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1、等位基因特異性-PCR團結(jié)限定性內(nèi)切酶消化法檢測JAK2V617F突變申徐良陳方平魏武張梅香史文芝秦小琪徐嘹亮【摘要】目的:創(chuàng)立敏感特異的JAK2V617F點突變的臨床檢測要領(lǐng)。要領(lǐng):基因組DNA從HEL細胞或正常志愿者外周血中提齲接納等位基因特異性-PRAllelespeifi-PR,AS-PR和限定性內(nèi)切酶消化的要領(lǐng)檢測基因組中JAK2V617F突變。效果:本AS-PR法可對JAK2基因擴增出364bp的內(nèi)參照條帶,當存在JAK2V617F突變時,又可以擴增出203bp的突變條帶。只有野生型內(nèi)參照條帶364bp可被BsaX消化切割。結(jié)論:ASPR法和限定性內(nèi)切酶法是檢測JAK2V617F突

2、變的敏感特異的檢測要領(lǐng),可以樂成應(yīng)用于臨床檢測?!娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性-PR;JAK2V617F突變;限定性內(nèi)切酶BsaXAbstratbjetive:TestablishasensitiveandspeifitestfrJAK2V617Fpintutatin.ethds:GeniDNAasislatedfrHELellsrPeripheral-bldellsfrnralvlunteer.Allele-speifiplyerasehainreatins(AS-PR)andrestritinenzyedigestinereperfredtdetettheutatiningeniDNA.Resu

3、lts:Antrlband(364bp)anbebtainedbyAS-PR,andautedband(203bp)anbebtainednlyhenJAK2V617Faspresented.nlyildtypentrlband(364bp)anbedigestedbyrestritinenzyeBsaX.nlusin:AS-PRandrestritinenzyedigestineresensitiveandspeifitestsfrJAK2V617Fpintutatin,andanbesuessfullyusedfrlinialtest.KeyrdsAllelespeifi-PR;JAK2V

4、617Futatin;RestritinenzyeBsaXJAK2基因?qū)貸AKs(Januskinases/Justantherkinases)家屬成員,是胞漿非受體性酪氨酸激酶,在多種造血生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2022年,Baxter和Kralvus先后創(chuàng)造大部門骨髓增殖性疾病患者攜帶有一個得到性的JAK2基因突變-JAK2V617F,該基因突變位于JAK2基因第1849位,本來的鳥嘌呤G被胸腺嘧啶T所代替,導(dǎo)致原位于617位的纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸(GT,JAK2V617F)。該突變的陽性率在PV中高達65%97%、ET為23%57%和IF為35%57%,在AL/L中有少量

5、表達6。JAK2V617F基因突變的創(chuàng)造是比年來骨髓增殖性疾病發(fā)病機制的打破性希望,因此有學(xué)者將其稱為骨髓增殖性疾病的“JAK2期間。JAK2V617F的創(chuàng)造對付臨床上骨髓增殖性疾病的診斷和區(qū)分診斷有非常緊張的意義。為此,我們在臨床上創(chuàng)立了兩種敏感特異的JAK2V671F點突變的檢測要領(lǐng)等位基因特異性PR法Allelespeifi-PR,AS-PR和限定性內(nèi)切酶消化法。這兩種要領(lǐng)的應(yīng)用,有利于進步骨髓增殖性疾病的臨床診斷程度。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1細胞造就HEL細胞株購自中國科學(xué)院上??茖W(xué)研究院,造就于含10%胎牛血清(Hylne)、100U/L青霉素,100U/L鏈霉素的RPI1640(Gib)

6、造就基中,置于37、5%2、飽和濕度的造就箱中造就,每3d換液一次。待細胞生長至80%匯適時以13的比例傳代,取對數(shù)生恒久的細胞用作實行。1.2基因組DNA制備HEL細胞基因組和正凡人血液基因組DNA用血液基因組提取試劑盒上海生物工程公司產(chǎn)物提齲1.3AS-PR及產(chǎn)物闡發(fā)PR引物合成事情由北京奧科生物公司完成。各引物序列如下:公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3、野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3364bp、突變特異性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3203

7、bp。PR反響體系為50L,每管中參加80ngDNA模板,公用反向引物(10)1L,突變特異性正向引物(10)1L或野生型正向引物(10)1L,10XPR緩沖液5L,25gl23L,10dNTPs1L,5U/L的Taq聚合酶1L,末了用去離子水補足50L。置于JResearhPT-100基因擴增儀中按以下步伐擴增:先94變性11in,然后舉行擴增循環(huán),包羅變性40s94、退火1in54、和延伸1in72,擴增35循環(huán),末了72延伸10in。AS-PR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠含EB電泳斷定,應(yīng)用AlphaEaseF凝膠成像處置懲罰體系不雅察并闡發(fā)效果。BsaX限定性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)物。酶切反

