動物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白

1、關(guān)于動物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白第一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月思考要制備出我們想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得 常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性 基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選第三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得（1） 原代細(xì)胞是直接取自動物組織器官,經(jīng)過消化分離而獲得。用量大，浪費時間。常用的有：雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞等。NO.1第四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。 二倍體細(xì)胞有

2、正常細(xì)胞的特點： 染色體組型是2n核型； 貼壁依賴接觸抑制； 可傳代培養(yǎng)50代； 無致瘤性。第五張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點，而獲得無限增殖能力。 自發(fā) 人工誘變第六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性 W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。 核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME （Eagle Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2, 倍增時間為24h，有限壽命50代。 安全，用于制備疫苗。NO.2第七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月MRC-

3、5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。 核型為2n=46。 屬成纖維細(xì)胞。 有限壽命4246代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。第八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。第九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎

4、牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。第十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選NO.3真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：1） 病毒載體 牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、 桿狀病毒2） 質(zhì)粒載體第十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 1） 病毒載體 牛痘病毒：用構(gòu)建多價疫苗 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療。 桿狀病毒：用于外源基因表達(dá)。第十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2）質(zhì)粒載體 在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)都能擴增。都含有如下基本成分： 允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。 含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。 能用以篩選出

5、外源基因已整合的選擇標(biāo)記。 有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。第十三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選第十四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1） 基因載體的導(dǎo)入基因載體導(dǎo)入動物細(xì)胞最常用方法是： 磷酸鈣沉淀法 電穿孔法 第十五張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸鈣沉淀， DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。第十六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月電穿孔法： 借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，

6、 使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔， 外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn) 化率較高，拷貝數(shù)低。第十七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月真核生物細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白優(yōu)點： 具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu),理化特性最接近于天然蛋白分子；具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；具有重組基因的高效擴增和表達(dá)能力；具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，表達(dá)水平較高；CHO（注射用重組人促紅素 ）細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離。因此，可以針對性的篩選細(xì)胞株第十八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 由于CHO-dh

7、fr-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)所抑制 ,用含有目的基因及與之相連的DHFR基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO dhfr細(xì)胞 ,利用濃度不斷提高的 MTX選擇抗MTX的細(xì)胞系 ,其中 DHFR基因及與之相連的目的基因一起擴增 ,從而使目的基因高水平表達(dá)。主要采用DHFR系統(tǒng)和GS 系統(tǒng) 2）高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選二氫葉酸還原酶系統(tǒng)DHFR第十九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于202

8、2年6月第二十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月DHFR擴增僅僅發(fā)生在二個等位基因中的一個。在穩(wěn)定系中擴增的基因得以保持，因為它們位于染色體上DHFR基因座上（均勻染色區(qū)），而其等位基仍保持正常的單拷貝。而在不穩(wěn)定系中當(dāng)選擇壓力消除時，擴增的基因至少會部分丟失，但未丟失的是以染色體外的方式（雙微體）存在。第二十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月每個雙微體帶有2-4 DHFR基因，雙微體可以復(fù)制，但它們沒有著絲粒，結(jié)果它們不能附著在有絲分裂的紡錘絲上，因此不能均等分離進(jìn)入子細(xì)胞，是染色體外的微小染色體。第二十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月谷氨酰胺合成酶在 ATP 水解提供能量時 ,利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺 ,在缺乏細(xì)胞外谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下 ,加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亞砜(methionine sulphoximine ,MSX) ,可使GS基因及與之相連的目的基因擴增 ,達(dá)到提高目的基因表達(dá)水平的目的。由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。主要哺乳細(xì)胞株為NS0細(xì)胞及CHO