差，目前主要以生殖細胞或胚細胞作為基因工程受體，獲得了轉(zhuǎn)基因鼠、魚、雞等動物。 第十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 (3)目的基因研究 基因是一種有限的戰(zhàn)略性資源。因此開發(fā)基因資源已成為發(fā)達國家之間激烈競爭的焦點之一，誰擁有基因?qū)＠啵l就在基因工程領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。 基因工程就是開發(fā)人們特殊需要的基因產(chǎn)物，這樣的基因統(tǒng)稱為目的基因。具有優(yōu)良性狀的基因理所當(dāng)然是目的基因。而致病基因在特定情況下也具有很大的開發(fā)價值。即使那些尚不清楚功能的基因，隨著研究的深入，也許以后成為具有很大開發(fā)價值的目的基因。 第十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月

10、獲得目的基因的途徑很多，主要是通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫，從中篩選出特殊需要的基因。 近年來也廣泛使用PCR技術(shù)直接從某生物基因組中擴增出需要的基因。 對于較小的目的基因也可用人工化學(xué)合成。 現(xiàn)在已獲得的目的基因大致可分為三大類： 第一類是與醫(yī)藥相關(guān)的基因； 第二類是抗病、蟲害和惡劣生境的基因； 第三類是編碼具特殊營養(yǎng)價值的蛋白或多肽的基因。 第十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 (4) 基因工程工具酶的研究 基因工程工具酶指體外進行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶等。 限制性核酸內(nèi)切酶用于有規(guī)律地切割

11、DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。現(xiàn)已從不同生物中發(fā)現(xiàn)和分離出上千種限制性核酸內(nèi)切酶，基本上可滿足按不同目的切割各種DNA分子的需要。 耐熱性限制性核酸內(nèi)切酶和長識別序列稀切酶仍是當(dāng)前研究的熱門課題。 第十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 DNA連接酶用于連接各種DNA片段，使不同基因重組?，F(xiàn)在常用的DNA連接酶只有兩種，即大腸桿菌DNA連接酶和 T4 DNA連接酶。 DNA聚合酶用于人工合成連桿、引物等DNA小片段以及含基因的較大的DNA片段，還用于制備DNA探針。多種耐熱性DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，使使PCR技術(shù)迅速發(fā)展給當(dāng)今生命科學(xué)提供了先進的研究手段。第

12、十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 (5)基因工程新技術(shù)研究 圍繞外源基因?qū)耸荏w細胞，發(fā)展了一系列用于不同類型受體細胞的DNA轉(zhuǎn)化方法和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，特別是近年來研制的基因槍和電激儀克服了某些克隆載體應(yīng)用的物種局限性，提高了外源DNA轉(zhuǎn)化的效率。 圍繞基因的檢測方法，在放射性同位素標記探針的基礎(chǔ)上，近年來又發(fā)展了非放射性標記DNA探針技術(shù)和熒光探針技術(shù)，如生物素標記DNA探針、Dig標記DNA探針、熒光素標記DNA探針等。 第十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 PCR技術(shù)的發(fā)展提高了基因檢測的靈敏度，為分離基因提供了快速簡便的途徑。PCR技術(shù)自從1985年建立

13、以來，發(fā)展很快，除一般采用的常規(guī)PCR技術(shù)外還發(fā)展了多種特殊的PCR技術(shù)，如長片段PCR技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、免疫PCR技術(shù)、套式引物PCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、標記PCR技術(shù)、復(fù)合PCR技術(shù)、不對稱PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、錨定PCR技術(shù)、重組PCR技術(shù)、加端PCR技術(shù)等等。 凝膠電泳技術(shù)可以在凝膠板上把不同分子大小的DNA分子或DNA片段分開，但是只能分辨幾萬堿基的DNA分子或片段。脈沖電泳技術(shù)的問世，不僅能分開上百萬堿基的DNA分子或片段，而且能夠使完整的染色體彼此分開。 第十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2 應(yīng)用研究 基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)、農(nóng)、牧、漁等產(chǎn)業(yè)

