瘧疾基因診斷技術

1、瘧疾基因診斷技術阮 衛(wèi)浙江省疾病預防控制中心1 瘧疾診斷是瘧疾控制的基礎，只有及時、準確地對瘧疾病例作出診斷，才能對瘧疾病例進行及時、正確、規(guī)范的治療。2瘧疾診斷包括： 1、臨床病例診斷 2、實驗室診斷 依據(jù)WHO的標準，實驗室診斷是瘧疾病例確診的基礎。3 第一部分 病原學診斷 （瘧原蟲顯微鏡血片檢查） 第二部分 免疫學診斷 （IFA、Opti-Mal試劑卡） 第三部分 基因診斷 （PCR） 4基因檢測技術 （一）特點1、高度敏感性：瘧原蟲基因檢測敏感性顯著高于瘧原蟲顯微鏡血片檢查和一些免疫診斷方法。2、高度特異性：瘧原蟲基因檢測特異性也顯著高于瘧原蟲顯微鏡血片檢查和免疫診斷方法。3、需較高的

2、實驗條件和技術：要有符合標準的實驗室，專門的PCR儀和有經驗的專業(yè)技術人員。5（二）應用范圍1、特殊病例樣本的檢測：（1）大批量低原蟲密度樣本的檢測（居民帶蟲調查）（2）混合感染樣本的檢測 (混合流行區(qū)瘧疾病例的確診）2、特殊情況下的瘧疾病例診斷：（1)非惡性瘧流行區(qū)輸入性重癥瘧疾例的確診（2）已用過藥物治療的瘧疾病例的確診3、特殊目的瘧疾病例的檢測（1） 抗藥性惡性瘧的檢測（2）瘧疾流行區(qū)傳染源的追蹤調查64、按蚊媒介中瘧原蟲的檢測 （1）按蚊媒介中不同瘧原蟲種的檢測 （2）按蚊媒介中間日瘧原蟲不同株的檢測5、媒介按蚊的基因檢測（1）不同媒介按蚊種群的基因檢測（2）同一媒介按蚊不同亞種、地理

3、株或基因型的基因檢測7（三）檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的 復合PCR技術 （用于混合感染樣本的瘧原蟲基因檢測）8 1.基本條件 PCR操作必須具備以下基本條件： 模板核酸，102105拷貝（DNA或RNA，但RNA的擴增需先逆轉錄成cDNA后才能進行） 特異性寡核苷酸引物，0.20.5 mol/L 9 2.02.5 U耐熱DNA聚合酶 4種0.2 mmol/L 的三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs) 合適的緩沖體系: 1050 mmol/L Tris-HCl(pH7.59.0),650 mmol/L KCl或(NH4)2SO4,1.55.0 mmoL/L MgCl2或MgSO4 溫度循環(huán)數(shù)(變性、復

4、性和延伸時的溫度與時間，以及循環(huán)數(shù))10濾紙血樣本 厚薄血片 PCR擴增（35 C）條件：94 45 S 55 45 S 72 60 S， Pf 206 bp 條帶Pv 370 bp 條帶 Pf / Pf 引物 2%瓊脂糖凝膠電泳 操作流程11PCR反應大致可分為下列步驟： 模板DNA變性：在9297的高溫加熱下,靶DNA變性,雙鏈解離為兩條單鏈,這兩條鏈均可成為雜交的模板 模板DNA與引物互補結合：按照堿基互補配對原則，設計并合成兩條與各自模板DNA雙鏈3端互補的寡核苷酸作為引物。模板DNA在高溫時解鏈，12當溫度降低時，兩條引物分別與變性后的正、負股DNA鏈互補結合。這一步驟溫度從3765

5、都有，由引物的堿基組成決定； 引物的延伸 結合于模板上的引物，在DNA聚合酶催化下，利用反應體系中的4種dNTPs為底物，按堿基互補的方式分別合成兩條新的DNA鏈；這一步通常在72進行。13（三）瘧原蟲DNA提取 酚-氯仿抽提是最早使用的經典方法，而且至今仍被廣泛應用。1.基本原理 首先洗滌和純化紅細胞，然后用去污劑溶解細胞膜，隨后利用一些有機溶劑以變性和沉淀蛋白質來分離去除蛋白。經過蛋白分離之后，溶液中含有核酸、鹽、多糖以及殘留的蛋白碎片。真核生物的核酸上緊密結合一些染色質蛋白，不易分離，可在有機溶劑進行蛋白變性之前加入蛋白酶K來消化這些蛋白質。14 2. 器材 離心機、恒溫水浴鍋、移液管、