8、響體系:PR產(chǎn)物20L,NEBBuffer44L,BsaX1L2U,去離子水15L,總體積40L,37溫育4h。酶切完畢后于2瓊脂糖凝膠中電泳不雅察效果。2效果HEL細胞株是人紅白血病細胞株,有學(xué)者6證明HEL細胞為JAK2V617F基因突變的純合子。因此,在本實行中我們以HEL細胞作為一個的含有JAK2V617F突變的的陽性標本,用于創(chuàng)立JAK2V617F突變的檢測要領(lǐng)。AS-PR歷程中野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3和公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3別離位于基因組上該突變位點的上游和卑劣,擴增產(chǎn)

9、物為364bp,該擴增作為AS-PR的陽性比較,用于查驗基因組DNA提取的質(zhì)量和PR體系的準確性。無論基因組中是否存在JAK2V617F突變,只要提取的基因組DNA完備,PR體系準確,這兩條引物都可以擴增出364bp的產(chǎn)物。突變特異性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3是針對突變位點方案的突變引物,該引物3端包羅2個錯配的核苷酸。當基因組中存在JAK2V617F突變時,該引物與公用反向引物(R1)可以擴增出203bp的產(chǎn)物,當基因組中不存在JAK2V617F突變時PR不克不及擴增。圖1為AS-PR的效果,在該圖中可以看到野生型正向引物(F1)和公用

10、反向引物(R1)擴增出的條帶位于300bp和400bp之間364bp,同時突變特異性正向引物(F2)與公用反向引物也擴增出一條清楚銳利的條帶,巨細為200bp擺布203bp。2.2BsaX酶切闡發(fā)限定性內(nèi)切酶法所接納的限定性內(nèi)切酶是BsaX。BsaX識別序列為:5-NNNNNNNGGAGNNNNNGTNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNN-5在我們擴增的364bp的AS-PR產(chǎn)物中該酶的識別序列為:5-AAATTATGGAGTATGTGTTGTGGAGAGA-33-AAATTTAATATATAAAGAATT-5BsaX可將野生型的364bp的PR產(chǎn)

11、物切割為174bp,160bp,30bp三個片斷。在2的瓊脂糖凝膠中30bp的片斷區(qū)分不清,174bp產(chǎn)物和160bp的產(chǎn)物難以分開而聚攏成一條帶圖2,lane1。起首用野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)對HEL細胞的基因組DNA舉行擴增,得到364bp的擴增產(chǎn)物,然后將該產(chǎn)物用BsaX切割,電泳效果如圖2所示:正凡人的比較PR產(chǎn)物被切割為174bp和160bp的兩個片斷,而HEL細胞的PR產(chǎn)物不克不及被切割。3討論可以檢測JAK2V617F點突變的要領(lǐng)許多,比方,AS-PR法,限定性內(nèi)切酶消化法和直接測序法等,差異的要擁有差異的特點和良好性。等位基因特異性PR最大的長處是敏感性高,

12、只必要少少量的模板DNA便可以得到很好的效果。限定性內(nèi)切酶要領(lǐng)的檢測敏感性不及AS-PR法,其長處在于輕便易行,消耗不高,而且可以作為一個高通量挑選的要領(lǐng)。測序法固然可以或許提供應(yīng)我們正確的序列信息,但是由于色譜圖配景的影響其敏感性有限。而且該要領(lǐng)耗時耗力,消耗比力高,必要一些特別的儀器裝備,在臨床檢測方面的應(yīng)用照舊有必然的困難。其他檢測要領(lǐng)如及時定量PR法和DNA融解曲線闡發(fā)法焦磷酸測序法和質(zhì)譜法等,利用者較少。我們以HEL細胞系作為JAK2V617F突變的陽性比較,應(yīng)用突變特異性引物(F2)(3端包羅2個錯配的核苷酸,使得野生型JAK2的難以擴增)對突變基因舉行擴增,此后我們又對突變DNA序列舉行了限定性內(nèi)切酶闡發(fā),表白這兩種要領(lǐng)比力敏感而且特異性強。我們的履歷提示:在一樣平常環(huán)境下,80ng基因組DNA經(jīng)35個循環(huán)擴增后就可以看到顯著的條帶。假設(shè)參加模板太多,大概會擴增出一些與目的條帶分子量差異的非特異條帶,而小于40ng的基因組DNA那么必要增長循環(huán)(大概增長假陽性率)才氣檢測到;退火溫度的選擇對付實行的樂成黑白常緊張的,58是比力相宜的退火溫度。假設(shè)退火溫度高于60時突變特異性引物(F2)將不克不及擴增出顯著的條帶

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