14、，甚至與環(huán)境保護也有密切的關(guān)系。研究成果最顯著的是基因工程藥物，轉(zhuǎn)基因植物的研究也取得了喜人的成果。第十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用 應(yīng)用重組DNA技術(shù)培育具有改良性狀的糧食作物的工作已初見成效。 現(xiàn)在已經(jīng)培育成功了一批分別具有抗病、抗蟲和抗除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。 例如，應(yīng)用反義RNA技術(shù)培育成功的具有耐貯藏的轉(zhuǎn)基因西紅柿已開始在美國投放市場。 利用植物合成微生物甚至哺乳動物的一些特殊蛋白質(zhì)，例如干擾素、人血清蛋白等也已有些成功的報道。 從理論上講，在將來還有可能通過轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)更多的藥用蛋白質(zhì)。我們有理由相信，重組DNA技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，是具有光

15、輝的前景的。 第十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 重組DNA技術(shù)顯著特點:可以使一個生物獲得與之固有性狀完全無關(guān)的新功能，從而引起生物技術(shù)學(xué)發(fā)生革命性的變革，使人們可以在大雖擴增的細胞中生產(chǎn)哺乳動物的蛋白質(zhì)，其意義無疑是相當(dāng)重大的。 將控制這些藥物合成的目的基因克隆出來，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或其它生物體內(nèi)進行有效的表達，于是就可以方便地提取到大量的有用藥物。目前在這個領(lǐng)域中已經(jīng)取得了許多成功的事例，其中最突出的要數(shù)重組胰島素的生產(chǎn)。 第二十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月在醫(yī)藥業(yè)的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因細菌生產(chǎn)激素類藥物 轉(zhuǎn)基因細菌生產(chǎn)抗生素： 轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)疫苗： 在工業(yè)原

16、料生產(chǎn)上的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)高分子多聚物 轉(zhuǎn)基因微生物與環(huán)境凈化和廢料再生 第二十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 四 基因工程的安全性 1 基因工程的安全隱患 對環(huán)境的影響:重新組合一種在自然見尚未發(fā)現(xiàn)的的 生物性狀有可能給現(xiàn)有的生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。 新型病毒的出現(xiàn): 制造帶有抗生素抗性基因或有產(chǎn)生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人類或其它生物體內(nèi)傳播。 癌癥擴散: 將腫瘤病毒或其它動物病毒的DNA引入細菌有可能擴大癌癥的發(fā)生范圍。 人造生物擴散: 新組成的重組DNA生物體的意外擴散可能會出現(xiàn)不同程度的潛在危險。 第二十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月

17、 2 控制措施 對轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。 物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環(huán)境里去。這種措施只能用于控制在實驗室里的轉(zhuǎn)基因生物，而且用于控制轉(zhuǎn)基因微生物和通過花粉進行擴散的植物的效力實際上是非常有限的。 當(dāng)轉(zhuǎn)基因動、植物必須用于開放的環(huán)境里生產(chǎn)時，物理控制的方法便不再有實際的意義。 第二十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 根本性的措施還是生物學(xué)的控制方法。 即造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離。如利用三倍體不育的特性，將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物或植物成為三倍體，這樣，轉(zhuǎn)基因生物在進入到自然環(huán)境里

18、后就不可能自行繁殖，因此也就不可能對生態(tài)系統(tǒng) 造成長期的影響。 也可以利用生理學(xué)原理，如激素誘導(dǎo)等方法使轉(zhuǎn)基因生物不育等。第二十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1 什么是基因工程技術(shù)? 2 基因工程基礎(chǔ)研究的有哪些內(nèi)容?第二十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)及其應(yīng)用第二十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例第二十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出

19、的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。第二十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（I II III）拓撲異構(gòu)酶解旋酶類SSB 引物dNTP Mg2+5 3第二十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第三十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Taq DNA聚合酶（水生棲熱菌(Thurmus aquaticus，簡稱Taq) )酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60

