實驗五質粒酶切質粒限制性內切酶消化酶切

1、關于實驗五質粒酶切質粒限制性內切酶消化酶切第一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月背景知識一、質粒圖譜的閱讀二、限制性內切酶第二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒） 第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。 Ampr 水解內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。 tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。 camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素失活。一、質粒圖譜的閱讀第三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三步：看

2、多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。 一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即：啟動子核糖體結合位點克隆位點轉錄終止信號。 這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體的?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。第四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月農桿菌復制起始位點大腸桿菌復制起始位點加尾信號，終止位點潮霉素抗性基因多克隆位點終止子加尾信號綠色熒光蛋白基因第五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、限制性內切

3、酶1) 概念2) 命名原則3) 類型4) 基本特性及用途5) 影響核酸限制性內切酶活性的因素6)限制性核酸內切酶操作的注意事項第六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1) 概念限制性核酸內切酶(restriction ednonuclease)是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內或附近特異切割雙鏈DNA的內切核酸酶（endonuclease)的總稱。 至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性內切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。第七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2) 命名原則1

4、973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎上進行了系統(tǒng)分類 限制性核酸內切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)。 第四個字母代表宿主菌的株或型(strain)。 若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。 屬名 種名 株系Haemophilus influenzae d 流感嗜血桿菌d株 Hind Hind同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶第八張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3) 類型 據(jù)限制性核

5、酸內切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型三類。第九張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4) 基本特性及用途 限制性核酸內切酶有嚴格的識別、切割順序，它以核酸內切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5端為P，3端為OH，識別序列一般為46個堿基對，通常是反轉錄重復順序，具有180的旋轉對稱性即迴文結構。限制性核酸內切酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口。 5粘性末端 3種切口 3粘性末端 平頭末端 第十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共

6、二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內切酶的主要用途 在特異位點上切割DNA，產生特異的限制性酶片段。 建立DNA分子的限制酶圖譜。 構建基因文庫。 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。 改建質粒。第十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5) 影響核酸限制性內切酶活性的因素 DNA樣品純度 DNA樣品甲基化程度 酶的星活性 (star activity)第十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 DNA樣品純度 A）樣品雜有RNA 雖不影響酶反應速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段電泳觀察。 B）少量的蛋白質污染 對

7、酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質污染時，會干擾酶切反應，并影響酶解產物。 C）樣品中雜有其他DNA 如質粒DNA中雜有染色體DNA，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應。 D）其他雜質 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會影響酶切速度，甚至改變酶的識別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。第十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 DNA樣品甲基化程度 限制性內切核酸酶的識別序列若被修飾酶產生了修飾反應，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一， DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真核生物中。 如：Acc識別序列能切割不能切割注

8、意此處的區(qū)別dam甲基化酶識別序列AccT CCGG AGAT CCGG 6mATC采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質粒DNA，可防止DNA的甲基化。第十七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶的星活性 (star activity)又稱第二活力，是指改變了酶切反應條件后特異序列識別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識別特異性的降低，可能對原識別序列相似的序列也產生切割反應。高濃度甘油、高pH、低離子強度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存在可能導致酶產生星活性。第十八張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月6) 限制性核酸內切酶操作的注意事項商品化的限制性核酸內切酶均為濃縮液，每次操作時

9、應使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時酶易產生星活性。整個操作應在0進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。當切割大量DNA時，通常采用延長反應時間，減少酶的用量。當DNA需2種或以上酶切時，應用通用緩沖液；若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產物，再進行下一個酶切反應。 第十九張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗目的）了解酶切原理，掌握酶切體系建立原則）用EcoR 切割質粒pCAMBIA13023）用EcoR 切割銀杏基因組DNA第二十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗原理限制性內切酶能特

10、異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。第二十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內切酶EcoR 特異性識別位點為：GATATC CTATAGGATATC CTATAG產生平末端：第二十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月則pCAMBIA1302經EcoR 酶切后產生大小分別為：1600bp、2624bp和6325bp的三條DNA 片段第二十三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組DNA中由于有較多的EcoR 識別位點，因此，經EcoR 酶切后產生大小不一的條帶，電泳后整個泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。酶切前的DNA酶

11、切后的DNA第二十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗材料和試劑實驗材料：質粒pCAMBIA1302 銀杏基因組DNA實驗試劑：EcoR 酶及其酶切緩沖液瓊脂糖(Agarose)、TAE電泳緩沖液等第二十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗儀器恒溫水浴鍋第二十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月質粒 （DNA）17.5L反應 10緩沖液2L19L0.5L酶液+用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底混勻反應體系后，37水浴保溫4-5h瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣10L電泳)EP管編號, 加樣實驗步驟第二十七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗注意事項限制性內切酶用量可按標準體系1g DNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。 酶切時所加的DN