6、凝膠電泳設備等。 3. 試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS），含0.05%(w/v)皂素的PBS，TE緩沖液（pH 7.6），硼酸鹽（TBE）緩沖液（pH 8.0），蛋白酶K（20mg/ml，TE緩沖液溶解，pH 8.0），十二烷基硫酸鈉（SDS，20（w/v），TE-飽和酚（pH 8.0），氯仿，3M 醋酸鈉（pH 4.5），乙醇（99和75），瓊脂糖，DNA分子標記物，溴化乙啶（EB），發(fā)熱患者血樣。15 4. 步驟 轉移血樣至一無菌試管中，800g， 離心5分鐘，沉淀紅細胞； 棄上清，加入5倍體積冰預冷的含0.05皂素的PBS，混勻并在冰上放置10分鐘，4000g，離心5分鐘，沉淀蟲體； 棄上清

7、，PBS洗滌沉淀2次，用1/100初始血樣體積的TE緩沖液重懸沉淀，加蛋白酶K至終濃度為20g/ml，加20 SDS至終濃度為0.5%。慢慢翻轉試管幾次，小心混勻，5665孵育212小時；16 加等體積TE飽和酚和等體積氯仿，翻轉試管約10分鐘，直至有機相和液相完全混勻，注意不要劇烈震蕩，15000g，離心10分鐘； 轉移上層的液相至一新管中，重復酚氯仿步驟，15000g，離心10分鐘； 轉移液相至一新管中，加等體積氯仿，小心混勻兩相5分鐘，15000g，離心5分鐘；17 轉移液相至一新管中，加1/10體積的3mol/L 醋酸鈉（pH 4.5）及2.5倍體積的99乙醇, 翻轉試管幾次使溶液完全

8、混合,-20放置不少于1小時，15000g，離心10分鐘； 棄上清，加500-1000l 70冰預冷酒精，快速混懸試管，15000g，離心10分鐘； 去上清，DNA沉淀空氣干燥片刻，TE溶解至濃度約為0.5-1mg/ml；0.5%瓊脂糖凝膠DNA的抽提效果； 獲得的DNA于-20儲存?zhèn)溆谩?8 5.注意事項 （1） 在瘧原蟲DNA提取過程中，要注意避免因剪切力引起的DNA斷裂，不要劇烈混勻或混懸樣品，用移液槍頭時應剪掉槍尖的頂部，用巴氏移液管時去掉移液管的尖細的末端。 （2） 有時很難全部吸出粘稠的液相，此時，寧可浪費部分DNA，也不要吸出液相與有機相交界面的任何物質，以免降低DNA的純度。

9、（3） 在DNA沉淀干燥步驟中，不要使其過于干燥，否則DNA沉淀很難溶解。19 如果在制備過程中獲得DNA樣品產量較高，可能需要花費較長時間溶解，不要通過反復抽吸或混懸來加速這一過程。把密閉的試管于65孵育過夜，DNA在這一溫度絕對安全，并能穩(wěn)定溶解。 如果從瘧疾病人血樣中提取DNA，人DNA的污染是不可避免的。對于PCR、DNA雜交等大多數(shù)應用來說，這種污染對結果不會有很大影響。但對有些應用，如建立瘧原蟲基因組文庫，這種污染的后果可能是很嚴重的。此時，可通過密度梯度離心等方法從血樣中分離淋巴細胞，以盡可能減少人DNA的含量。20 提取的DNA中可能含有一定數(shù)量的RNA，如果需要去除RNA的污

10、染，加無DNA酶的RNA酶A至終濃度為1mg/mL（溶于10mmol/Lol/L Tris-HCl, pH 8.0中），37孵育1-2小時，然后再重復前面所提到的酚抽提步驟。214.標準的PCR擴增程序為： 于0.5ml容量的微量離心管（或PCR反應管）中設置的反應混合物體系，依次加入：10PCR緩沖液（1/10體積），dNTPS各200 mol/L，引物各1mol/L，DNA模板102105拷貝，ddH2O補至終體積（50 l），混勻后離心15秒，使反應成分集于管底加石蠟油2050 l覆蓋于反應物表面以防蒸發(fā)；用有熱蓋的PCR儀，不用加石蠟油。置反應管于97，變性7分鐘（染色體DNA）或5分鐘（質粒DNA） 22置冰上冷卻，點動離心。加入13 U的TaqDNA聚合酶 于變性溫度下（94）使模板DNA變性一適當時間（12分鐘）在退火溫度下（5060）使引物與模板雜交（退火）一定時間（0.52分鐘） 在復性溫度下（72 ）使復性的引物延伸合適的時間（12分鐘） 重復46步驟2531次，每次即為一個PCR循環(huán) 用瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物23復合PCR擴增與結果分析 PCR反應體系Tris-HCl(10mM) 150MMgCl2(3mM) 150MdNTP 各 150MPF引物 0.25 MPV引物 1.5 MTaq