20、40 20耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。第三十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)循環(huán)729455PCR循環(huán)變性退火延伸第三十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 PCR的指數(shù)擴增（2n）引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火第三十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1 P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔助因子：Mg2+第

21、三十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 DNA模板一般100ng /100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 PCR反應(yīng)條件第三十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第三十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）dNTP dNTP濃度取決于

22、擴增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。第三十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第三十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 9

23、4， 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。第四十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加第四十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)的特點1 ）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍第四十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2）特異性引物引物 引物的序列及其與模板

24、結(jié)合的特異性是決定PCR反 應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和 特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。第四十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源 序列。（2）引物長度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴格限制。第四十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）操作簡便易行 利用PCR擴增,只需要數(shù)小時,就可以擴增出 可用電泳法檢出的DNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷

25、貝的模板序列。 第四十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1）不對稱PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針； 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 PCR的類型第四十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 高濃度引物低濃度引物第四十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2)反向PCR (reverse PCR) 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增

26、。 未知序列未知序列已知序列第四十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第四十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第五十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳引物12341234第五十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對引物進行標記, 用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分第五十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月標記

27、引物觀察PCR產(chǎn)物第五十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5）錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴增第五十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC 錨定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC第五十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作第五十六張，PPT共一百七十二

28、頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月7）原位 原位聚合酶鏈式反應(yīng)（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。第五十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟1. 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2. PCR擴增細胞內(nèi)目

29、的片段3. 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達第五十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月8）逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第六十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9) 熒光定量 PCR（real-time PCR) 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標 記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplif

30、luor (Intergen)第六十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green I 第六十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 實時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀第六十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR示例一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)。第六十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T 質(zhì)粒DNA2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR反應(yīng)緩沖液 25m

31、mol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2二、實驗材料、儀器和試劑第六十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水補充至 25.0 L三、操作步驟第六十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻：

32、10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水補充至 25.0 L三、操作步驟第六十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳緩沖液按比例混勻,上樣電泳。三、操作步驟瓊脂糖凝膠電泳第六十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月The End！第七十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十一

33、張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月分子雜交技術(shù) 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。 第七十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一. 分子雜交種類 1. 按其分子種類劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2） RNA雜交探針為DNA或cDNA3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體第七十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 按樣品制備過程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization) i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細胞雜交 iv. 原位組織塊雜交

34、原位裂解細胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測某類細胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。2）斑點雜交(dot hybridization) 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進行雜交，不能測定分子量大小。第七十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blotting hybridization) 先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴散法 ii. 毛細管法 iii. 電

35、泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移法 4) 夾心雜交法(sandwich hybridization)它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ng的DNA樣品第七十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 分子雜交的一般程序 1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應(yīng)洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反

36、應(yīng)洗滌顯色反應(yīng)（EIA） 或 一抗放射標記物洗滌放射自顯影（RIA）二. 雜交樣品膜的制備 1. 固定基質(zhì)的種類與特性 1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可與三類大分子的結(jié)合，其機理不清楚，可能為被動吸附。NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（20,000）第七十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：i. 用于DNA，RNA雜交分析時結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預(yù)激活；易于操作 缺點： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次） 2）重氮

37、化紙：DBM紙與DPT纖維素紙 最大特點是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價結(jié)合，可用不同探針進行多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時最好用放射性標記物。這類基質(zhì)對生物大分子是主動吸附。 3) 尼龍膜 i. 陽離子尼龍膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）第七十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 i) 容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白質(zhì)。 iii) 韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進行反復(fù)多次雜交試驗 vi) 廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直

38、接染色。 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時陽離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時要注意。 4）離子膜 i. DEAE-纖維素紙(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制備回收) ii. CM-纖維素紙 (可用于堿性蛋白質(zhì)的結(jié)合)第七十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 固定基質(zhì)的選擇依據(jù) 1）強度，耐久性，操作簡便 2）高信噪比（低本底高信號） 3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4）重現(xiàn)性好3. 各種雜交樣品膜的制備 1）原位雜交樣品膜的制備 i. 原位菌落雜交樣品膜第七十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 i) 細胞培養(yǎng)

39、（高密度，幾百十萬個菌落或低密度，幾百個以下） ii) 細菌細胞原位裂解與DNA變性 ii. 原位噬菌斑雜交樣品膜 i) 細胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌體轉(zhuǎn)移用NCF作影印 iii) DNA變性與固定（與上同）第八十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2） 斑點雜交樣品膜的制備 制備樣品點樣固定（可用斑點雜交儀或直接點樣）3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 擴散法（Difusion blotting method ) 第八十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 ii. 毛細管法 (Capillary blotting method )

40、 Southern印跡第八十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月iii. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting )iv. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的速度和厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時，真空法比毛細管法快13倍，其損失僅6%，而毛細管法損失率20%。第八十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴散法為70%，毛細管法80%）耗時多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴。 iii) 真空轉(zhuǎn)移

41、法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條件 i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移對于分子量較大的DNA片段，必須進行原位斷裂后再進行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長度為1-2kb。第八十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 其步驟是： 0.25M HCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）水洗0.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次15分鐘轉(zhuǎn)移。 對于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。三. 標記探針的制備 1. 標記化合物的種類

42、 1）放射性同位素標記物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標記；32P，3H，35S用于核酸標記，其中32P和35S使用頻率高。32P標記核苷酸的位或位，35S則是標記核苷酸的位.第八十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2) 非放射性標記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個抗生物素蛋白可結(jié)合4個生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標記化合物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗

43、原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。第八十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 iii. 蛋白質(zhì)檢測標記物 i) 酶偶聯(lián)二抗（0.05ng） ii) 蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）?？勺饔糜诖蠖鄶?shù)哺乳動物的IgG，靈敏度較低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng3) 兩類標記化合物的比較 i. 靈敏度 i ) 檢測蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。 ii) 檢測核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在4保存一年，放射性標記需每次制備。 iii. 安全性 非放射性標記安全。

44、 iv. 效率 非放射性標記所需時間短。第八十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 標記探針的制備 1）鏈標記法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（標記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待標記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P) SP6聚合酶RNA（標記）v. 引物延伸法 含待標記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32

45、P)待標記DNA鏈第八十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 無dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和標記核苷酸新合成鏈（32P） 2) 末端標記 i. 5-末端標記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應(yīng) (CIP) T4DNA激酶(-32P )ATP ii. 3-末端標記 i) TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNAii) 補齊反應(yīng)第八十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 iii) T4 RNA連接酶反應(yīng) RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 標記化合

46、物的純化 i. 柱層析 利用Sephadex G-50，前峰-標記物，后峰-核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡便, 可同時純化多個樣品。 四. 分子雜交與結(jié)果檢測 1. 核酸雜交與結(jié)果檢測 1）預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。 2）雜交：探針100變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42一天第九十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）洗滌：2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算： T=4G

47、C+2AT * 高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強度以及雜交和洗滌時的溫度。4）放射自顯影或顯色反應(yīng) 使用放射性同位素標記物，采用放射自顯影。若采用非放射性同位素標記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。第九十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-

48、氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點。 iii. 兩種酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個小時，其顯色結(jié)果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果2. 蛋白質(zhì)的免疫分析 封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。第九十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月雜交結(jié)果示意圖第九十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 核酸序列的測定第九十五張，PPT共一百七十二頁

49、，創(chuàng)作于2022年6月一. DNA的核苷酸序列分析 1. 種類 1) 酶法 i. 加減法 ss單-DNA與引物退火加入4種dNTP和DNA聚合酶分離純化ds-DNA加減法定序系統(tǒng)測序。 加法系統(tǒng)：ds-DNA 4份，每份中加入一種脫氧核苷酸和DNA聚合酶。 減法系統(tǒng)；ds-DNA 4份，每份加入三種脫氧核苷酸和DNA聚合酶。 該法操作復(fù)雜，讀序較難，但其前半部反應(yīng)可在其他定序方法中用于序列延伸。 第九十六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 ii. 雙脫氧核苷酸鏈終止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸

50、那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。第九十七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個反應(yīng)系統(tǒng)每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影。 該法也適合mRNA的序列分析。 GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥

51、苷可解決GC富集區(qū)的測序。 2) 化學(xué)法 原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生堿基脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列。第九十九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 i. 嘌呤（A和G）序列測定 硫酸二甲酯處理DNA鏈時，G的7位和A的3位氮原子被甲基化，甲基化后的嘌呤環(huán)可被哌啶取代，從而導(dǎo)致鏈斷裂。由于G比A 更易甲基化（5倍），且mG比mA更不穩(wěn)定，因而易發(fā)生鏈斷裂。控制好反應(yīng)溫度與時間，只使G反應(yīng)而A不反應(yīng)，從而可測出G序列。 若用甲酯代替硫酸二甲酯，A與G均會發(fā)生反應(yīng)。比較兩反應(yīng)系統(tǒng)電泳結(jié)果，就可知道A的序

52、列。 ii. 嘧啶（C和T）序列的測定 用肼處理ss-DNA時，可使嘧啶開環(huán)，被哌啶取代后而導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂。若反應(yīng)在高鹽濃度下進行，T與肼的反應(yīng)受抑制，因而可測得C的序列，比較加鹽與不加鹽反應(yīng)的結(jié)果，就可測定T的序列。 該法的一大優(yōu)點是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待測DNA鏈的檢測用32p末端標記。第一百張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月哌啶硫酸二甲酯甲基化第一百零一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月肼哌啶第一百零二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. DNA定序的一般程序 酶法測序(San

53、ger) 化學(xué)測序法(Maxam-Gilbert) 待測DNA片段 待測DNA片段 次克隆 5-末端標記 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 模板增殖與純化 純化標記的ss-DNA 與引物退火 定序反應(yīng) 定序反應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 真空干燥 放射自顯影 閱讀序列和計算機錄入 核苷酸序列的分析與比較第一百零四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 兩種定序方法的比較 1) 化學(xué)法 i. 優(yōu)點: 所有片段具有相同的標記強度；一次可以讀出250-400個核苷酸；定序分析不需要次克??；不受二級結(jié)構(gòu)區(qū)的影響；多A區(qū)定序清楚；適合500bp或以下DNA片段的定序分析。 ii. 缺點: 需限制酶圖

54、；需放射自顯影時間較長和增感屏；DNA片段需經(jīng)凝膠純化； 多嘧啶區(qū)定序不夠清楚；所用試劑為誘變劑和致癌物質(zhì)。 2) 酶法 i.優(yōu)點: 反應(yīng)簡單，易于操作；具有配套載體和宿主菌；不一定需要詳盡的限制酶圖；可采用多種方法進行次克隆。 ii.缺點: DNA帶放射強度不均勻；下游堿基閱讀困難；需要大量的次克隆和鑒定工作；二級結(jié)構(gòu)區(qū)和多C區(qū)定序困難。 定序方法的選擇主要依據(jù)所需測序DNA長度，實驗?zāi)康牡取５谝话倭阄鍙?，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二. 酶法定序系統(tǒng) 1. 單鏈定序系統(tǒng) 1）M13mp 系列載體定序系統(tǒng) i. 從細菌細胞中獲得ds-DNA，以利待測DNA片段的重組，經(jīng)轉(zhuǎn)化進入

55、細胞； ii. 從培養(yǎng)液中可獲得病毒顆粒，從中提取ss-DNA用于測序，病毒顆粒經(jīng)感染將-DNA引入細胞； iii. 含有-半乳糖甘酶-鏈基因，易于重組子檢測； iv. 多克隆位點區(qū)有利于外源DNA插入，因配套載體的多克隆位點區(qū)方向相反，有利于待測DNA端靠近載體上的引物變性區(qū)； v. 各種引物易于獲得； vi.有與載體配套的各種宿主菌，如：E.coliJM系列，DH5F 等。 第一百零六張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2)噬粒載體定序系統(tǒng) 該系統(tǒng)具上述M13mp系統(tǒng)的特點外，它容納的外源DNA片段較長；直接在同一重組分子進行各種次克??；操作較簡單，同時亦可用于雙鏈定序。 與M

56、13mp系統(tǒng)相比較，噬粒載體系統(tǒng)有以下兩缺點： i. 形成單鏈時需輔助噬菌體，它亦可形成病毒顆粒； ii. 制備ss-DNA時需較大量培養(yǎng)液，而M13mp系列載體僅需 1.5ml培養(yǎng)液即可。 2. 雙鏈定序系統(tǒng) 任何一種質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體均可用于此目的，只要有適合的引物。該系統(tǒng)的一個最大優(yōu)點是操作簡單，可進行雙向定序，大大減少次克隆工作量。 與單鏈定序系統(tǒng)相比較，該系統(tǒng)每次可閱讀序列較少，反應(yīng)中其他干擾較多。第一百零七張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3測序引物，同位素和酶 1）引物 正向引物與反向引物：凡是含有LacZ基因失活的標記基因的各種載體，與多克隆位點區(qū)下游某序列可復(fù)性的

57、引物稱為正向引物（forward primer）；反之，位于多克隆位點區(qū)上游的引物稱之為反向引物（reversed primer） 當(dāng)使用噬粒載體定序時，一定要注意包裝入噬菌體中單鏈是+或-鏈，相應(yīng)引物只能選用一種。第一百零八張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2）同位素 如果是作鏈標記，常用的同位素是-32P-dATP或-35SdATP，其放射比活性較低。如果是做引物標記，則用-32PATP。 當(dāng)用PCR方法定序時，則常采用引物的5-端標記。 3）聚合酶 可用DNA polI K，TTDNA聚合酶，DNA定序酶，Tag DNA pol等。 除上述因素外，不同測序系統(tǒng)中使用的dNT

58、P/ddNTP比值對定序結(jié)果影響也很大。多克隆位點 第一百零九張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三. DNA序列的快速測定 快速測定DNA序列應(yīng)同時從以下兩方面考慮： i. 每次定序反應(yīng)的核苷酸序列可讀數(shù)盡可能大，可大大減輕次克隆 (模板)的工作量； ii. 提高次克隆效率，使一次反應(yīng)就能獲得所需的全部重組體，盡量減少重組子鑒定步驟。 1. 延伸DNA定序方法 ss-DNA模板與引物退火加入dNTP和DNApol反應(yīng)約5（室溫）分為4個反應(yīng)系統(tǒng)進行雙脫氧核苷酸定序（375分鐘）凝膠電泳放射自顯影讀序。 2. DNA片段的次克隆方法第一百一十張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年

59、6月2）雙向缺失法1）限制酶切法 必備條件：詳盡限制酶圖；各切點序列必須為另一次克隆片段測序時覆蓋。第一百一十一張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）單向缺失法4）鳥槍法（隨機片段法）第一百一十二張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 特殊缺失法 1）洪國藩法 2）郭禮和法第一百一十三張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3）單鏈缺失法 第一百一十四張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4.多引物測序4）直接順序缺失法第一百一十五張，PPT共一百七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四. DNA序列測定的自動化 1. DNA測序步驟與自動化 1）模板制備 可自動化 2）定序反應(yīng) 可自動化 3）凝膠電泳 自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。 4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入 可自動化 2.自動測序儀 Conney等人于1987年設(shè)計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。 紅色引物+T反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黃色引物+G反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP）